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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611244636.6 (22)申请日 2016.12.29 (71)申请人 中山大学 地址 510275 广东省广州市海珠区新港西 路135号 (72)发明人 姚宏亮 李沛波 苏薇薇 王永刚 彭维 吴忠 (74)专利代理机构 广州番禺容大专利代理事务 所(普通合伙) 44326 代理人 刘新年 黄开艳 (51)Int.Cl. A61K 36/752(2006.01) A61P 11/00(2006.01) A23L 33/105(2016.01) (54)发明名称 化橘红。
2、提取物在制备防治PM2.5颗粒诱导慢 性阻塞性肺疾病急性发作药物中的应用 (57)摘要 本发明涉及化橘红提取物的新用途。 本发明 首次公开了化橘红总黄酮提取物在制备防治 PM2.5颗粒诱导慢性阻塞性肺疾病急性发作药 物、 慢性阻塞性肺疾病急性加重发作期气流受限 加重药物及呼吸系统高气道反应性、 低肺动态顺 应性疾病药物中的应用。 优选黄酮类化合物总含 量高于50的化橘红总黄酮提取物。 与现有技术 相比， 本发明的化橘红总黄酮提取物制备方法简 单， 成本低， 疗效确切； 为天然植物提取物， 无副 作用， 可作为预防保健食品或治疗药品。 权利要求书1页 说明书4页 CN 106728205 A 2。
3、017.05.31 CN 106728205 A 1.化橘红总黄酮提取物在制备防治PM2.5颗粒诱导慢性阻塞性肺疾病急性发作药物中 的应用。 2.化橘红总黄酮提取物在制备防治PM2.5颗粒诱导慢性阻塞性肺疾病急性加重发作期 气流受限加重药物中的应用。 3.化橘红总黄酮提取物在制备防治PM2.5颗粒诱导呼吸系统高气道反应性、 低肺动态 顺应性疾病药物中的应用。 4.如权利要求1或2或3所述的应用， 其特征在于： 所述的化橘红总黄酮提取物中， 黄酮 类化合物的总含量高于50。 5.如权利要求4所述的应用， 其特征在于： 所述的化橘红总黄酮提取物中， 黄酮类化合 物的总含量高于70。 权 利 要 求。
4、 书 1/1 页 2 CN 106728205 A 2 化橘红提取物在制备防治PM2.5颗粒诱导慢性阻塞性肺疾病 急性发作药物中的应用 技术领域 0001 本发明涉及化橘红提取物的新用途， 尤其是涉及化橘红提取物用于制备防治 PM2.5诱导慢性阻塞性肺疾病急性发作药物的用途。 背景技术 0002 慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease， COPD)是一种常 见以持续性气流受限为特征的疾病。 气流受限进行性发展， 与气道和肺脏对有毒颗粒或气 体的慢性炎性反应增强有关。 COPD是全世界范围内发病率和死亡率最高的疾病之一， 已成 为一个重要的公。
5、共卫生问题。 全球目前有6亿人患有慢阻肺； 根据 中国居民营养与慢性病 状况报告(2015) ， 我国40岁及以上人群的慢阻肺患病率高达9.9。 0003 慢性阻塞性肺疾病全球倡议组织发布的2015年版GOLD慢阻肺诊断治疗和预防的 全球策略指出： 吸入香烟烟雾和其他有毒颗粒， 是COPD发生的重要原因。 户外大气污染是促 进COPD急性加重发作， 而急性加重影响着疾病的严重程度和对个体的预后， 导致住院率和 病死率的增加。 近年来， 随着我国经济的快速发展， 环境污染问题日益严重， 以雾霾为主的 大气污染已经成为全国性的环境问题， 许多地区已严重受雾霾影响。 霾天气的本质是大气 细颗粒物PM。
6、2.5污染， 因此， 目前雾霾对健康影响的研究主要集中在PM2.5上。 PM2.5是指大 气中空气动力学粒径小于或等于2.5微米的颗粒物， 也称为可入肺颗粒物。 PM2.5富含大量 有毒、 有害物质， 进入肺部后可诱导呼吸系统炎症， 增加人群患COPD、 肺气肿及其他呼吸系 统疾病的危险性； 对于COPD患者， PM2.5可干扰呼吸系统换气功能和引起肺功能障碍， 诱发 COPD急性加重发作和气流受限的加重。 目前， COPD急性加重期的治疗， 主要是针对病毒或细 菌诱发的呼吸道感染， 常采用氧疗、 支气管舒张剂、 全身性应用糖皮质激素、 抗生素等加以 治疗。 而针对PM2.5诱发的COPD急性。
