一种顺铂长循环脂质体及其制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102525928 A (43)申请公布日 2012.07.04 CN 102525928 A *CN102525928A* (21)申请号 201210037920.1 (22)申请日 2012.02.20 A61K 9/127(2006.01) A61K 33/24(2006.01) A61K 47/24(2006.01) A61K 47/28(2006.01) A61K 47/34(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 中国药科大学 地址 211198 江苏省南京市江宁区龙眠大道 639 号 (72)发明人 尹莉芳 张书卉 朱。

2、春莉 张陆勇 王广基 (54) 发明名称 一种顺铂长循环脂质体及其制备方法 (57) 摘要 本发明涉及一种顺铂长循环脂质体及其制备 方法， 主要解决顺铂毒性大， 顺铂脂质体载药量低 的问题。该脂质体的制备依赖于带负电荷的磷脂 酰甘油衍生物与带正电荷的水合顺铂之间的静电 作用力。本发明的顺铂长循环脂质体粒径可以控 制在 120nm 左右， 具有较高的包封率与载药量以 及较好的稳定性， 且制备方法简单易行。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 1/1 。

3、页 2 1. 一种顺铂长循环脂质体的制备方法， 其特征在于先得到带有负电荷的磷脂材料， 再 制备带正电荷的水合顺铂溶液， 最后在水相体系中， 将带正电的水合顺铂和带负电荷的磷 脂材料通过静电作用， 制得顺铂长循环脂质体。 2. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于带负电荷的磷脂材料中含有带负电荷的磷脂 酰甘油脂质衍生物。 3. 如权利要求 2 所述的方法， 其特征在于磷脂酰甘油脂质衍生物选自于以下一种或几 种的组合 ： 二棕榈酰基磷脂酰甘油 (DPPG)、 二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油 (DMPG)、 二癸酰基磷 脂酰甘油 (DCPG)、 二硬脂酰基磷脂酰甘油 (DSPG) 和二油酰基磷脂酰甘油。

4、 (DOPG)。 4. 如权利要求 2 所述的方法， 其特征在于磷脂酰甘油脂质衍生物用量为 20 50。 5. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于磷脂材料中还包含电中性组分 ： 胆固醇、 大豆 磷脂酰胆碱 (SPC)、 甲氧基聚乙二醇磷脂酰乙醇胺 (mPEG-DSPE)。 6.如权利要求5所述的方法， 其特征在于胆固醇用量为715， SPC用量为30 60， mPEG-DSPE 用量为 7 15。 7. 如权利要求 1 所述的方法， 带正电荷的水合顺铂的制备， 其特征在于将顺铂溶解于 双蒸水中， 搅拌使其充分反应， 得水合顺铂。 8. 如权利要求 1 所述的方法， 带正电荷的水合顺铂的制。

5、备， 其特征在于将顺铂与硝酸 银溶解于双蒸水中， 反应后弃去沉淀， 得水合顺铂。 权 利 要 求 书 CN 102525928 A 2 1/4 页 3 一种顺铂长循环脂质体及其制备方法 0001 技术领域 ： 本发明涉及顺铂长循环脂质体及其制备方法。 0002 背景技术 ： 顺铂自 1978 年被批准为抗肿瘤药物后， 在临床的应用非常广泛。顺 铂可以单独或与其他药物联合使用来治疗不同的癌症， 如膀胱癌、 卵巢癌、 头颈癌以及肺癌 等。顺铂具有较高的细胞毒性， 一般认为， 其在进入细胞内部后被水解， 形成具有高活性的 水合顺铂。水合顺铂与 DNA 形成共轭物， 从而导致 DNA 二级结构发生变化。

6、， 阻碍 DNA 的转录 和复制， 最终导致细胞的凋亡。然而， 顺铂对肿瘤细胞缺乏特异性， 它在病灶杀灭肿瘤细胞 的同时， 也杀伤体内的正常细胞， 产生严重的毒副作用。 0003 脂质体作为药物载体安全无毒、 生物相容性好。 具有合适粒径， 高载药量的脂质体 可以被动靶向肿瘤组织， 降低药物毒性。而长循环脂质体更是能够避免脂质体被巨噬细胞 吞噬， 使脂质体顺利到达肿瘤组织。因此， 长循环脂质体具有越来越高的实际应用价值。将 顺铂制备成长循环脂质体能够降低顺铂毒副作用， 然而顺铂脂质体的制备面临两个难题。 第一， 顺铂亲脂性差且水溶性不佳， 在水中的溶解度 4时约 1mg/ml ； 第二， 顺铂。

