海藻酸盐壳聚糖酰基衍生物微胶囊及其制备和应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102475691 B (45)授权公告日 2014.04.16 CN 102475691 B (21)申请号 201010566996.4 (22)申请日 2010.11.30 A61K 9/50(2006.01) A61K 35/12(2006.01) A61K 35/407(2006.01) A61K 35/55(2006.01) C12N 11/10(2006.01) (73)专利权人 中国科学院大连化学物理研究所 地址 116023 辽宁省大连市中山路 457 号 (72)发明人 马小军 郑国爽 于炜婷 谢红国 刘袖洞 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标。

2、代理有限 公司 21002 代理人 马驰 CN 101850228 A,2010.10.06, CN 1407103 A,2003.04.02, CN 101466360 A,2009.06.24, CN 101319210 A,2008.12.10, 曹根庭等 . 聚电解质微胶囊的制备及其包埋 释放行为 .材料研究学报 .2009, 第 23 卷 ( 第 02 期 ), 雄鹰等 . 海藻酸钠 / 壳聚糖微胶囊包埋人卵 巢癌细胞腹腔移植的实验研究 .中华器官移植 杂志 .2003, 第 24 卷 ( 第 02 期 ), 王岸娜等 . 壳聚糖海藻酸钠微胶囊制备研 究 .河南工业大学学报 ( 自然。

3、科学版 ) .2007, 第 28 卷 ( 第 06 期 ), 孙万成等 . 壳聚糖 / 海藻酸钠微胶囊固定化 磷脂酶 A_1 及其结构考察 . 食品科学 .2005, 第 26 卷 ( 第 09 期 ), 何荣军等 . 海藻酸钠 / 壳聚糖微胶囊的制备 及其应用研究进展 .食品与机械 .2010, 第 26 卷 ( 第 02 期 ), (54) 发明名称 海藻酸盐 - 壳聚糖酰基衍生物微胶囊及其制 备和应用 (57) 摘要 本发明涉及一种海藻酸盐 - 壳聚糖酰基衍 生物微胶囊产品， 其特征在于微胶囊产品为粒径 10-2000 微米的球形微胶囊， 其结构分为微胶囊 膜与内核两部分， 其中， 微。

4、胶囊膜由海藻酸盐、 壳 聚糖、 壳聚糖酰基衍生物通过层层自主装形成聚 电解质复合水凝胶膜， 内核为含有生物活性物质 的液体或水凝胶环境。这种微胶囊产品主要用于 细胞移植、 细胞培养、 蛋白、 核酸等生物活性物质 的包埋载体。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 酒向飞 权利要求书 2 页 说明书 6 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书2页 说明书6页 附图1页 (10)授权公告号 CN 102475691 B CN 102475691 B 1/2 页 2 1. 海藻酸盐 - 壳聚糖酰基衍生物微胶囊， 其特征在于 ： 微胶囊结构分为。

5、微胶囊膜与内 核两部分 ： 其中， 微胶囊膜为由壳聚糖、 海藻酸盐、 壳聚糖酰基衍生物形成的聚电解质复合 水凝胶膜， 内核为含有细胞的海藻酸盐液体或海藻酸盐水凝胶环境 ； 微胶囊产品为粒径10-2000微米的球形微胶囊 ； 膜厚度在0.1-100微米， 组成膜的海藻 酸盐分子量 10kDa 2000kDa， 壳聚糖材料的脱乙酰度 70-98， 分子量为 1KDa 500KDa， 壳聚糖酰基衍生物分子量 1KDa 800KDa， 壳聚糖、 海藻酸盐、 壳聚糖酰基衍生物三者质量 比为 0 1 0.1-10 1 10 ； 内核中海藻酸盐浓度在 1-50g/L ； 微胶囊产品中的壳聚糖酰基衍生物为 N。

