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1、(10)申请公布号 CN 102247350 A (43)申请公布日 2011.11.23 CN 102247350 A *CN102247350A* (21)申请号 201110132949.3 (22)申请日 2011.05.23 A61K 31/35(2006.01) A61P 37/02(2006.01) A61P 25/00(2006.01) A61P 31/00(2006.01) A61P 29/00(2006.01) (71)申请人 上海交通大学医学院附属瑞金医院 地址 200025 上海市卢湾区瑞金二路 197 号 (72)发明人 陈赛娟 陈竺 卢瑛 陈冰 宋君红 王佰言 (7。
2、4)专利代理机构 上海卓阳知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 31262 代理人 金重庆 (54) 发明名称 毛萼乙素在制备治疗自身免疫性疾病药物中 的应用 (57) 摘要 本发明涉及毛萼乙素在制备治疗自身免疫性 疾病药物中的应用。毛萼乙素在制备治疗感染性 疾病药物中的应用。本发明优点在于 ： 本发明为 毛萼乙素发掘了新的医疗用途， 开拓了一个新的 应用领域 ； 本发明的毛萼乙素安全无毒， 药效明 显， 预示着很好的药用前景 ； 毛萼乙素能够抑制 细胞因子相关的 JAK/STAT 传导通路的活化， 特异 性地抑制 EAE 小鼠体内具有致病性的 Th1 和 Th17 细胞分化 ； 同时对于 。
3、NF-B 信号通路异常活化有 抑制作用， 改变炎症微环境组分的炎性基因转录 ； 并且完全抑制过继移植小鼠的 EAE 病情， 从而对 EAE 小鼠起到有效的治疗和预防作用。上述研究 预示着毛萼乙素具有很好的治疗自身免疫性疾病 及感染性疾病的药用前景。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 10 页 附图 6 页 CN 102247350 A1/1 页 2 1. 毛萼乙素在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。 2. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述的毛萼乙素在制备治疗多发性硬化 疾病药物中的应用。 3. 根。
4、据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述的毛萼乙素在制备治疗自身免疫性 脑脊髓炎疾病药物中的应用。 4. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述的自身免疫性疾病是 Th1 或 Th17 细 胞相关的自身免疫性疾病。 5. 毛萼乙素在制备治疗感染性疾病药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102247350 A1/10 页 3 毛萼乙素在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种中药提取物的应用， 具体地说， 是毛萼乙素在制备治疗自身免疫 性疾病药物中的应用。 背景技术 0002 自身免疫性疾病、 感染性疾病有着类似的发病机制， 都存在炎症反应。
5、失控。 多发性 硬化 (Multiple sclerosis， MS) 是一种主要累及中枢神经系统的自身免疫性疾病。患者往 往从中青年时期就开始起病， 多数患者会伴随进行性的神经功能障碍而逐渐残疾， 丧失劳 动能力给家庭和社会带来沉重的经济负担。 多发性硬化的病理特征为中枢神经系统炎性浸 润以及由之导致的白质脱髓鞘。自身抗原反应性效应 T 细胞的异常激活所导致的炎症反应 与疾病的发生和发展有着密切的关系。经胸腺选择的 CD4+T 细胞处于未致敏的亚群分化前 状态， 称为幼稚 T 细胞 （nave T cells） ， 位于外周免疫器官 （脾脏和淋巴结） 内。在特殊抗 原的刺激下， 幼稚 T 细。