7、只能通过 被动的方法载入脂质体内， 无法参照已上市的阿霉素脂质体 Doxil 等进行 pH 梯度主动载 药。上述两个原因通常造成顺铂脂质体的载药量较低。目前已经进入临床试验的顺铂脂质 体 SPI-077 通过加热增加顺铂的溶解度。SPI-077 制备过程中， 水化温度为 65。在此温 度下， 顺铂具有较高的溶解度， 约为 8mg/ml。但是此方法制备的顺铂长循环脂质体载药量 依然较低， 到达肿瘤部位后释药不足， 导致抗肿瘤活性降低。 有人将顺铂转化成顺铂衍生物 CDDP3， 它具有较高的水溶性， 且在氯离子存在下容易转化为 CDDP。然后通过静电作用力将 CDDP 载入脂质体或其他载体中。这一。

8、方法不仅解决了顺铂溶解性的问题， 同时静电作用力 能够提高脂质体的载药量， 但是制备方法相当繁琐。 有专利报道， 带正电荷的水合顺铂与带 负电荷的磷脂酰甘油衍生物在适当比例的乙醇水溶液中形成胶束， 再将胶束用磷脂材料包 裹形成脂质体， 该专利产品 Lipoplatin 目前已进行临床三期试验。因此， 利用带负电荷的 磷脂酰甘油衍生物来通过静电作用力实现顺铂高载药量的目的是可行的。 0004 发明内容 ： 本发明的目的是提供具有较高载药量的顺铂长循环脂质体及其一种更 为简单易行的制备方法。该脂质体的制备建立在 Lipoplatin 的基础上， 省略胶束的制备过 程， 直接制得脂质体。该脂质体的高。

9、载药量是通过带负电荷的磷脂材料与带正电荷的水合 顺铂静电作用实现的。 0005 本发明提供的顺铂长循环脂质体的制备方法 ： 0006 先得到带有负电荷的磷脂材料， 再制备带正电荷的水合顺铂溶液， 最后在水相体 系中， 将带正电的水合顺铂和带负电荷的磷脂材料通过静电作用， 制得顺铂长循环脂质体。 0007 上述顺铂长循环脂质体， 其特征在于， 带负电荷的磷脂材料中含有带负电荷的磷 脂酰甘油脂质衍生物。 0008 顺铂长循环脂质体， 其特征在于， 上述磷脂酰甘油脂质衍生物选自于以下一种或 几种的组合 ： 二棕榈酰基磷脂酰甘油 (DPPG)、 二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油 (DMPG)、 二癸酰基 磷脂酰。

10、甘油 (DCPG)、 二硬脂酰基磷脂酰甘油 (DSPG) 和二油酰基磷脂酰甘油 (DOPG)。 0009 顺铂长循环脂质体， 其特征在于， 带负电荷的磷脂材料的用量为 20 50。 说 明 书 CN 102525928 A 3 2/4 页 4 0010 顺铂长循环脂质体， 其特征在于， 磷脂材料还包含电中性组分 ： 胆固醇、 大豆磷脂 酰胆碱 (SPC)、 甲氧基聚乙二醇磷脂酰乙醇胺 (mPEG-DSPE)。 0011 顺铂长循环脂质体， 其特征在于， 胆固醇用量为 7 15， SPC 用量为 30 60， mPEG-DSPE 用量为 7 15。 0012 顺铂长循环脂质体， 其特征在于， 带。

11、正电荷的水合顺铂的制备， 是将顺铂溶解于双 蒸水中， 搅拌使其充分水合制得， 或者是将顺铂与硝酸银溶于双蒸水中， 反应后弃去沉淀制 得。 0013 更具体的， 本发明提供一种顺铂长循环脂质体的制备方法 ： 0014 a) 将适量的 DPPG， SPC， 胆固醇， mPEG-DSPE 置于 250ml 的茄形瓶中， 加入适量氯 仿甲醇21的混合溶液使磷脂材料溶解， 将茄形瓶接入旋转蒸发仪， 最大转速旋转蒸 发除去有机溶剂， 形成磷脂薄膜。磷脂膜真空干燥过夜， 除尽有机溶剂。 0015 b)将摩尔比DPPG顺铂为12.51量的顺铂置于西林瓶中， 加入适当体积的 双蒸水， 在 50， 转速为 300。

12、rpm 条件下恒温磁力搅拌器中搅拌 4h。或者将摩尔比 2 1 的 硝酸银溶液与顺铂溶液反应， 弃去沉淀， 得水合顺铂。 0016 c) 将上述所得水合顺铂溶液加入磷脂膜中， 50水化 30min 得顺铂长循环脂质 体。 附图说明 ： 0017 图 1 为实施例 5 顺铂长循环脂质体与顺铂注射剂体外释放曲线 0018 图 2 为实施例 5 顺铂长循环脂质体与顺铂注射剂体外细胞毒性试验数据曲线 具体实施方式 ： 0019 实施例 1 0020 a) 带负电荷磷脂薄膜的制备 0021 将 7.5mg 的 DPPG， 16mg 的 SPC， 4mg 胆固醇， 4.2mg 的 mPEG-DSPE 置于。