6、- 酰基化壳聚糖， 其单体结构式为 ： 其中， -R 代表甲酰、 乙酰、 丙酰、 丁酰、 戊酰或己酰， 酰基衍生物的取代度 10-60， 壳聚 糖骨架材料的分子量为 1-400KDa， 脱乙酰度为 90-98 ； 微胶囊膜由壳聚糖、 海藻酸盐、 壳聚糖酰基衍生物通过聚电解质络合反应形成水凝胶 膜， 产品的制备步骤为 ： 1) 制备包埋有活细胞的海藻酸盐凝胶微球， 称之为 A 微球 ； 2) 将步骤 1) 中的 A 微球浸入壳聚糖溶液中， A 微球与壳聚糖溶液体积比为 1 1 1 40， 反应 1-60 分钟， 此时得到海藻酸钠 - 壳聚糖微胶囊， 称之为 B 微球， 取出用生理盐 水洗涤 ； 。

7、壳聚糖溶液的配制方法是 ： 壳聚糖溶于 pH 为 5.5-7.0 的醋酸 - 醋酸钠缓冲液， 壳聚糖 浓度为 0.1-15g/L ； 3) 将步骤 2) 中的 B 微球浸入碱金属海藻酸盐溶液中， 海藻酸盐浓度为 0.1-5g/L， B 微 球与碱金属海藻酸盐溶液体积比范围为 1 1 1 40， 反应 1-60 分钟， 此时得到的微胶 囊为 C 微球， 取出用生理盐水洗涤 ； 4)交替重复步骤2)和步骤3)的过程1-5次， 此时得到的微胶囊为D微球， 取出用生理 盐水洗涤 ； 5) 将步骤 1) 或 2) 或 3) 或 4) 中的 A 或 B 或 C 或 D 微球浸入到壳聚糖酰基衍生物溶液 中，。

8、 微球与壳聚糖酰基衍生物溶液体积比范围为11140， 反应1-60分钟， 此时得到 内部凝胶核心的微胶囊， 称之为 E 微球， 取出用生理盐水洗涤 ； 壳聚糖酰基衍生物的配制方法是 ： 壳聚糖酰基衍生物溶于生理盐水、 HEPES 缓冲液、 PBS 缓冲液， 或 pH 为 5.5-7.0 的醋酸 - 醋酸钠缓冲液， 壳聚糖酰基衍生物浓度为 0.1-20g/ L ； 6) 将步骤 5) 中的 E 微球浸入到碱金属海藻酸盐溶液中， 重复步骤 3)， 得到表面中和的 内部凝胶核心的微胶囊为 F 微球 ； 7) 将步骤 6) 中的 F 微球浸入有机金属螯合剂溶液中， 液化微胶囊内部的海藻酸盐凝 胶， F。

9、 微球与有机金属螯合剂溶液体积比范围为 1 1 1 40， 反应 1-60 分钟， 取出用生 权 利 要 求 书 CN 102475691 B 2 2/2 页 3 理盐水洗涤， 此时得到内部液态核心的微胶囊为 G 微球 ； 海藻酸盐凝胶微球为二价金属钙、 钡或锌中的一种或二种以上的海藻酸盐水凝胶 ； 步骤 3) 和 6) 用于中和表面电荷的碱金属海藻酸盐为钾盐或钠盐， 分子量分布为 10KDa 2000KDa， 海藻酸盐浓度为 0.1-5g/L ； 参与液化反应的有机金属螯合剂溶液为 40-70mmol/L 的柠檬酸钠或 50-200mmol/L 的 EDTA。 2. 按照权利要求 1 所述的。

10、微胶囊， 其特征在于 ： 微胶囊产品的膜成分中的海藻酸盐为 海藻酸的钾盐或钠盐。 3. 按照权利要求 1 所述的微胶囊， 其特征在于 ： 微胶囊产品的内核中海藻酸盐凝胶为 二价金属钙、 钡或锌中的一种或二种以上的海藻酸盐水凝胶， 海藻酸盐溶液为海藻酸的钾 盐或钠盐溶液。 4. 一种权利要求 1 所述的微胶囊用于细胞的包埋的用途。 5. 按照权利要求 4 所述的微胶囊用于细胞的包埋的用途， 其特征在于 ： 所述细胞为人 或哺乳动物来源的离体的胰岛细胞、 肝细胞、 甲状腺细胞、 甲状旁腺细胞、 肾上腺髓质细胞， 细胞系细胞， 基因工程细胞， 干细胞或干细胞分化的各种细胞。 权 利 要 求 书 CN。