7、加重发作和气流受限的加重， 主要集中在改善环境， 提 高空气质量或减少外出， 降低暴露损害等消极应对方法， 缺少具有针对性的预防或治疗药 物。 因此， 有必要研制用于预防和治疗诱发COPD急性加重发作和气流受限加重的药物和新 型保健产品。 0004 化橘红是芸香科植物化州柚Citrus grandis Tomentosa 或柚Citrus grandis Tomentosa 的未成熟或近成熟的干燥外层果皮。 传统中医药理论认为， 化橘红味辛、 苦， 性 温， 归肺、 脾经， 具有理气宽中， 燥湿化痰的功效， 用于咳嗽痰多， 多积伤酒， 呕恶痞闷。 现代 药理研究表明， 化橘红具有止咳化痰平喘的。
8、作用， 但尚未有报道化橘红用于制备预防和治 疗PM2.5诱导COPD急性加重发作期气流受限加重的药物的用途。 发明内容 0005 本发明公开了化橘红总黄酮提取物在制备防治PM2.5颗粒诱导慢性阻塞性肺疾病 急性发作药物中的应用。 0006 并进一步公开化橘红总黄酮提取物在制备防治PM2.5颗粒诱导慢性阻塞性肺疾病 说 明 书 1/4 页 3 CN 106728205 A 3 急性加重发作期气流受限加重药物中的应用。 0007 化橘红总黄酮提取物在制备防治PM2.5颗粒诱导呼吸系统高气道反应性、 低肺动 态顺应性疾病药物中的应用。 0008 优选黄酮类化合物的总含量高于50的化橘红总黄酮提取物。。
9、 0009 最优选黄酮类化合物的总含量高于70的化橘红总黄酮提取物。 0010 实验研究中发现： 化橘红总黄酮提取物灌胃给予PM2.5诱导COPD急性加重发作大 鼠， 能显著降低气道阻力， 提高肺顺应性， 增加0.2s呼气量(FEV0.2)/最大肺活量(FVC)与呼 气峰流速(PEF)， 说明化橘红总黄酮提取物具有很好的抑制PM2.5诱导COPD急性发作的作 用； 特别是防治PM2.5颗粒诱导慢性阻塞性肺疾病急性加重发作期气流受限加重的作用。 本 发明的化橘红总黄酮提取物制备方法简单， 成本低， 疗效确切； 为天然植物提取物， 无副作 用， 可作为预防保健食品或治疗药品。 具体实施方式 001。
10、1 下面结合实施例对本发明做进一步的说明。 0012 各实施例中所涉及的固体混合物中之固体， 液体中之液体， 以及液体中之固体的 百分比分别是以wt/wt、 vol/vol、 wt/vol计算， 除非另有说明。 0013 实施例1： 化橘红总黄酮提取物的制备 0014 化橘红总黄酮提取物的制备方法为： 取化橘红药材， 加水煎煮， 滤过， 水煎液浓缩 至相对密度为1.051.30， 加入乙醇或(和)甲醇进行醇沉， 有沉淀物出现， 滤过， 滤液回收 醇至无醇味的浸膏， 加水调相对密度至1.051.15间， 放置3天以上， 有沉淀物析出， 过滤， 得到沉淀物， 干燥， 即为化橘红总黄酮提取物。 00。
11、15 化橘红总黄酮提取物的总黄酮含量测定方法为： 采用 中国药典 2010年版第一部 化橘红项下所载方法进行测定含量。 即取化橘红提取物1mg， 精密称定， 置10ml量瓶中， 加甲 醇稀释至刻度， 摇匀， 滤过， 作为供试品溶液； 另取柚皮苷对照品适量， 精密称定， 加甲醇溶 解并定量稀释成每1ml中约含柚皮苷60 g的溶液， 作为对照品溶液。 分别吸取对照品溶液和 供试品溶液各10 l， 注入液相色谱仪， 按药典所载色谱条件进行测定， 计算， 即得。 0016 按上述方法， 共取用三批不同化橘红药材进行提取， 得到三批化橘红总黄酮提取 物P1、 P2、 P3， 该三批样品的黄酮类化合物含量。
12、见表1。 0017 表1三批化橘红总黄酮提取物中黄酮类化合物含量 0018 0019 实施例2： 化橘红总黄酮提取物对PM2.5诱导COPD急性加重发作期气流受限加重的 抑制作用。 0020 选取实施例1所得三批化橘红总黄酮提取物进行以下实施例的实验。 0021 1、 实验动物： 0022 健康Wistar大鼠72只， 体重(18020)g， SPF级， 雌雄各半， 由广东省医学实验动物 中心提供， 动物生产许可证号： SCXK(粤)2013-0002。 说 明 书 2/4 页 4 CN 106728205 A 4 0023 2、 药品分组与处理： 0024 正常对照组： 正常动物不经造模处理。
13、， 实验期间每日灌胃等体积的蒸馏水。 0025 COPD模型组(COPD组)： 采用烟熏复合气道内注入细菌脂多糖(以下简称LPS)法造 成COPD模型， 实验期间每日灌胃等体积的蒸馏水； 在烟熏8周的最后一天， 按2ml/kg体重的 剂量给予大鼠气管滴注生理盐水。 0026 PM2.5诱导的COPD急性加重发作模型组(COPD+PM2.5组)： 采用烟熏复合气道内注 入LPS法造成COPD模型， 在烟熏8周的最后一天， 以PM2.5混悬液气管滴注染毒造成PM2.5诱 导COPD急性加重发作模型。 0027 化橘红总黄酮提取物P1组(COPD+PM2.5+P1组)： 采用烟熏复合气道内注入LPS。