6、胞将分化为各种效应 T 细胞， 是介导适应性免疫应答的主要细胞， 负 责清除入侵机体的病原体， 但他们的异常激活也会导致各种组织炎症。根据分泌的细胞因 子和生物学功能， CD4 T 辅助细胞主要分为三个亚群 ： Th1， Th2， 和 Th17。Th1 细胞主要分 泌前炎性细胞因子， 包括干扰素(interferon， IFN)， 肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor， TNF) 和白介素 2（interleukin2， IL2） 等， IFN 可以通过自分泌的方式促进 Th1 细胞的分化。Th1 细胞介导细胞免疫反应， 通过活化巨噬细胞清除胞内病原微生物。Th2 细 胞主。
7、要分泌细胞因子白介素 4 （interleukin4， IL4） ， 负责清除胞外微生物。Th17 细胞主要 产生 IL17 家族的细胞因子， 通过招募中性粒细胞至感染部位， 使机体抵御致病或非致病的 细胞外病原微生物。 Th1和Th17细胞在诱发器官特异性自身免疫病和慢性感染等疾病的发 病中起着重要的作用。另外， 幼稚 T 细胞还可以分化成调节性 T 细胞 （Treg） 。Treg 细胞特 征性地表达转录因子 Foxp3， 主要行使免疫抑制功能， 负责维持机体的免疫耐受以及防止自 身免疫反应的发生。 0003 小 鼠 实 验 性 自 身 免 疫 性 脑 脊 髓 炎 （experimental。
8、 autoimmune encephalomyelitis， EAE） 是由 CD4+ T 辅助细胞介导的自身免疫性疾病， 典型病征为中枢 神经系统炎性浸润和白质脱髓鞘。EAE 小鼠被广泛接受为人类自身免疫性多发性硬化的疾 病模型， 是研发炎症性疾病， 尤其是自身免疫性疾病药物以及探索相关药理机制的有力工 具。EAE 可以通过髓鞘蛋白类似物， 如髓少突胶质细胞糖蛋白 （myelin oligodendrocyte glycoprotein， MOG） 或者自身抗原特异性 T 细胞对相应遗传易感性的动物进行诱导发病。 0004 目前， 自身免疫性疾病的治疗方案多为皮质类固醇激素和各种类型的免疫抑。
9、制 剂， 如甲氨喋呤、 米托蒽醌、 环磷酰胺等。 但是， 这些经典治疗方案对于疾病的缓解程度往往 很有限， 并且可能产生较为明显的毒副作用， 包括肺部， 肝脏毒性以及骨髓抑制。寻找更为 安全有效且具有针对性的药物具有十分重要的意义。 0005 我国中药资源丰富， 是筛选疾病治疗药物的珍贵宝库。毛萼乙素是一种从我国西 南部特产的植物， 毛萼香茶菜属 （Isodon eriocalyx） 疏花毛萼香茶菜 (Isodon eriocalyx 说 明 书 CN 102247350 A2/10 页 4 var. laxiflora) 中分离得到的对映贝壳杉烯类二萜化合物。已有基础研究显示， 包括毛 萼乙。
10、素在内的许多二萜类化合物能直接干扰 NF-B 与靶 DNA 序列的结合能力， 从而抑制 NF-B 信号通路的活化。NF-B 在自身免疫与炎症相关疾病中的重要致病作用促使我们 着手研发毛萼乙素在自身免疫性和感染性疾病制药领域中的应用潜力。 0006 中国专利文献 200510110089.8 公开了一种毛萼乙素在制药中的应用， 该发明涉 及毛萼乙素在制备治疗急性白血病药物中的应用， 和毛萼乙素在制备治疗伯基特淋巴瘤药 物中的应用。中国专利文献 200710041559.9 公开了 - 抑制蛋白 1 在调节 T 细胞存活和 自身免疫中的应用。 但是关于毛萼乙素在制备治疗自身免疫性和感染性疾病药物中。
11、的应用 目前还未见报道。 发明内容 0007 本发明的目的是针对现有技术中的不足， 提供毛萼乙素在制备治疗自身免疫性疾 病和感染性疾病药物中的应用。 0008 为实现上述目的， 本发明采取的技术方案是 ： 毛萼乙素在制备治疗自身免疫性疾 病药物中的应用。 0009 所述的毛萼乙素在制备治疗多发性硬化疾病药物中的应用。 0010 所述的毛萼乙素在制备治疗自身免疫性脑脊髓炎疾病药物中的应用。 0011 所述的自身免疫性疾病是 Th1 或 Th17 细胞相关的自身免疫性疾病。 0012 毛萼乙素在制备治疗感染性疾病药物中的应用。 0013 本发明的目的是通过以下技术方法来实现的 ： （一） 实验动物。
12、 ： C57BL/6 小鼠购自中国科学院上海实验动物中心， 动物饲养于上海交通大学医学院实 验动物科学部 SCXK（沪） 2009-0021 无特殊病原体环境中。 0014 （二） 试剂 ： 毛萼乙素 （纯度99%） 溶解于DMSO中， 储存液浓度为100mM， -20保存。 Th1、 Th17检测 抗体购自 BD Bioscience。调节性 T 细胞 （Treg） 检测试剂盒购自 eBioscience 公司。细胞 因子 （IFN、 TNF、 IL2、 IL6、 IL17、 IL4 和 IL10） 检查采用试剂盒 （BD CBA Th1/Th2/Th17） 购 自 BD Bioscienc。