13、 250ml 的茄形 瓶中， 加入 15ml 氯仿甲醇 2 1 的混合溶液使磷脂材料溶解， 将茄形瓶接入旋转蒸发 仪， 最大转速旋转蒸发除去有机溶剂， 形成磷脂薄膜。 磷脂膜真空干燥过夜， 除尽有机溶剂。 0022 b) 水合顺铂制备 0023 将3mg的顺铂置于西林瓶中， 加入4ml的双蒸水， 在50， 转速为300rpm条件下恒 温磁力搅拌器中搅拌 4h。 0024 c) 顺铂长循环脂质体的制备 0025 将上述所得水合顺铂溶液加入磷脂膜中， 50水化 30min 得顺铂长循环脂质体。 0026 实施例 1- 实施例 5 的包封率和载药量测定按如下方法进行 ： 通过葡聚糖 G-50 柱 分。

14、离制备的顺铂长循环脂质体中的脂质体与游离药物。收集游离药物。脂质体破乳剂选用 5的 Triton X-100。按照中国药典 2010 版二部附录 VB 高效液相色谱法， 在 220nm 波长处 测定顺铂的峰面积， 另精密称取对照品适量， 同法测定， 以外标法计算顺铂的包封率和载药 量。 0027 实施例 1 顺铂长循环脂质体的包封率为 50， 载药量为 4.3。说明当 DPPG 用量 为 22， SPC 用量为 46， 胆固醇用量为 12， mPEG-DSPE 用量为 12时， 载药量较高， 载药 说 明 书 CN 102525928 A 4 3/4 页 5 量高于 SPI-077( 文献报道。

15、载药量为 1 )。 0028 实施例 2 0029 a) 带负电荷磷脂薄膜的制备 0030 将 11.3mg 的 DPPG， 16mg 的 SPC， 4mg 胆固醇， 4.2mg 的 mPEG-DSPE 置于 250ml 的茄 形瓶中， 加入 15ml 氯仿甲醇 2 1 的混合溶液使磷脂材料溶解， 将茄形瓶接入旋转蒸 发仪， 最大转速旋转蒸发除去有机溶剂， 形成磷脂薄膜。磷脂膜真空干燥过夜， 除尽有机溶 剂。 0031 b) 水合顺铂制备 0032 将3mg的顺铂置于西林瓶中， 加入4ml的双蒸水， 在50， 转速为300rpm条件下恒 温磁力搅拌器中搅拌 4h。 0033 c) 顺铂长循环脂。

16、质体的制备 0034 将上述所得水合顺铂溶液加入磷脂膜中， 50水化 30min 得顺铂长循环脂质体。 0035 本实施例中， 顺铂的包封率为 51， 载药量为 4.0。说明当 DPPG 用量为 29， SPC 用量为 42， 胆固醇用量为 10， mPEG-DSPE 用量为 11时载药量较高， 载药量高于 SPI-077( 文献报道载药量为 1 )。 0036 实施例 3 0037 a) 带负电荷磷脂薄膜的制备 0038 将 15mg 的 DPPG， 16mg 的 SPC， 4mg 胆固醇， 4.2mg 的 mPEG-DSPE 置于 250ml 的茄形 瓶中， 加入 15ml 氯仿甲醇 2 。

17、1 的混合溶液使磷脂材料溶解， 将茄形瓶接入旋转蒸发 仪， 最大转速旋转蒸发除去有机溶剂， 形成磷脂薄膜。 磷脂膜真空干燥过夜， 除尽有机溶剂。 0039 b) 水合顺铂制备 0040 将3mg的顺铂置于西林瓶中， 加入4ml的双蒸水， 在50， 转速为300rpm条件下恒 温磁力搅拌器中搅拌 4h。 0041 c) 顺铂长循环脂质体的制备 0042 将上述所得水合顺铂溶液加入磷脂膜中， 50水化 30min 得顺铂长循环脂质体。 0043 本实施例中， 顺铂的包封率为 56， 载药量为 4.0。说明当 DPPG 用量为 36， SPC 用量为 38， 胆固醇用量为 9， mPEG-DSPE 。

18、用量为 10时载药量较高， 载药量高于 SPI-077( 文献报道载药量为 1 )。 0044 实施例 4 0045 a) 带负电荷磷脂薄膜的制备 0046 将 30mg 的 DPPG， 32mg 的 SPC， 8mg 胆固醇， 8.4mg 的 mPEG-DSPE 置于 250ml 的茄形 瓶中， 加入 15ml 氯仿甲醇 2 1 的混合溶液使磷脂材料溶解， 将茄形瓶接入旋转蒸发 仪， 最大转速旋转蒸发除去有机溶剂， 形成磷脂薄膜。 磷脂膜真空干燥过夜， 除尽有机溶剂。 0047 b) 水合顺铂制备 0048 将6mg的顺铂置于西林瓶中， 加入4ml的双蒸水， 在50， 转速为300rpm条件。