11、 102475691 B 3 1/6 页 4 海藻酸盐 - 壳聚糖酰基衍生物微胶囊及其制备和应用 技术领域 0001 本发明涉及一种微胶囊产品， 具体地说是一种用于生物活性物质包埋的海藻酸 盐 - 壳聚糖酰基衍生物微胶囊产品。 背景技术 0002 20 世纪 60 年代， Chang 报道了半透膜微胶囊， 指出用其包埋蛋白质、 酶等生物活 性物质和细胞， 可保持生物物质活性 Chang TMS.Semipermeablemicrocapsules， Science， 1964， 146 ： 524-525。20 世纪 80 年代初， Lim 和 Sun 针对组织 / 细胞功能缺损性疾病 ( 如。

12、 糖尿病 )， 成功制备了海藻酸钠 /- 聚赖氨酸 (alginate/-polylysine) 半透膜微胶囊 (简称-APA微胶囊)， 包封Wistar大鼠胰岛细胞并移植入糖尿病WistarLewis大鼠体内， 分泌释放胰岛素以调控血糖量Lim F， Sun A M.Microencapsulated isletsbioartificial endocrine pancreas， Science， 1980， 210 ： 908-910。由此推动了微囊化技术相关材料和 制备方法研究的快速发展， 在细胞移植、 药物释放和基因治疗等生物医学领域的临床前研 究中得到广泛应用 Wang W， Liu。

13、 XD， Ma XJ， et al.Microencapsulation using natural polysaccharides for drugdelivery and cell implantation， J.Mater.Chem.， 2006， 16 ： 3252-3267。在众多的生物微胶囊中， 海藻酸钠 - 聚赖氨酸微胶囊使用较多， 但由于 聚赖氨酸价格昂贵 (300-400US$/g)， 加之材料固有的生物相容性差， 具有一定毒性， 这极 大地限制了海藻酸钠 - 聚赖氨酸微胶囊在临床上的应用 Strand B L， Ryan TL， Veld P I， et al.Cell T。

14、ransplant.， 2001， 10 ： 263-275。壳聚糖是取自天然的多糖材料， 因其成 本低， 成膜性能好， 膜机械强度高， 而被研究者看好用于聚赖氨酸替代品， 用于细胞包埋用 微胶囊的制备 L.Baruch， M.Machluf， Alginate-chitosan complex coacervation for cell encapsulation ： Effecton mechanical properties and on long-term viability， Biopolymers 82(2006) ： 570-579。但现有用于细胞包埋的壳聚糖微胶囊因其具有很大的。

15、 表面粗糙度和表面电荷， 导致移植体内后易引起蛋白吸附， 进一步激发机体纤维化反应。 发明内容 0003 针对上述问题， 本发明提出一种海藻酸盐 - 壳聚糖酰基衍生物微胶囊及其制备和 应用。 0004 技术方案 ： 0005 本发明将酰基化修饰的壳聚糖用于生物微胶囊的制备， 发明了一种新型的用于生 物活性物质包埋的海藻酸盐 - 壳聚糖酰基衍生物聚电解质络合微胶囊产品， 在保证微胶囊 强度和免疫隔离性能的前提下， 解决表面粗糙度和表面电荷的问题。 本发明的微胶囊产品， 微胶囊结构分为微胶囊膜与内核两部分 ： 其中， 微胶囊膜由壳聚糖、 海藻酸盐、 壳聚糖酰基 衍生物形成的聚电解质复合水凝胶膜， 。