13、e。抗 Jak2 和抗 Try221 磷酸化 Jak2， 抗 STAT1 和抗 Try701 磷酸化 STAT1， 抗 IB， 抗 P65 和抗 Ser536 磷酸化 P65 抗体均购自 Cell Signaling 公司， 抗 STAT3 和抗 Try705 磷酸化 STAT3， 抗 STAT4 和抗 Try693 磷酸化 STAT4 抗体购自 BD Bioscience 公司。 0015 （三） EAE 的诱导和评估 ： MOG 抗原 35-55 位的氨基酸序列为 ： Met-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr- Arg-Ser-Pro-Phe-S er-Arg-Val-Val-His。
14、-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly-Lys， 由吉尔生化有限公司合成 （上海， 中国） ， 纯度大于95%。 操作步骤为 ： 第一天， 小鼠皮下注射含有300g MOG35-55肽段和5mg/ml热 灭活的结核分支杆菌H37Ra的完全弗氏佐剂 （CFA） ， 以及每只小鼠尾静脉注射200ng百日咳 毒素 （PT） 。第三天， 再次每只小鼠尾静脉注射 200ng PT。模型诱导后每天观察小鼠 EAE 病 情， 按照发病的严重程度进行打分， 具体是 ： 0分 ： 无异常表现 ； 1分 ： 尾部无力 ； 2分 ： 后肢受 累， 无力， 跛行 ； 3 分 ： 后肢完全瘫痪 ； 4 分 ： 双后肢。
15、瘫痪并前肢受累 ； 5 分 ： 垂死或死亡。 0016 （四） EAE 的过继移植 ： 说 明 书 CN 102247350 A3/10 页 5 按上述方法对小鼠进行 EAE 诱导， 在模型建立的第十天， 取模型小鼠的外周免疫器官 （脾脏和淋巴结） ， 制成细胞悬液。在含 MOG35-55(20g/ml) 的完全培养基中， 分别加毛萼乙 素 （0.25mM） 或者溶剂对照 （DMSO） 进行处理。培养三天后， 将细胞按每只小鼠 2107个通 过尾静脉注入同品系经半致死剂量 （400cGy） 照射的小鼠体内。在模型诱导的第一和第三 天分别给予每只小鼠尾静脉注射 200 ng 百日咳毒素。EAE 。
16、的病程评分如上所述。 0017 （五） 组织切片化学染色 （H&E） ： 免疫后 29 天的 EAE 小鼠经 PBS 心脏灌注后用 4% 多聚甲醛进行内固定， 取出脊髓组织， 石蜡包埋、 切片， 苏木素 - 伊红染色 （H&E） 或者 Luxol Fast Blue 髓鞘染色。 0018 H&E 染色的具体步骤是 ： A. 二甲苯， 5min。 0019 B. 100% 酒精， 5min。 0020 C. 95% 酒精， 5min。 0021 D. 70% 酒精， 5min。 0022 E. 蒸馏水浸泡， 5min。 0023 F. 苏木精， 5min。 0024 G. 流水冲洗。 0025 。
17、H. 氨水， 润洗。 0026 I. 流水冲洗。 0027 J. 伊红， 1min。 0028 K. 95% 酒精， 1min。 0029 L. 100% 酒精， 1min ； 重复一次。 0030 M. 二甲苯 1min ； 重复一次。 0031 N. 封片。 0032 Luxol Fast Blue 染色的具体步骤是 ： A. 二甲苯， 5min。 0033 B. 100% 酒精， 5min。 0034 C. 95% 酒精， 5min。 0035 D. Luxol fast blue 染液， 60， 过夜。 0036 E. 95% 酒精， 润洗。 0037 F. 蒸馏水， 润洗。 0038。
18、 G. 碳酸锂溶液， 5sec。 0039 H. 70% 酒精， 10sec。 0040 I. 蒸馏水， 润洗。 0041 J. 重复步骤 GI， 直到脊髓灰质和白质的颜色达到最佳对比。 0042 K. 70% 酒精， 润洗。 0043 L. 结晶紫溶液， 1min。 0044 M. 蒸馏水， 润洗。 0045 N. 脱水。 0046 O. 透明。 说 明 书 CN 102247350 A4/10 页 6 0047 P. 封片。 0048 （六） 细胞培养 ： 无菌环境下取小鼠脾脏或淋巴结， 研磨后通过 70m cell strainer（购自 BD Bioscience） 过滤， 制备单细胞。
