一种星形高分子纳米微球及其制法和用途.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102228442 A (43)申请公布日 2011.11.02 CN 102228442 A *CN102228442A* (21)申请号 201110172560.1 (22)申请日 2011.06.24 A61K 9/16(2006.01) A61K 47/34(2006.01) A61K 31/337(2006.01) A61K 49/12(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 南京大学 地址 210093 江苏省南京市汉口路 22 号 (72)发明人 蒋锡群 张鲁中 武伟 张亚军 (74)专利代理机构 南京知识律师事务所 。

2、32207 代理人 黄嘉栋 (54) 发明名称 一种星形高分子纳米微球及其制法和用途 (57) 摘要 一种以 5,10,15,20- 四 (4- 氨基苯基 ) 卟 啉或者双嘧达莫 (Dipyridamole) 为核的星形 高分子的纳米微球， 其特征是 ： 它的表面是亲水 的聚乙二醇， 内部是疏水的聚- 己内酯， 高分 子纳米微球的分子量为 3000050000， 亲水部分 的分子量为 50004， 疏水的部分的分子量为 1000030000， 纳米微球的平均粒径为 2060nm。 本发明的复合纳米微球生物相容性好， 化学性质 稳定。本发明的星形高分子纳米微球可以用作药 物载体， 并有缓释作用，。

3、 还可能用作荧光标记。本 发明公开了其制法及其用途。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 CN 102228443 A1/1 页 2 1. 一种星形高分子的纳米微球 , 其特征是 ： 它是以 5, 10, 15, 20- 四 (4- 氨基苯基 ) 卟啉或者双嘧达莫为核的星形高分子的纳米微球， 它的表面是亲水的聚乙二醇， 内部是疏 水的聚- 己内酯， 高分子纳米微球的分子量为 3000050000， 亲水部分的数均分子量为 50004， 疏水的部分的数均分子量为 1000030000， 纳米微球的平。

4、均粒径为 2060 nm。 2. 一种制备权利要求 1 所述的星形高分子纳米微球的方法， 其特征是它包括如下步 骤 ： 步骤 1. 在惰性气体保护下， 5, 10, 15, 20- 四 (4- 氨基苯基 ) 卟啉或者双嘧达莫 (Dipyridamole)、- 己内酯和催化量的辛酸亚锡加到反应瓶中， 在 100-160搅拌下反应 1-4 天， 所得固体溶解于二氯甲烷或四氢呋喃中， 加入到冷的甲醇中沉淀， 得到的固体真空 干燥 ； 步骤 2. 将步骤 1 得到的以卟啉或双嘧达莫为核的聚- 己内酯和平均分子量为 5000 的单甲氧基羧基聚乙二醇 ( 末端为羧基甲氧基聚乙二醇 ) 在 90 下加热真空。

5、抽气 2-4 h， 冷却后， 将4-二甲氨基吡啶对甲基苯磺酸盐(DTPS)的二氯甲烷溶液加入到反应瓶中， 再将 N, N- 二环乙基碳二亚胺的二氯甲烷溶液加入到上述溶液中， 混合物室温下搅拌反应 2-4 d， 过滤， 滤液在乙醚中沉淀， 真空干燥， 将所得固体溶解在丙酮中， 加入到水溶液中透析除 去未反应的聚乙二醇， 冻干， 即得星形高分子 ； 步骤 3. 上述的星形高分子通过纳米沉淀的方法得到空白的纳米微球 ： 高分子溶于乙 醇中， 将乙醇溶液在 4060 下搅拌加入到热水中， 冷至室温， 减压蒸去溶液中的乙醇得到 纳米微球的水溶液， 纳米微球的平均粒径分布为 2060 nm。 3. 根据权。

6、利要求 2 所述的步骤 1 的方法， 其特征是 5, 10, 15, 20- 四 (4- 氨基苯基 ) 卟啉， 双嘧达莫， 己内酯， 辛酸亚锡的投料比为 0.025 mmol:0.0010.005 mmol:27 mmol。 4. 根据权利要求 2 所述的步骤 2 的方法， 其特征是以卟啉或双嘧达莫为核的聚- 己 内酯， 单甲氧基羧基聚乙二醇， 4- 二甲氨基吡啶对甲基苯磺酸盐，N, N- 二环乙基碳二亚胺 的投料比为 0.0052 mmol:0.0250.05 mmol:0.010.02 mmol:0.0250.6 mmol。 5. 根据权利要求 2 所述的步骤 3 的方法， 其特征是高分子。