16、内核为含有细胞的海藻酸盐液体或海藻酸盐水凝胶 环境。 0006 本发明的微胶囊产品为粒径 10-2000 微米的球形微胶囊 ； 膜厚度在 0.1-100 微 说 明 书 CN 102475691 B 4 2/6 页 5 米， 组成膜的海藻酸盐分子量 10kDa 2000kDa( 例如 ： 50kDa-200kDa ； 200kDa-500kDa ； 600kDa-1000kDa ； 1000kDa-2000kDa)， 壳 聚 糖 材 料 的 脱 乙 酰 度 70-98 ， 分 子 量 为 1KDa 500KDa( 例如 ： 1kDa-50kDa ； 10kDa-100kDa ； 120kDa-。

17、300kDa ； 350kDa-500kDa)， 壳 聚 糖 酰 基 衍 生 物 分 子 量 1KDa 800KDa( 例 如 ： 1kDa-50kDa ； 10kDa-100kDa ； 120kDa-300kDa ； 350kDa-500kDa)， 壳聚糖、 海藻酸盐、 壳聚糖酰基衍生物三者质量比为 010.1-10110， 内核中海藻酸盐浓度在1-50g/L， 内核中细胞占据内核的体积百 分比为 10-98。 0007 微胶囊产品中的壳聚糖酰基衍生物为 N- 酰基化壳聚糖， 其单体结构式为 ： 0008 0009 其中， -R 代表甲酰、 乙酰、 丙酰、 丁酰、 戊酰、 己酰， 酰基衍生物。

18、的取代度 10-60， 壳聚糖骨架材料的分子量为 1-400KDa， 脱乙酰度为 90-98。 0010 微胶囊产品的膜成分中的海藻酸盐为海藻酸的钾盐或钠盐。 0011 微胶囊产品的内核中海藻酸盐凝胶为二价金属钙、 钡或锌中的一种或二种以上的 海藻酸盐水凝胶， 海藻酸盐溶液为海藻酸的钾盐或钠盐溶液。 0012 微胶囊产品中微胶囊膜由壳聚糖、 海藻酸盐、 壳聚糖酰基衍生物通过聚电解质络 合反应形成水凝胶膜， 产品的制备步骤为 ： 0013 1) 制备包埋有活细胞的海藻酸盐凝胶微球， 称之为 A 微球 ； 0014 2) 将步骤 1) 中的 A 微球浸入壳聚糖溶液中， A 微球与壳聚糖溶液体积比为。

19、 1 1 1 40， 反应 1-60 分钟， 此时得到海藻酸钠 - 壳聚糖微胶囊， 称之为 B 微球， 取出 用生理盐水洗涤 ； 0015 壳聚糖溶液的配制方法是 ： 壳聚糖溶于 pH 为 5.5-7.0 的醋酸 - 醋酸钠缓冲液， 壳 聚糖浓度为 0.1-1.5g/L ； 0016 3) 将步骤 2) 中的 B 微球浸入碱金属海藻酸盐溶液中 ( 海藻酸盐浓度为 0.1-5g/ L)， B 微球与碱金属海藻酸盐溶液体积比范围为 1 1 1 40， 反应 1-60 分钟， 此时得到 的微胶囊为 C 微球， 取出用生理盐水洗涤 ； 0017 4)交替重复步骤2)和步骤3)的过程1-5次， 此时得到。

20、的微胶囊为D微球， 取出用 生理盐水洗涤 ； 0018 5) 将步骤 1) 或 2) 或 3) 或 4) 中的 A 或 B 或 C 或 D 微球浸入到壳聚糖酰基衍生物 溶液中， 微球与壳聚糖酰基衍生物溶液体积比范围为11140， 反应1-60分钟， 此时 得到内部凝胶核心的微胶囊， 称之为 E 微球， 取出用生理盐水洗涤 ； 0019 壳聚糖酰基衍生物的配制方法是 ： 壳聚糖酰基衍生物溶于生理盐水、 HEPES 缓 冲液、 PBS 缓冲液， 或 pH 为 5.5-7.0 的醋酸 - 醋酸钠缓冲液， 壳聚糖酰基衍生物浓度为 0.1-20g/L ； 0020 6) 将步骤 5) 中的 E 微球浸入。