19、悬液。经红细胞裂解液 （0.15M NH4Cl、 10mM KHCO3、 0.1 mM EDTA， pH 7.27.4） 作用 1 分钟后立即用两倍体积的培养基中和以去除红细胞。加抗原 MOG （20g/ml） 或者不加抗原刺激， 细胞培养于完全 RPMI1640 培养基 （含 10% 胎牛血清， 2mM L- 谷氨酰胺， 5mM 2- 巯基乙醇和 100 单位 /ml 青霉素和链霉素） 。 0049 （七） 细胞增殖实验 ： 小鼠脾脏单细胞重悬于完全培养基中， 调整细胞浓度至 5106/ml。在 96 孔平底细胞 培养板中每孔加入 100l 细胞悬液， 加抗原 MOG（20g/ml） 刺激，。
20、 在含 5% CO2的 37培 养箱中培养 72 h， 最后 16 18 h 每孔加入 1Ci 3H- 甲基胸腺嘧啶 （3H-TdR） 。培养时 间到达时， 将细胞摄取的同位素转移到玻璃纤维素膜 （Wallac， Finland） 上。膜烘干后加入 闪烁液， 放入Wallac MicroBeta 1450 液闪计数仪上检测细胞内掺入DNA中的 3H-TdR的放 射性相对数量 （cpm） 。 0050 （八） 流式细胞仪淋巴细胞亚群分析 ： 检测 Th1/Th17 淋巴细胞亚群时， 脾脏细胞以每孔 1106个 / 200l 培养在 96 孔平 底板中， 加抗原 MOG（20g/ml） 刺激 24。
21、 小时， 在最后 5 小时用佛波酯 (Phorbol myfismte acetate， PMA) (50ng/ml) 和离子霉素 (ionomycin， Ion) (500 ng/ml) 联合刺激， 同时每孔 加入0.2l GolgiPlug。 按BD Bioscience公司的说明依次进行细胞膜表面和胞内分子的 染色。检测调节性 T （Treg） 淋巴细胞亚群时， 每个样本取相同的脾脏细胞， 按 eBioscience 公司 Mouse Regulatory T Cell Staining Kit 的说明依次进行细胞膜表面和胞内分子的 染色。标记好的细胞洗涤后使用 BD LSR 流式细胞仪。
22、检测分析。 0051 （九） 细胞因子检测 ： 将脾细胞重悬于完全培养基中， 调整细胞浓度至每孔 5105个 / 200l， 加抗原 MOG （20g/ml） 刺激， 接种于 96 孔圆底板， 在含 5% CO2的 37培养箱中培养 48 h 后， 收集培 养上清。按 BD Bioscience 公司的 CBA Kit 说明书进行操作， 使用 BD LSR 流式细胞仪 检测培养上清中各种细胞因子的浓度。 0052 （十） 免疫印迹分析 ： 用 BIO-RAD 垂直电泳槽进行 SDS-PAGE 分离， 分离胶浓度为 6 10%， 浓缩胶 5%。电泳 条件 ： 浓缩胶恒压 80V， 分离胶恒压 1。
23、10V。待指示剂溴酚蓝泳至凝胶边缘即终止电泳， 取出 凝胶用于转印。通过 Mini Trans-Blot (Bio-Rad) 转印仪把凝胶上的蛋白质区带转移 至 0.45m 孔径的聚偏氟乙烯 （Hydrophobic polyvinylidene difluoride， PVDF） 膜 （GE healthcare） 上。转印电压 100V， 4转印 1h。转印终止后取出转印膜， 用封闭液室温封闭 1h。洗涤后在用封闭液稀释后的一抗中 4温和振摇过夜。TBST 洗涤 3 次后， 将膜放入稀 释的 HRP- 二抗中室温作用 1h， TBST 洗涤 4 次， 免疫复合物用辣根过氧化物酶化学发光检测。
24、 试剂盒 （millipore） 检测。 0053 （十一） 统计分析 ： 实验结果用三次独立实验的平均值和标准差表示， 用t检验来比较差异。P值小于0.05 则认为具有统计学差异。所有的统计采用 GraphPad Prism 5 Demo 软件。 说 明 书 CN 102247350 A5/10 页 7 0054 在 这 份 研 究 中， 我 们 使 用 了 髓 少 突 胶 质 细 胞 糖 蛋 白 肽 段 35-55(myeloid oligodendrocyte glycoprotein， MOG 35-55) 诱导的小鼠 EAE 疾病模型。小鼠起病前或者 起病后开始给药的实验结果均显示，。