7、， 乙醇， 热水投料比为 10 mg:11.5 mL:23 mL。 6. 一种负载有紫杉醇的星形高分子纳米微球， 其特征是 ： 它是以权利要求 1 所述的星 形高分子纳米微球作为载体， 负载有紫杉醇， 紫杉醇的质量占纳米微球总质量的 58 %。 7. 一种制备权利要求 6 所述的负载紫杉醇的星形高分子纳米微球的方法， 其特征是 ： 一种制备负载紫杉醇的纳米微球的方法 : 将上述的星形高分子和紫杉醇混溶在乙醇中， 将 上述溶液搅拌加入到 4060 的热水中， 冷至室温， 减压蒸去乙醇， 得到负载紫杉醇的纳米 微球的水溶液。 8. 根据权利要求 7 所述的方法， 其特征是 ： 星形高分子， 紫杉醇。

8、， 乙醇， 热水的投料比为 10 mg:0.40.75 mg:11.5 mL:23 mL。 9. 根据权利要求 6 所述的负载紫杉醇的纳米微球用作药物载体， 还能用作荧光标记。 10. 根据权利要求 6 所述的负载紫杉醇的纳米微球作为紫杉醇药物的缓释剂型。 权 利 要 求 书 CN 102228442 A CN 102228443 A1/5 页 3 一种星形高分子纳米微球及其制法和用途 技术领域 0001 本发明涉及一种可生物降解的星形高分子纳米微球， 可以用作药物载体， 具体地 说， 可以作为紫杉醇的载体。 背景技术 0002 紫杉醇是一种从紫杉 (Taxus brevifolia) 的树皮。

9、中提取的化合物， 是微管的特 异性稳定剂， 可以促进微管的装配和保持微管的稳定的药物。在细胞中， 紫杉醇结合到聚 合的微管上， 而不与未聚合的微管蛋白二聚体反应。细胞接触紫杉醇后会在细胞内积累大 量的微管， 这些微管的积累干扰了癌症细胞的正常功能 ( 使细胞分裂停止于有丝分裂期， 阻断细胞的正常分裂 )。紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌， 对肺癌， 大肠癌， 黑色素瘤， 头颈部癌， 淋巴瘤和脑瘤等也都有疗效。由于紫杉醇在水溶液中的溶解度仅为 0.006 mg/ mL， 因此商业上应用的紫杉醇是泰素 (Taxol).。虽然泰素中含有一种叫做聚氧乙烯蓖麻油 (Cremophor EL) 的化合物， 。

10、具有优良的增溶能力和乳化能力， 能解决紫杉醇的低溶解度问 题， 但是使用这种助溶剂可以导致很多的不良反应 ( 包括过敏反应和神经毒性等 )。 0003 随着纳米技术的兴起， 使得基于生物可降解的并且生物相容性的双亲性高分子为 载体的药物输送体系受到人们的广泛关注。一般说来， 双亲性嵌段高分子可以在水中自组 装形成纳米尺度的纳米球型粒子， 亲水部分形成微球的球壳， 疏水部分则成为内核。 这种纳 米微球可以用于负载疏水性的药物， 增加疏水药物的浓度， 控制药物释放速度， 延长药物的 半衰期， 提高药物的利用效率以及减轻化疗药物带来的副作用。线性高分子的纳米微球在 注射到人体内之后由于血流稀释和血流。

11、剪切力的作用， 很容易发生解离。 这时， 包裹在纳米 微球中的药物还没有到达肿瘤部位的时候就会提前释放出来， 就减弱了纳米药物载体的功 能从而影响到治疗的效果， 因此纳米微球的物理稳定性成为困扰纳米载体的很大问题。 0004 由于星形高分子的临界聚集浓度比同等的线性的高分子低， 因此星形高分子形成 的纳米微球比线性高分子形成的纳米微球有更好的热力学稳定性。 正是基于星形双亲性高 分子的纳米微球比线性高分子的纳米微球的热力学稳定的优点， 使得星形高分子的纳米微 球能够解决线性高分子的纳米微球由于血流的作用而引起的不稳定问题。因此， 近年来基 于星形高分子的纳米微球越来越得到人们的关注。 发明内容。