21、到碱金属海藻酸盐溶液中， 重复步骤 3)， 得到表面中 说 明 书 CN 102475691 B 5 3/6 页 6 和的内部凝胶核心的微胶囊为 F 微球 ； 0021 7)将步骤6)中的F微球浸入有机金属螯合剂溶液中， 液化微胶囊内部的海藻酸盐 凝胶， F 微球与有机金属螯合剂溶液体积比范围为 1 1 1 40， 反应 1-60 分钟， 取出用 生理盐水洗涤， 此时得到内部液态核心的微胶囊为 G 微球。 0022 海藻酸盐凝胶微球为二价金属钙、 钡或锌中的一种或二种以上海藻酸盐水凝胶 ； 0023 用于中和表面电荷的碱金属海藻酸盐为钾盐或钠盐， 分子量分布为 10KDa 2000KDa， 海。

22、藻酸盐浓度为 0.1-5g/L。 0024 参与液化反应的有机金属螯合剂溶液为 40-70mmol/L 的柠檬酸钠或 50-200mmol/ L 的 EDTA。 0025 本发明的微胶囊产品用于细胞的包埋。 0026 其中， 细胞为人或哺乳动物来源的离体的胰岛细胞、 肝细胞、 甲状腺细胞、 甲状旁 腺细胞、 肾上腺髓质细胞具有分泌生物活性物质功能的细胞， 细胞系细胞， 基因工程细胞， 干细胞或干细胞分化的各种细胞 ； 0027 本发明的有益效果 ： 0028 1、 与传统的海藻酸钠-聚赖氨酸微胶囊(APA微胶囊)和海藻酸钠-壳聚糖微胶囊 (ACA微胶囊)相比， 本发明的这种新型海藻酸盐-壳聚糖。

23、-壳聚糖酰基衍生物微胶囊产品， 其微胶囊膜的表面粗糙度显著低于 APA 微胶囊和 ACA 微胶囊， 显示出更佳的生物相容性。 0029 2、 本发明产品的微胶囊膜在保持优良生物相容性的同时， 兼顾了优越的膜强度， 能保证作为组织细胞移植、 细胞培养应用过程中膜的完整性。 0030 3、 本发明产品的微胶囊膜具有优越的免疫隔离性能， 用于异种组织细胞移植时， 能保持免疫隔离性能， 即微囊内包埋的细胞不能出微胶囊， 微囊外的抗体分子、 补体分子、 免疫细胞不能进入微胶囊内杀死细胞， 同时细胞代谢分泌的活性成分能自由进出微胶囊。 0031 4、 本发明产品的制备过程条件温和， 壳聚糖酰基衍生物可溶于。

24、生理盐水中， 有利 于细胞的活性保持。 附图说明 0032 图 1 为实施例 1 和比较例 1 及比较例 2 中海藻酸盐 - 壳聚糖酰基衍生物 (AC乙酰) 膜及 AC 膜、 AP 膜的表面粗糙度比较结果。 0033 图 2 为实施例 1 中新型海藻酸盐 - 壳聚糖 - 壳聚糖酰基衍生物微胶囊产品小鼠腹 腔移植 1 个月后回收的微胶囊光学照片 ( 图中标尺为 100m)。 0034 图 3 为比较例 1 中传统的 ACA 微胶囊小鼠腹腔移植 1 个月后回收的微胶囊光学照 片 ( 图中标尺为 100m)。 具体实施方式 0035 形成海藻酸盐凝胶微球的方式为静电液滴法 ( 参考文献 ： In V。

25、ivo Culture ofEncapsulated Endostatin-Secreting Chinese Hamster Ovary Cells for Systemic Tumor Inhibition.HumanGene Therapy.2007， 18 ： 474-481)、 锐孔挤出法 ( 参考文献 ： 一种 高经济鱼类微球开口饵料的制备方法， 中国发明专利， 200510136769.7)、 乳化 - 外部凝胶 化法(参考文献 ： Preparation of lactic acid bacteria-enclosing alginate beads in 说 明 书 CN 1。