25、 毛萼乙素可有效缓解小鼠 EAE 病情， 降低发病率以及 延迟起病时间。多发性硬化患者和 EAE 小鼠中都发现有中枢神经系统的炎性浸润以及由之 介导的脊髓白质脱髓鞘。通过分析给药组与溶剂对照组 EAE 小鼠的脊髓病理组织切片， 我 们发现毛萼乙素给药后， 小鼠脊髓的炎性浸润明显减少， 由之介导的白质脱髓鞘也明显减 轻。 0055 细胞因子在驱动幼稚 T 细胞的分化过程中发挥关键作用。IFN 和 IL12 是促进 向 Th1 细胞方向分化的前炎症细胞因子， 其中， IFN 以正反馈的形式促进 Th1 细胞分化， 与之相似， IL4 也以自分泌的形式促进 Th2 细胞分化。而对于 Th17 细胞分。
26、化， IL6 的刺激至 关重要。自身抗原反应性效应 T 细胞的异常激活对于多发性硬化症以及 EAE 的发病有重要 作用。在发病的高峰期， 多发性硬化患者和 EAE 小鼠体内的 IFN 水平都明显上升， 随着病 情的缓解， IFN 也相应下降。此外， 过继移植分泌 IFN 的自身反应性 Th1 可以诱导正常 小鼠爆发类似的EAE症状。 所以， 早期的研究认为这类疾病主要由失调的自身反应性的Th1 细胞导致。近年来， 新发现的 T 辅助细胞亚群 Th17 也被证实与诸多自身免疫性疾病的发病 有关。其分泌的特征性细胞因子 IL17 参与激活多种炎症反应通路， 并且可以诱导其他前炎 症细胞因子以及趋化。
27、因子的分泌。在多发性硬化患者和发病的 EAE 小鼠体内， IL17 的分泌 水平也有所上升， 并且， 过继移植分泌 IL17 的自身抗原反应性 Th17 也同样可以诱导 EAE 发 病。因此， Th1 和 Th17 对于多发性硬化以及 EAE 都有重要的致病作用。调节性 T 细胞是维 持机体免疫平衡的重要环节， 可以通过分泌抗炎性细胞因子IL10抑制T辅助细胞的过度活 化， 在诸多自身免疫病患者中都发现调节性T细胞亚群的减少。 Th2细胞的正常生理功能是 清除胞外微生物， 在哮喘和许多过敏性疾病的发病中多有 Th2 型细胞因子 IL4 和 IL5 大量 分泌。我们的检测发现， 在 EAE 发病。
28、高峰期， 毛萼乙素处理组小鼠外周淋巴器官 （脾脏） 中 T 细胞针对自身抗原 MOG 的增殖反应性显著低于溶剂对照组小鼠。由此可以看出， 毛萼乙素 可抑制自身反应性 T 细胞的增殖。为了研究究竟是对哪些 T 细胞亚群起作用， 我们对脾脏 中的 CD4+T 细胞做进一步胞内染色分析， 结果发现毛萼乙素给药后 CD4+T 细胞中具有致病 能力的 Th1 和 Th17 细胞亚群的比例较溶剂对照组明显减少， 而具有免疫抑制功能的 Treg 亚群分布不受影响。 细胞因子的检测结果也显示相同的变化趋势 ： 与溶剂对照组相比， 毛萼 乙素给药组中由致病性 Th1 细胞分泌的 IFN、 TNF、 IL2 和 。
29、Th17 细胞分泌的 IL17 的水平都 明显下调 ； 而与 Treg 相关的细胞因子 IL10 和与 Th2 相关的细胞因子 IL4 的分泌水平没有 明显变化。上述实验结果说明， 毛萼乙素治疗抑制 EAE 小鼠自身抗原特异性的 T 细胞增殖， 并且特异性地降低自身反应性 Th1 和 Th17 效应 T 细胞的亚群比例， 并降低相应的炎性细胞 因子的表达水平， 而对 Treg 与 Th2 细胞亚群无明显调变作用。 0056 JAK/STAT 家族成员是传递胞外细胞因子信号的主要分子， 细胞因子受体 偶 联 的 Janus 家 族 酪 氨 酸 激 酶 （Janus family tyrosine。
30、 kinases， JAKs）受 前 炎 性 （pro-inflammatory） 细胞因子激活后， 发生磷酸化， 进一步激活相应的下游信号转导和转 录激活蛋白 (signal transducer and activator of transcription， STAT)。受 IFN 激 活的 STAT1 和受 IL12 激活的 STAT4 促进 Th1 细胞分化， IFNSTAT1 通路还可以发挥正 反馈的效应增强分泌 IFN 的 Th1 细胞的生成。Th17 的分化主要受前炎性细胞因子 IL6 说 明 书 CN 102247350 A6/10 页 8 的调节， IL6 与膜表面受体结合后。