12、 0005 本发明的目的在于提供一种生物相容， 可以生物降解的， 可用作药物载体高分子 纳米微球及其制备方法。 0006 本发明的技术方案如下 ： 一种星形高分子的纳米微球 , 它是以 5, 10, 15, 20- 四 (4- 氨基苯基 ) 卟啉或者双 嘧达莫 (Dipyridamole) 为核的星形高分子的纳米微球， 它的表面是亲水的聚乙二醇， 内部 是疏水的聚- 己内酯， 经凝胶色谱测定高分子的分子量为 3000050000， 亲水部分聚乙二 醇的数均分子量为 50004， 疏水部分聚己内酯数均分子量为 1000030000， 纳米微球的平 说 明 书 CN 102228442 A CN 。

13、102228443 A2/5 页 4 均粒径通过动态光散射仪测定为 2060 nm。 0007 一种制备上述的星形高分子纳米微球的方法， 它包括如下步骤 ： 步骤 1. 在惰性气体保护下， 5, 10, 15, 20- 四 (4- 氨基苯基 ) 卟啉或者双嘧 达莫 (Dipyridamole)、- 己内酯和催化量的辛酸亚锡加到反应瓶中， 所述的 5, 10, 15, 20- 四 (4- 氨基苯基 ) 卟啉或双嘧达莫、 己内酯和辛酸亚锡的投料比为 0.025 mmol:0.0010.005 mmol:27 mmol。 在100-160搅拌下反应1-4天， 所得固体溶解于二氯 甲烷或四氢呋喃中， 。

14、加入到冷的甲醇中沉淀， 得到的固体真空干燥 ； 步骤 2. 将步骤 1 得到的以卟啉或双嘧达莫为核的聚- 己内酯和数均分子量为 5000 的单甲氧基羧基聚乙二醇 ( 末端为羧基甲氧基聚乙二醇 ) 在 90 下加热真空抽气 2-4 h， 冷却后， 将4-二甲氨基吡啶对甲基苯磺酸盐(DTPS)的二氯甲烷溶液加入到反应瓶中， 再将 N, N- 二环乙基碳二亚胺的二氯甲烷溶液加入到上述溶液中， 混合物室温下搅拌反应 2-4 d， 过滤， 滤液在乙醚中沉淀， 真空干燥， 将所得固体溶解在丙酮中， 加入到水溶液中透析除 去未反应的聚乙二醇， 冻干， 即得星形高分子， 所述的以卟啉或双嘧达莫为核的聚- 己内。

15、 酯， 单甲氧基羧基聚乙二醇， 4- 二甲氨基吡啶对甲基苯磺酸盐，N, N- 二环乙基碳二亚胺的 投料比为 0.0052 mmol:0.0250.05 mmol:0.010.02 mmol:0.0250.6 mmol ； 步骤 3. 将上述的星形高分子通过纳米沉淀的方法得到空白的纳米微球， 其步骤为 ： 将步骤 2 得到的星形高分子溶于乙醇中， 将乙醇溶液在 4060 下搅拌加入到热水中， 冷 至室温， 减压蒸去溶液中的乙醇得到纳米微球的水溶液， 所得纳米微球的平均粒径为 2060 nm， 所述的星形高分子， 乙醇， 热水用量比为 10 mg:11.5 mL:23 mL。 0008 一种负载有。

16、紫杉醇的星形高分子纳米微球， 它是以上述的星形高分子纳米微球作 为载体， 负载有紫杉醇， 紫杉醇的质量占纳米微球总质量的 3-5 %。 0009 一种制备负载紫杉醇的纳米微球的方法 : 将上述步骤 2 得到的星形高分子和紫 杉醇混溶在乙醇中， 将上述溶液搅拌加入到 4060 的热水中， 冷至室温， 减压蒸去乙醇， 得到负载紫杉醇的纳米微球的水溶液， 所述的星形高分子， 紫杉醇， 乙醇， 热水的投料比为 10 mg:0.40.75 mg:11.5 mL:23 mL。 0010 本发明制备的负载紫杉醇的纳米微球可以用作药物载体， 还可能用作荧光标记。 0011 本发明的负载紫杉醇的纳米微球具有很好。