26、02475691 B 6 4/6 页 7 emulsion system ： effect of preparationparameters on bead characteristics， Polym. Bull.， 2009， 63 ： 599-607)、 乳化 - 内部凝胶化法 ( 参考文献 ： 乳化 - 内部凝胶化工艺制备 固定化酵母微胶囊， 化工学报， 2009， 60(3) ： 710-717)或膜乳化法(参考文献 ： Preparation of uniform calcium alginate gel beads by membrane emulsificationcouple。

27、d with internal gelation。Journal ofApplied Polymer Science， 2003， 87(5) ： 848-852)。 0036 实施例 1 0037 1) 无菌条件下通过高压静电法制备海藻酸钙凝胶微球。 0038 2) 将微球浸入乙酰基改性壳聚糖溶液中 ( 壳聚糖骨架分子量 50kDa， 乙酰基取代 度 40， 溶液由生理盐水配制， 浓度 5g/L)， 微球与壳聚糖溶液体积比为 1 10， 反应 20 分 钟， 生理盐水洗涤后再与0.2海藻酸钠溶液反应10分钟， 生理盐水洗涤， 制备成AC乙酰A微 胶囊。 0039 3)制备成的AC乙酰A聚电解。

28、质络合膜用表面轮廓仪测定膜的表面粗糙度， 结果显示 膜表面粗糙度最小 429nm， 明显低于同样方法制备的比较例中的 APA 膜和 ACA 膜 ( 见图 1) 0040 4) 将 AC乙酰A 微胶囊用注射器植入小鼠腹腔， 一个月后回收， 发现生理盐水冲洗小 鼠腹腔即可冲刷下来， 微胶囊具有良好强度， 无破损， 微胶囊表面光滑， 表面无纤维化包裹 现象 ( 见图 2)。 0041 比较例 1 0042 1) 将实施例 1 中制备的海藻酸钙凝胶微球浸入壳聚糖溶液中 ( 壳聚糖分子量 50kDa， 脱乙酰度 95， 壳聚糖溶于 pH 为 6.5 的醋酸 - 醋酸钠缓冲液， 壳聚糖浓度为 5g/L)，。

29、 微球与壳聚糖溶液体积比为 1 10， 反应 20 分钟， 生理盐水洗涤后再与 0.2海藻酸钠溶 液反应 10 分钟， 生理盐水洗涤， 制备成 ACA 微胶囊。 0043 2) 制备成的 ACA 聚电解质络合膜用表面轮廓仪测定膜的表面粗糙度， 结果显示膜 表面粗糙度为 15720 明显高于实施例 1 结果 AC乙酰A 聚电解质络合膜 ( 见图 1)。 0044 3) 将 ACA 微胶囊用注射器植入小鼠腹腔， 一个月后回收， 发现生理盐水冲洗小鼠 腹腔难以将 ACA 微胶囊冲刷下来， 微胶囊表面呈现明显的纤维化包裹现象 ( 见图 3)。 0045 比较例 2 0046 1)将实施例1中制备的海藻。

30、酸钙凝胶微球浸入聚赖氨酸溶液中(聚赖氨酸分子量 20kDa， 浓度 0.5g/L)， 微球与聚赖氨酸溶液体积比为 1 10， 反应 20 分钟， 生理盐水洗涤后 再与 0.2海藻酸钠溶液反应 10 分钟， 生理盐水洗涤， 制备成 APA 微胶囊。 0047 2) 制备成的 APA 聚电解质络合膜用表面轮廓仪测定膜的表面粗糙度， 结果显示膜 表面粗糙度为 16126， 明显高于实施例 1 结果 AC乙酰A 聚电解质络合膜 ( 见图 1)。 0048 实施例 2 0049 1) 锐孔挤出法制备包埋有猪肝细胞的海藻酸钙凝胶微球， 微球中细胞含量 5107/ml 微球。 0050 2) 将微球先后浸入。