31、， 磷酸化激活 JAK/STAT3 信号转导， 启动 Th17 细胞分化相 关的基因转录。接着我们进一步探索毛萼乙素对胞内信号通路的影响。取给药组和溶剂组 EAE 小鼠脾脏细胞进行 JAK/STAT 相关蛋白免疫印迹分析发现 ： 与正常小鼠相比， 虽然这些 蛋白的总蛋白水平没有明显调变， 但 EAE 发病小鼠体内 STAT1 和 STAT3 的磷酸化水平明显 上升， 但经过毛萼乙素治疗后， 两者的磷酸化水平都大幅下调 ； 同时 STAT4 和它们的上游激 酶 JAK2 的磷酸化水平也在毛萼乙素治疗组的小鼠中明显减低。这些结果提示， 毛萼乙素通 过阻滞 JAK/STAT 信号通路， 抑制致病性 。
32、Th1 和 Th17 细胞分化。 0057 除了 JAK/STAT 通路， 我们还研究了核因子 B （NF-B） 信号通路。NF-B 信号通 路参与许多免疫和炎症反应， 并在诱导 T 辅助细胞分泌细胞因子中起重要作用。在正常情 况下， NF-B 以一种无活性的形式与其抑制性蛋白 (inhibitory protein kappa B， IB) 相结合， 存在于胞浆中。炎症等刺激因素可以通过一个或多个信号途径使 IB 降解， 从而 使得NF-B与之解离， 由胞浆移位至胞核， 与DNA上启动子区域相应的靶基因位点结合， 启 动一系列免疫相关的基因转录。抑制 NF-B 的过度活化可以有效控制包括由感。
33、染、 自身免 疫性疾病等引起的许多炎症反应。外周免疫器官内 NF-B 的激活对于 EAE 的发病至关重 要， Th1 细胞分泌的前炎性细胞因子 IL2 和 TNF 的表达受 NF-B 的调控， 同时他们又能够 进一步激活 NF-B。诱导 Th17 细胞分化的 IL6 也是 NF-B 的靶基因。IL17 是 Th17 细胞 分泌的前炎性细胞因子， 它可以通过激活 NF-B 以正反馈的形式促进 IL6 的表达。这些以 NF-B 为核心的细胞因子调控网在放大炎症反应中具有重要作用。 0058 免疫印迹分析证明， 毛萼乙素通过降低 p65 的磷酸化水平以及抑制 IB 的降解， 对 NF-B 的活化进行。
34、了抑制。与之相对应， 我们检测了 MOG 刺激后小鼠脾细胞培养上清中 对于幼稚 T 细胞向致病性 Th17 和 Th1/ 或非致病性的 Th2 效应 T 细胞分化有促进作用的细 胞因子分泌水平。实验结果显示， 与溶剂对照组相比， 给药组中分别促进幼稚 T 细胞向致病 性 Th1 和 Th17 细胞分化的前炎症细胞因子 IFN 和 IL6 的水平明显下调， 由 Th1 细胞分泌 的炎症细胞因子 IL2 和 TNF 以及 Th17 细胞分泌的 IL17 的表达水平也在给药组小鼠中有明 显的下调， 反映毛萼乙素对于 EAE 小鼠体内前炎症细胞因子有广泛的抑制效应。由此推论， 毛萼乙素治疗有效降低了E。
35、AE小鼠体内NF-B信号通路的异常活化， 并且基于此改变了外 周免疫器官的炎症微环境， 影响 T 辅助细胞的分化， 进一步放大其抗炎作用。 0059 综上所述， 我们发现毛萼乙素可有效缓解小鼠 EAE 病情。给药治疗后， EAE 小鼠外 周免疫器官中的 JAK/STAT 通路受到抑制， 从而受此通路调控的 Th1 和 Th17 细胞比例明显 下调。同时毛萼乙素对 NF-B 活性也有抑制作用， 并由此阻滞对 EAE 发病有重要作用的前 炎性细胞因子的分泌以及放大炎症反应的正反馈效应， 从调节效应 T 细胞炎性微环境的角 度协同抑制 EAE 的发病。此外， 过继移植经过毛萼乙素处理后的 MOG 反。
36、应性 T 细胞， 完全 丧失使受体小鼠发病的致病性， 反应了毛萼乙素可以去除自身抗原反应性 T 细胞的致病能 力， 进一步证实了毛萼乙素对于 EAE 具有保护作用。 0060 实验结果提示毛萼乙素可能具有多重的抗炎性质， 因此预示着很好的治疗自身免 疫性疾病及感染性疾病的药用前景。 0061 本发明优点在于 ： 1、 本发明为毛萼乙素发掘了新的医疗用途， 开拓了一个新的应用领域 ； 2、 本发明的毛萼乙素安全无毒， 药效明显， 预示着很好的药用前景 ； 说 明 书 CN 102247350 A7/10 页 9 3、 毛萼乙素能够抑制细胞因子相关的JAK/STAT转导通路的活化， 特异性地抑制E。
37、AE小 鼠体内具有致病性的Th1和Th17细胞分化 ； 对于NF-B信号通路异常活化有抑制作用， 改 变炎症微环境组分的炎性基因转录 ； 可以完全抑制过继移植小鼠的 EAE 病情， 预示着很好 的治疗自身免疫性疾病及感染性疾病的药用前景。 附图说明 0062 图 1 显示毛萼乙素的化学结构。 0063 图2A显示毛萼乙素治疗方案改善小鼠EAE病情。 建立EAE小鼠模型， 待起病后 （模 型建立后的第 11 天） ， 将小鼠随机分组， 分别每天腹腔注射给予溶剂 （200l/ 小鼠， 溶剂对 照组， n=8） 或者毛萼乙素 （给药组， n=10） ， 剂量为 10mg 毛萼乙素 /kg 体重， 连。