17、的药物缓释功能。 0012 本发明的复合纳米微球生物相容性好， 化学性质稳定。本发明的复合纳米微球可 以用作药物载体， 还可能用作荧光标记。本发明的负载紫杉醇的纳米微球具有很好的药物 缓释功能。 附图说明 0013 图 1 为载有紫杉醇的星形高分子纳米微球的体外释放曲线 ； 图 2 为载有紫杉醇的星形高分子纳米微球在肿瘤小鼠中的荧光标记功能。 具体实施方式 0014 下面结合实施例进一步阐明本发明的内容， 但是这些实施例并不限制本发明的保 护范围。 0015 实施例 1 ： 5, 10, 15, 20- 四 (4- 氨基苯基 ) 卟啉 (TAPP) 作为引发剂引发聚合 说 明 书 CN 102。

18、228442 A CN 102228443 A3/5 页 5 - 己内酯 氩气保护下， 将 TAPP(16.85 mg, 0.025mmol)， 辛酸亚锡 (1.00 mg, 0.0025 mmol)， - 己内酯 (0.7 g, 6.14 mmol) 加入到 10 mL 圆底烧瓶中， 混合物在 110加热搅拌反应 72 h。 反应完成后， 固体溶解于二氯甲烷中， 在冷的甲醇中沉淀。 过滤， 乙醚洗涤， 真空干燥， 得到聚-己内酯化合物(TAPP-PCL)。 1H NMR (CDCl 3, 300MHz) : 1.39 (m, 2H), 1.63 (m, 4H), 2.30 (t, 2H), 。

19、4.05 (t, 2H), 7.94 (d, porphyrin), 8.14 (s, porphyrin), 8.85 (s, porphyrin)。经体积排阻色谱测定高分子的分子量为 23394。 0016 实施例 2 ： 双嘧达莫作为引发剂引发聚合己内酯 氩气保护下， 将双嘧达莫 (12.61 mg, 0.025mmol)， 辛酸亚锡 (1.00 mg, 0.0025 mmol)，-己内酯(0.7 g, 6.14 mmol)加入到10 mL圆底烧瓶中， 混合物在110加热搅拌 反应72 h。 反应完成后， 固体溶解于二氯甲烷中， 在冷的甲醇中沉淀。 过滤， 乙醚洗涤， 真空 干燥， 得到。

20、聚-己内酯化合物(Dipyridamole-PCL)。 1dH NMR (CDCl 3, 300MHz) : 1.39 (m, 2H), 1.63 (m, 4H), 2.30 (t, 2H), 4.05 (t, 2H), 1.72 (m, dipyridamole), 3.81 (m, dipyridamole), 4.27 (m, dipyridamole)。 经体积排阻色谱测定高分子的分子 量为 22985。 0017 实施例 3 ： 5, 10, 15, 20- 四 (4- 氨基苯基 ) 卟啉 (TAPP) 作为引发剂引发聚合 - 己内酯 氩气保护下， 将 TAPP(16.85 mg, 。

21、0.025mmol)， 辛酸亚锡 (1.00 mg, 0.0025 mmol)， - 己内酯 (0.3 g, 6.14 mmol) 加入到 10 mL 圆底烧瓶中， 混合物在 110加热搅拌反应 72 h。 反应完成后， 固体溶解于二氯甲烷中， 在冷的甲醇中沉淀。 过滤， 乙醚洗涤， 真空干燥， 得到聚-己内酯化合物(TAPP-PCL)。 1H NMR (CDCl 3, 300MHz) : 1.39 (m, 2H), 1.63 (m, 4H), 2.30 (t, 2H), 4.05 (t, 2H), 7.94 (d, porphyrin), 8.14 (s, porphyrin), 8.85 。