19、下恒 温磁力搅拌器中搅拌 4h。 0049 c) 顺铂长循环脂质体的制备 0050 将上述所得水合顺铂溶液加入磷脂膜中， 50水化 30min 得顺铂长循环脂质体。 0051 本实施例中， 顺铂的包封率为 73， 载药量为 5.2。说明当 DPPG 用量为 36， 说 明 书 CN 102525928 A 5 4/4 页 6 SPC 用量为 38， 胆固醇用量为 9， mPEG-DSPE 用量为 10时， 适当提高磷脂和顺铂的浓 度， 包封率和载药量提高。 0052 实施例 5 0053 a) 带负电荷磷脂薄膜的制备 0054 将 30mg 的 DPPG， 32mg 的 SPC， 8mg 胆固。

20、醇， 8.4mg 的 mPEG-DSPE 置于 250ml 的茄形 瓶中， 加入 15ml 氯仿甲醇 2 1 的混合溶液使磷脂材料溶解， 将茄形瓶接入旋转蒸发 仪， 最大转速旋转蒸发除去有机溶剂， 形成磷脂薄膜。 磷脂膜真空干燥过夜， 除尽有机溶剂。 0055 b) 水合顺铂制备 0056 将 10mg 的顺铂置于西林瓶中， 加入 10ml 的双蒸水， 在 50中溶解， 再将 153mg 硝 酸银溶于 10ml 双蒸水中， 配置浓度为 90mM 的硝酸银溶液， 取 720l 的硝酸银溶液加入上 述顺铂溶液中， 50条件下充分反应， 弃去沉淀， 即得水合顺铂。 0057 c) 顺铂长循环脂质体的。

21、制备 0058 将上述所得水合顺铂溶液加入磷脂膜中， 50水化 30min 得顺铂长循环脂质体。 0059 本实施例中， 顺铂的包封率为 80， 载药量为 9.0。说明当 DPPG 用量为 34， SPC 用量为 36， 胆固醇用量为 9， mPEG-DSPE 用量为 10时， 应用硝酸银沉淀法制备水 合顺铂可使包封率和载药量提高。 0060 用激光散射法测定实施例 5 中顺铂长循环脂质体的粒径和粒径分布。测定条件 ： 波长 633nm， 温度 25， 角度为 90。 0061 从测定结果可知， 顺铂长循环脂质体的平均粒径为 118nm。 0062 实施例 5 中， 测得顺铂长循环脂质体的表面。

22、带负电荷， 大小为 -44mv。 0063 图 1 是实施例 5 制备的顺铂长循环脂质体和顺铂注射剂的体外释放曲线。体外 释放测定方法 ： 精密移取新鲜制备的经过纯化的顺铂脂质体 2ml 于透析袋中 (30KD)。放入 20ml释放介质中， 分别于0、 1、 2、 4、 8、 16、 24、 36、 48、 72h取样1ml， 同时补充新鲜介质1ml， 按 中国药典 2010 顺铂含量测定方法测定顺铂峰面积， 计算累计释放百分率。 0064 试验结果表明 ： 顺铂长循环脂质体体外具有缓释效果。 0065 图2是实施例5制备的顺铂长循环脂质体和顺铂注射剂体外细胞毒性试验数据曲 线。测定方法 ： 。

23、将 A549 肺癌细胞用胰酶消化稀释后接种到 96 孔板， 每孔接种 90L 含细 胞 5000 个， 培养 24h ； 细胞贴壁后， 将不同浓度的脂质体依次加到 96 孔板上， 每孔 10L， 终浓度为 100、 50、 10、 2、 1、 0.1mg/L， 每个浓度设为 5 个复孔， 每块板设一组正常对照组 ( 加 10L 纯净水， 不含脂质体 ) 和空白凋零孔 ( 只加培养液， 不含细胞和脂质体 )， 在培养箱内 培养 48h。之后弃去上清液， 然后每孔加 MTT 溶液 20L 继续孵育 4h， 终止培养。小心吸弃 孔内培养上清液， 再每孔加 100L 溶解液， 振荡使结晶物充分溶解， 最后进行比色。选择 570nm波长， 在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值， 记录结果。 细胞生长抑制率(1-A实 验 /A 对照 )*100。实验结果表明 ： 顺铂注射剂的 IC50值为 0.00212mg/ml， 顺铂长循环脂 质体的 IC50值为 0.00214mg/ml。 0066 说明顺铂长循环脂质体有不低于顺铂注射剂的杀死肿瘤细胞的能力。 说 明 书 CN 102525928 A 6 1/1 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102525928 A 7 。