38、续 18 天， 每天 观察小鼠状态， 根据发病程度进行临床评分，P0.05， 具有显著差异。 0064 图 2B 显示毛萼乙素预防方案改善小鼠 EAE 病情。将小鼠随机分组后， 在 EAE 模型 建立的当天开始每天分别给予溶剂 （200l/ 小鼠， 溶剂对照组， n=8） 或者毛萼乙素 （给药 组， n=6 剂量为 10mg 毛萼乙素 /kg 体重， 连续 28 天， 每天观察小鼠状态， 根据发病程度进行 临床评分，P0.05， 具有显著差异。 0065 图 3A 显示正常小鼠， EAE 发病小鼠溶剂组与给药组脊髓病灶部位 H&E 组织切片染 色。毛萼乙素治疗结束后， 对 EAE 小鼠脊髓病灶。
39、部位的切片进行 H&E 染色， 在光学显微镜下 放大 400 倍观察。正常小鼠无炎性浸润， 溶剂组小鼠脊髓的血管周组织存在大量细胞炎性 浸润， 而毛萼乙素治疗组小鼠的相应部位炎性浸润明显减少。 0066 图 3B 显示正常小鼠， EAE 发病小鼠溶剂组与给药组脊髓病灶部位 Luxol Fast Blue髓鞘组织切片染色。 毛萼乙素治疗结束后， 对EAE小鼠脊髓病灶部位的切片进行Luxol Fast Blue 染色。在光学显微镜下放大 400 倍观察。正常小鼠无脱髓鞘病变， 溶剂组小鼠脊 髓的白质部分大量缺失， 白质间空泡明显增多， 而毛萼乙素治疗组小鼠相应部位的白质多 保持完整， 仅有少量缺失。
40、。 0067 图 4A 显示正常小鼠， EAE 发病小鼠溶剂组与毛萼乙素给药组小鼠外周免疫器官 （脾脏） 对自身抗原反应的增殖能力， 用增殖系数 （Stimulation Index， SI） ， 即 MOG 刺激后 细胞 3H 摄入量与细胞自发3H 摄入量的比值表示。正常小鼠脾细胞对 MOG 刺激无反应性 ； 溶 剂组小鼠EriB脾细胞对MOG刺激增殖反应性强 ； 处理组小鼠脾细胞对MOG的反应性显著低 于溶剂组小鼠， *P0.001， 具有显著差异。 0068 图 4B 显示溶剂组与给药组 EAE 小鼠 Th1、 Th17 和 Treg 比例。对小鼠脾脏中的 CD4+T 细胞做胞内染色分析。
41、， 结果显示给药组小鼠 CD4+T 细胞中以 IFN 为表面标志的 Th1 细胞和以 IL17 为表面标志的 Th17 细胞亚群的比例较溶剂组明显减少， 而以 Foxp3 为表面 标志的 Treg 细胞亚群的比例没有明显变化。 0069 图 5 显示免疫印迹检测正常小鼠， EAE 发病小鼠溶剂组与毛萼乙素给药组小鼠体 内 JAK/STAT 通路。与正常小鼠相比， EAE 发病小鼠溶剂组中 Th1 分化相关的 STAT1 和 Th17 分化相关的 STAT3 磷酸化水平明显上调， 毛萼乙素给药后它们的磷酸化大幅下调， STAT4 以 及它们的上游激酶 JAK2 的磷酸化水平也有所下调。这些蛋白的。
42、总蛋白水平没有调变。 0070 图 6A 显示溶剂组与给药组 EAE 小鼠体内炎性相关细胞因子浓度。与溶剂组相比， 毛萼乙素给药组小鼠中 Th1 细胞相关的前炎症细胞因子 IFN 、 TNF 、 IL2 和 Th17 细胞相 说 明 书 CN 102247350 A8/10 页 10 关的前炎症细胞因子 IL17、 IL6、 分泌水平明显下调 ； 促进向 Th2 效应 T 细胞分化的细胞因 子 IL4 的水平有轻微的上升 ； Treg 细胞相关的抗炎性细胞因子 IL10 的水平没有明显变化， * P0.05, * P0.01， 具有显著差异。 0071 图 6B 显示免疫印迹检测正常小鼠， E。
43、AE 发病小鼠溶剂组与毛萼乙素给药组小鼠体 内 NF-B 通路。与正常小鼠相比， EAE 发病小鼠溶剂组中 NF-B 的活化形式磷酸化 p65 的 水平明显上调， 其上游抑制物 IB 的表达水平明显下调。毛萼乙素给药组中磷酸化 p65 的水平明显下调， 与之相对应， 其上游抑制物 IB 的表达水平明显上调。 0072 图7显示过继移植小鼠临床评分。 单纯移植 MOG反应性T细胞的受体鼠爆发了典 型的 EAE 症状， 平均最高临床评分为 3.750.43， 而经过毛萼乙素处理后细胞移植的受体 小鼠完全没有发病。 具体实施方式 0073 下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。 0074。