22、(s, porphyrin)。经体积排阻色谱测定高分子的分子量为 12674。 0018 实施例 4 ： 以卟啉为核星形嵌段高分子的合成 将 MPEO-COOH (125 mg, 0.025mmol)， 实施例 1 制得的 TAPP-PCL (140 mg, 0.0052 mmol) 加入到圆底烧瓶中， 在 90加热真空抽气 4 h， 除去反应物中的少量溶剂和水汽。冷 却至室温， 将 4- 二甲氨基吡啶对甲基苯磺酸盐 (DTPS) (6 mg, 0.02 mmol) 溶解在 15 mL 二氯甲烷中， 然后加入到上述反应混合物中。将N, N- 二环乙基碳二亚胺 (12 mg, 0.06 mmol。

23、) 溶在 2 mL 二氯甲烷中后加入到上述溶液中。反应混合物室温下搅拌反应 4 d。将所 得溶液过滤， 滤液在乙醚中沉淀。过滤出沉淀， 真空干燥。将所得固体溶解在丙酮中， 加入 到水中。蒸除丙酮， 用截留分子量为 15000 的透析袋透析， 除去未反应的 mPEO-COOH。冷冻 干燥， 得到固体星形嵌段高分子 TAPP-PCL-mPEO。1H NMR (CDCl3, 300MHz) : 1.39 (m, 2H), 1.63 (m, 4H), 2.30 (t, 2H), 4.06 (t, 2H), 3.65 (s, 8.90H)。经体积排阻色 谱测定高分子的分子量为 47803。 0019 实。

24、施例 5 ： 以双嘧达莫为核星形嵌段高分子的合成 将 MPEO-COOH (125 mg, 0.025mmol)， 实施例 2 制得的 Dipyridamole-PCL (139 mg, 0.0052 mmol) 加入到圆底烧瓶中， 在 90加热真空抽气 4 h， 除去反应物中的少量溶剂和 水汽。冷却至室温， 将 4- 二甲氨基吡啶对甲基苯磺酸盐 (DTPS) (6 mg, 0.02 mmol) 溶解 在 15 mL 二氯甲烷中后加入到反应瓶的上述反应混合物中。再将N, N- 二环乙基碳二亚胺 说 明 书 CN 102228442 A CN 102228443 A4/5 页 6 (12 mg,。

25、 0.06 mmol) 溶在 2 mL 二氯甲烷中后加入到上述溶液中。混合物室温下搅拌反应 4 d。所得溶液过滤， 滤液在乙醚中沉淀。过滤出沉淀， 真空干燥。所得固体溶解在丙酮中， 加入到水中。蒸除丙酮， 用截留分子量为 15000 的透析袋透析， 除去未反应的 mPEO-COOH。 冷冻干燥得到固体星形嵌段高分子Dipyridamole-PCL-mPEO。 1H NMR (CDCl 3, 300MHz) : 1.39 (m, 2H), 1.63 (m, 4H), 2.30 (t, 2H), 4.06 (t, 2H), 3.65 (s, 8.89H)。 经体 积排阻色谱测定高分子的分子量为 4。

26、6927。 0020 实施例 6 ： 以卟啉为核星形嵌段高分子的合成 将MPEO-COOH (210 mg, 0.042mmol)， 实施例3制得的TAPP-PCL (127 mg, 0.01 mmol) 加入到圆底烧瓶中， 在 90加热真空抽气 4 h， 除去反应物中的少量溶剂和水汽。冷却至室 温， 将 4- 二甲氨基吡啶对甲基苯磺酸盐 (DTPS) (6 mg, 0.02 mmol) 溶解在 15 mL 二氯甲 烷中， 然后加入到上述反应混合物中。将N, N- 二环乙基碳二亚胺 (12 mg, 0.06 mmol) 溶 在 2 mL 二氯甲烷中后加入到上述溶液中。反应混合物室温下搅拌反应 。

27、4 d。将所得溶液 过滤， 滤液在乙醚中沉淀。过滤出沉淀， 真空干燥。将所得固体溶解在丙酮中， 加入到水中。 蒸除丙酮， 用截留分子量为15000的透析袋透析， 除去未反应的mPEO-COOH。 冷冻干燥， 得到 固体星形嵌段高分子 TAPP-PCL-mPEO。1H NMR (CDCl3, 300MHz) : 1.39 (m, 2H), 1.63 (m, 4H), 2.30 (t, 2H), 4.06 (t, 2H), 3.65 (s, 8.90H)。经体积排阻色谱测定高分 子的分子量为 32803。 0021 实施例 7 ： 负载紫杉醇的星形嵌段高分子 TAPP-PCL-mPEO 纳米微球的。