31、壳聚糖 ( 壳聚糖分子量 20kDa， 脱乙酰度 90， 壳聚糖溶于 pH 为 6.8 的醋酸 - 醋酸钠缓冲液， 壳聚糖浓度为 4g/L) 和甲酰基改性壳聚糖 ( 壳聚糖骨架分 子量 60kDa， 甲酰基取代度 30， 溶于 pH 为 6.8 的醋酸 - 醋酸钠缓冲液， 浓度为 4g/L) 溶液 中， 微球与溶液体积比为 1 10， 反应 20 分钟， 生理盐水洗涤后再与 0.2海藻酸钠溶液反 说 明 书 CN 102475691 B 7 5/6 页 8 应 10 分钟， 生理盐水洗涤， 制备成 ACC甲酰A 微胶囊。 0051 3) 制备成的包埋有猪肝细胞的 ACC甲酰微胶囊制备成体外人工。

32、肝系统， 用于肝衰狗 的动物模型， 结果显示， 移植 4 天后， 肝衰小鼠的谷丙转氨酶、 谷草转氨酶水平均恢复到正 常水平， 血氨指标恢复正常， 狗的肝衰症状得以纠正， ACC甲酰A 微胶囊在人工肝系统保持形 态完整， 血液灌流后未发现蛋白吸附现象。 0052 实施例 3 0053 1) 高压静电法制备包埋有猪胰岛细胞的海藻酸钙凝胶微球， 每个微球中含有 1-2 个胰岛。 0054 2) 将微球先后浸入壳聚糖 ( 壳聚糖分子量 40kDa， 脱乙酰度 98， 壳聚糖溶于 pH 为6.5的醋酸-醋酸钠缓冲液， 浓度为5g/L)， 0.2海藻酸钠溶液和乙酰基改性壳聚糖(壳 聚糖骨架分子量60kDa。

33、， 乙酰基取代度50， 溶于生理盐水中， 浓度5g/L)溶液中， 微球与溶 液体积比为 1 10， 反应 20 分钟， 生理盐水洗涤后再与 0.2海藻酸钠溶液反应 10 分钟， 生理盐水洗涤， 55mM 柠檬酸钠液化后， 生理盐水洗涤， 制备成 ACC乙酰A 微胶囊。 0055 3) 制备成的 ACC乙酰A 微胶囊用于糖尿病大鼠模型的细胞治疗， 通过腹腔移植， 大 鼠血糖水平在移植后1天即恢复正常水平， 糖尿病症状得以显著改善， 体内移植6个月后回 收， 发现微胶囊完整， 微胶囊表面光滑， 表面无纤维化包裹现象， 且微囊内胰岛细胞保持胰 岛素双硫腙染色阳性。 0056 实施例 4 0057 1。

34、) 高压静电法制备包埋有大鼠甲状腺细胞的海藻酸钙凝胶微球， 微球中细胞含量 3107/ml 微球。 0058 2) 将微球先后浸入壳聚糖 ( 壳聚糖分子量 100kDa， 脱乙酰度 95， 壳聚糖溶于 pH 为 6.0 的醋酸 - 醋酸钠缓冲液， 浓度为 5g/L) 和丙酰基改性壳聚糖 ( 壳聚糖骨架分子量 20kDa， 丙酰基取代度 40， 溶于 PBS 缓冲液中， 浓度 5g/L) 溶液中， 微球与溶液体积比为 1 10， 反应 20 分钟， 生理盐水洗涤后再与 0.2海藻酸钠溶液反应 10 分钟， 生理盐水洗 涤， 55mM 柠檬酸钠液化后， 生理盐水洗涤， 制备成 ACC丙酰A 微胶囊。

35、。 0059 3)制备成的包埋有大鼠甲状腺细胞的ACC丙酰A微胶囊用于异种大鼠甲低模型三角 肌移植， 疾病大鼠的甲低症状得以纠正， T3， T4 水平恢复正常， ACC丙酰A 微胶囊移植三个月 后回收， 回收到形态保持完整的 ACC丙酰A 微胶囊， 表面没有纤维化现象。 0060 实施例 5 0061 1) 高压静电法制备包埋有牛肾上腺髓质细胞的海藻酸钙凝胶微球， 微球中细胞含 量 2107/ml 微球。 0062 2) 将微球先后浸入壳聚糖 ( 壳聚糖分子量 10kDa， 脱乙酰度 90， 壳聚糖溶于 pH 为 6.8 的醋酸 - 醋酸钠缓冲液， 浓度为 5g/L) 和丁酰基改性壳聚糖 ( 。