44、 实施例 1 毛萼乙素缓解小鼠 EAE 病情 （A） 治疗方案 ： 建立 EAE 小鼠模型， 待起病后 （模型建立后的第 11 天） ， 将小鼠随机分组， 分别每天腹腔 注射给予溶剂 （200l/ 小鼠， 溶剂对照组， n=8） 或者毛萼乙素 （给药组， n=10） ， 剂量为 10mg 毛萼乙素 /kg 体重， 连续 18 天， 每天观察小鼠状态， 根据发病程度进行临床评分。溶剂对照 组小鼠均爆发出典型的 EAE 病情， 平均最高临床评分达到 3.810.34， 而给药组平均最高 临床评分为 2.800.29。 0075 （B） 预防方案 ： 将小鼠随机分组后， 在 EAE 模型建立的当天开。
45、始每天分别给予溶剂 （200l/ 小鼠， 溶 剂对照组， n=8） 或者毛萼乙素 （给药组， n=6） ， 剂量为 10mg 毛萼乙素 /kg 体重， 连续 28 天， 每天观察小鼠状态， 根据发病程度进行临床评分。溶剂对照组小鼠都爆发出典型的 EAE 病 情， 平均起病时间为模型建立后的第 12.750.75 天， 平均最高临床评分达到 3.590.25， 而给药组仅有66.7%的小鼠发病， 平均最高临床评分也降低为1.750.56。 此外， 给药组的 平均起病时间也延迟到模型建立后的第 17.252.29 天。 0076 治疗和预防方案的临床评分分别如图 2A 和图 2B 所示， 数据以平。
46、均数 标准差的 形式表示 (* P0.05)。 治疗和预防方案的结果均显示， 毛萼乙素给药可显著地抑制小鼠的 EAE 病情。 0077 实施例 2 毛萼乙素治疗后 EAE 小鼠脊髓病理观察 （A） H&E 染色 对正常小鼠， EAE 发病小鼠溶剂组与给药组脊髓病灶部位进行 H&E 组织切片染色。正 常小鼠无炎性浸润， 溶剂组小鼠脊髓的血管周组织存在大量细胞炎性浸润， 而毛萼乙素治 疗组小鼠的相应部位炎性浸润明显减少。 0078 （B） Luxol Fast Blue 染色 对正常小鼠， EAE 发病小鼠溶剂组与给药组脊髓病灶部位进行 Luxol Fast Blue 髓鞘 组织切片染色。 正常小。
47、鼠无脱髓鞘病变， 溶剂组小鼠脊髓的白质部分大量缺失， 白质间空泡 明显增多， 而毛萼乙素治疗组小鼠相应部位的白质多保持完整， 仅有少量缺失， 与 H&E 染色 说 明 书 CN 102247350 A9/10 页 11 切片中炎性浸润明显减少相对应。 0079 H&E 和 Luxol Fast Blue 的染色结果分别如图 3A 和图 3B 所示。正常小鼠无炎性 浸润和脱髓鞘病变， 溶剂对照组中均可观察到脊髓组织出现的大量炎性浸润， 脊髓白质的 正常结构被严重破环。毛萼乙素治疗组中， 小鼠脊髓的炎性病灶和白质脱髓鞘区域都显著 减少。以上结果表明， 毛萼乙素治疗可以显著改善 EAE 小鼠中枢神经。
48、系统炎性浸润， 从而保 护髓鞘白质。 0080 实施例 3 毛萼乙素抑制 EAE 小鼠自身抗原特异性 T 细胞增殖和分化 特定的炎症微环境和对应的抗原刺激下， 幼稚 CD4+T 被激活， 并分化成为各种辅助性 T 细胞 （Th） ， 介导效应作用。在 EAE 发病中 Th1 和 Th17 细胞具有致病作用， 调节性 T 细胞 （Treg） 对应 EAE 的发病具有抑制作用。为揭示毛萼乙素保护 EAE 小鼠的机制， 我们首先检 测了在 EAE 发病高峰期 EriB 处理组和溶剂对照组小鼠体内针对自身抗原 MOG 刺激后的增 殖能力， 结果显示， 正常小鼠对MOG无反应性 ； 溶剂组小鼠EriB脾。
49、细胞对MOG刺激增殖反应 性强 ； 毛萼乙素处理组小鼠外周淋巴器官 （脾脏） 中 T 细胞对 MOG 的反应性显著低于溶剂对 照组小鼠 （图4A） 。 由此可以看出， 体内给予毛萼乙素后， 显著抑制了自身抗原特异性T细胞 增殖。毛萼乙素可抑制自身反应性 T 细胞的增殖， 为了研究毛萼乙素究竟是对哪些 T 细胞 亚群起作用， 我们对脾脏中的 CD4+T 细胞做胞内染色分析， 结果发现毛萼乙素给药组小鼠 外周淋巴器官 （脾脏） CD4+T 细胞中具有致病能力的 Th1 和 Th17 细胞亚群的比例较溶剂对 照组明显减少， 而 Treg 亚群分布不受影响 （图 4B） 。上述实验结果说明， 毛萼乙素治疗可以 抑制 EAE 小鼠自身抗原特异性的 T 细胞增殖， 并且特异性。