28、制备 将 10 mg 实施例 3 制得的星形嵌段高分子 TAPP-PCL-mPEO 纳米微球和 0.75 mg 紫杉醇 溶于 1 mL 乙醇中， 搅拌下加入到 2 mL 热水中 (50 )。冷至室温， 减压蒸除乙醇。用滤膜 (0.22 m) 过滤除掉没有包覆的紫杉醇 ( 紫杉醇在水溶液中的溶解度为 0.006 mg/mL， 紫 杉醇在水溶液会生成结晶)， 得到负载紫杉醇的星形高分子纳米微球。 经过动态光散射测定 这种纳米微球的粒径分布在 2060 nm， 纳米微球的载药量经高效液相色谱测定为 5%。 0022 实施例 8 ： 负载紫杉醇的嵌段高分子 Dipyridamole-PCL-mPEO 。

29、纳米微球的制备 将10 mg实施例4制得的星形嵌段高分子Dipyridamole-PCL-mPEO纳米微球和0.5 mg 紫杉醇溶于1 mL乙醇中， 搅拌下加入到2 mL热水中(50)。 冷至室温， 减压蒸除乙醇。 用 滤膜 (0.22 m) 过滤除掉没有包覆的紫杉醇 ( 紫杉醇在水溶液中的溶解度为 0.006 mg/ mL， 紫杉醇在水溶液会生成结晶 )， 得到负载紫杉醇的星形高分子纳米微球。经过动态光散 射测定这种纳米微球的粒径分布在 2060 nm， 纳米微球的载药量经高效液相色谱测定为 4 %。 0023 实施例 9 ： 负载紫杉醇的嵌段高分子 Dipyridamole-PCL-mPE。

30、O 纳米微球的制备 将10 mg实施例4制得的星形嵌段高分子Dipyridamole-PCL-mPEO纳米微球和0.4 mg 紫杉醇溶于1 mL乙醇中， 搅拌下加入到2 mL热水中(50)。 冷至室温， 减压蒸除乙醇。 用 滤膜 (0.22 m) 过滤除掉没有包覆的紫杉醇 ( 紫杉醇在水溶液中的溶解度为 0.006 mg/ mL， 紫杉醇在水溶液会生成结晶 )， 得到负载紫杉醇的星形高分子纳米微球。经过动态光散 射测定这种纳米微球的粒径分布在 2060 nm， 纳米微球的载药量经高效液相色谱测定为 3 %。 0024 实施例 10 ： 载有紫杉醇的星形高分子纳米微球的体外释放 取实施例 7 或。

31、 8 中制得的 1 mL 载有紫杉醇的星形高分子纳米微球的水溶液 ( 所含紫 说 明 书 CN 102228442 A CN 102228443 A5/5 页 7 杉醇的量为 0.5 mg) 放在透析袋 (Cut-off 分子量为 12000) 中， 然后将透析袋完全浸入 1 M 水杨酸钠溶液 (10 mL) 中， 在 37 C 搅拌下进行释放试验。每隔一定的时间取出 1 mL 释放介质。用高效液相色谱通过标准曲线的方法测定样品中阿霉素的含量。并根据含量来 计算释放的百分率， 结果见图1所示， 可以看出负载于其中的药物表现出持续释放的特性。 0025 实施例 11 ： 载有紫杉醇的星形高分子纳。

32、米微球的荧光标记功能 小鼠模型采用皮下注射的方式接种于 ICR 小鼠 ( 左侧腋下， 每只 0.2 ml)。种植后 7-8 天， 选择肿瘤体积 100 mm3左右的小鼠。取实施例 5 中制得的负载紫杉醇纳米微球， 注射入 小鼠体内通过近红外荧光成像的方法来诊断肿瘤的部位。注射入小鼠体内 12 小时后， 如图 2所示观察到纳米微球主要集中在肿瘤部位， 通过近红外活体成像仪(CRI, Inc., Woburn, MA) 中进行造影的方法可以用来诊断肿瘤的位置。 说 明 书 CN 102228442 A CN 102228443 A1/1 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102228442 A 。