36、壳聚糖骨架分子量 10kDa， 丙酰基取代度 30， 溶于， 壳聚糖溶于 pH 为 6.8 的醋酸 - 醋酸钠缓冲液， 浓度为 5g/ L)溶液中， 微球与溶液体积比为110， 反应20分钟， 生理盐水洗涤后再与0.2海藻酸钠 溶液反应 10 分钟， 生理盐水洗涤， 55mM 柠檬酸钠液化后， 生理盐水洗涤， 制备成 ACC丁酰A 微 胶囊。 0063 3)制备成的包埋有牛肾上腺髓质细胞的ACC丁酰A微胶囊用于帕金森疾病模型猴的 颅内定点移植， 疾病猴的偏瘫等帕金森症状得以纠正， ACC丁酰A 微胶囊移植六个月后回收， 说 明 书 CN 102475691 B 8 6/6 页 9 回收到形态保。

37、持完整的 ACC丁酰A 微胶囊， 表面没有纤维化现象。 0064 实施例 6 0065 1) 高压静电法制备包埋有牛肾上腺髓质细胞的海藻酸钙凝胶微球， 微球中细胞含 量 1107/ml 微球。 0066 2) 将微球先后浸入壳聚糖 ( 壳聚糖分子量 70kDa， 脱乙酰度 98， 壳聚糖溶于 pH 为6.3的醋酸-醋酸钠缓冲液， 浓度为5g/L)， 0.2海藻酸钠溶液和戊酰基改性壳聚糖(壳 聚糖骨架分子量 20kDa， 戊酰基取代度 40， 溶于 HEPES 缓冲液中， 浓度 5g/L) 溶液中， 微球 与溶液体积比为 1 10， 反应 20 分钟， 生理盐水洗涤后再与 0.2海藻酸钠溶液反应。

38、 10 分 钟， 生理盐水洗涤， 制备成 ACC戊酰A 微胶囊。 0067 3) 制备成的包埋有牛肾上腺髓质细胞的 ACC戊酰A 微胶囊用于顽固性疼痛模型大 鼠的脊髓蛛网膜下腔移植， 疾病大鼠的疼痛症状得以纠正， 肢体抽动次数显著降低， ACC戊酰 A微胶囊移植六个月后回收， 回收到形态保持完整的ACC戊酰A微胶囊， 表面没有纤维化现象。 0068 实施例 7 0069 1) 高压静电法制备包埋有重组血管内皮细胞生长抑制因子 (endostatin) 的 CHO 细胞的海藻酸钙凝胶微球， 微球中细胞含量 5107/ml 微球。 0070 2) 将微球先后浸入含有壳聚糖 ( 壳聚糖分子量 20k。

39、Da， 脱乙酰度 92， 壳聚糖溶 于 pH 为 6.5 的醋酸 - 醋酸钠缓冲液， 浓度为 5g/L) 和己酰基改性壳聚糖 ( 壳聚糖骨架分子 量 20kDa， 己酰基取代度 50， 溶于生理盐水中， 浓度 5g/L) 溶液中， 微球与溶液体积比为 1 10， 反应 20 分钟， 生理盐水洗涤后再与 0.2海藻酸钠溶液反应 10 分钟， 生理盐水洗 涤， 制备成 ACC己酰A 微胶囊。 0071 3) 制备成的包埋有重组 endostatin 的 CHO 细胞的 ACC己酰A 微胶囊用于黑色素瘤 模型鼠的腹腔移植， 疾病大鼠的肿瘤明显缩小， ACC己酰A 微胶囊移植两个月后回收， 回收到 形态保持完整的 ACC己酰A 微胶囊， 表面没有纤维化现象。 说 明 书 CN 102475691 B 9 1/1 页 10 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102475691 B 10 。