14、法造 成COPD模型， 在烟熏8周的最后一天， 以PM2.5混悬液气管滴注染毒造成PM2.5诱导COPD急性 加重发作模型； 从烟熏第七周的第一天起， 每天于实验前取P1批化橘红总黄酮提取物粉末 (黄酮类化合物含量为53.5)， 加蒸馏水配成浓度为0.1mg/ml的混悬液， 所有动物按1ml/ 100g体重的剂量灌胃给药， 1次/天(d)， 连续1周。 0028 化橘红总黄酮提取物P2组(COPD+PM2.5+P2组)： 采用烟熏复合气道内注入LPS法造 成COPD模型， 在烟熏8周的最后一天， 以PM2.5混悬液气管滴注染毒造成PM2.5诱导COPD急性 加重发作模型； 从烟熏第七周的第一天。
15、起， 每天于实验前取P2批化橘红总黄酮提取物粉末 (黄酮类化合物含量为67.9)， 加蒸馏水配成浓度为0.1mg/ml的混悬液， 所有动物按1ml/ 100g体重的剂量灌胃给药， 1次/天(d)， 连续1周。 0029 化橘红总黄酮提取物P3组(COPD+PM2.5+P3组)： 采用烟熏复合气道内注入LPS法造 成COPD模型， 在烟熏8周的最后一天， 以PM2.5混悬液气管滴注染毒造成PM2.5诱导COPD急性 加重发作模型； 从烟熏第七周的第一天起， 每天于实验前取P3批化橘红总黄酮提取物粉末 (黄酮类化合物含量为76.1)， 加蒸馏水配成浓度为0.1mg/ml的混悬液， 所有动物按1ml。
16、/ 100g体重的剂量灌胃给药， 1次/天(d)， 连续1周。 0030 3、 实验方法： 0031 3.1分组与COPD造模： 0032 按随机数字表法将大鼠按随机数字表法随机分为6组， 正常对照组、 COPD模型组、 PM2.5诱导的COPD急性加重发作模型组、 化橘红总黄酮提取物P1组、 化橘红总黄酮提取物P2 组、 化橘红总黄酮提取物P3组， 每组12只。 正常对照组大鼠饲养于无烟的正常环境， 每天灌 予等体积蒸馏水； 其它各组大鼠分别于实验第1、 15、 30天乙醚麻醉动物后气道内注入200 g/200 L生理盐水脂多糖溶液(当天不进行香烟熏染毒)， 其余造模时间内每天将大鼠置入 密。
17、闭的不锈钢烟熏箱(0.8m0.8m1m)进行烟熏染毒， 烟熏染毒方法为： 每天2次， 中间间 隔4h， 每次烟熏30min， 10支烟/次， 6天/周， 共8周， 每支烟含焦油量11mg， 烟气烟碱量1.0mg， 一氧化碳量13mg。 烟熏箱带水冷夹层， 使箱内温度维持在26左右。 0033 3.2 PM2.5的采样与处理： 0034 于2014月7月1日起,在广州市区用Thermo Anderson G-2.5大流量采样器(美国热 电子公司)用聚四氟乙烯滤膜采样PM2.5， 连续4周。 将载有颗粒物的滤膜剪裁成1cm3cm大 小， 置于去离子蒸馏水中， 超声振荡3次， 每次1小时， 洗脱颗粒。
18、物， 震荡液经六层纱布过滤， 滤液于4、 12000r/min离心30min， 收集下层悬液冷冻真空干燥， 得到PM2.5粉末。 用生理盐 水将PM2.5粉末配成所需浓度后超声震荡15min， 混匀并灭菌， 4保存， 临用前振荡使颗粒 说 明 书 3/4 页 5 CN 106728205 A 5 物充分混匀。 0035 3.3 PM2.5诱导的COPD急性加重发作模型： 0036 取PM2.5诱导的COPD急性加重发作模型组、 化橘红总黄酮提取物P1组、 化橘红总黄 酮提取物P2组、 化橘红总黄酮提取物P3组的所有大鼠， 按2mg/kg体重的剂量给动物进行 PM2.5混悬液气管滴注染毒造模， 。
19、气管一次滴注量为2ml/kg体重， 染毒时间为24h。 0037 3.4呼吸功能检测： 0038 用3戊巴比妥钠(5mg/kg)腹腔注射麻醉， 然后将大鼠仰卧固定在操作台上， 纵行 切开颈部皮肤， 机械钝性分离皮下组织暴露气管， 在环状软骨下切一个倒 “T” 型切口， 进行 气管插管。 采用美国Buxco公司PFT/Maneuvers动物肺功能检测分析系统测量气道阻力、 肺 顺应性、 0.2s呼气量(FEV0.2)/最大肺活量(FVC)、 呼吸峰流速(PEF)等呼吸指标。 0039 4、 实验结果： 0040 由表2可见， 与空白对照组比较， COPD组大鼠的气道阻力显著升高(P0.01)， 。
20、肺顺 应性显著降低(P0.01)， 0.2s呼气量(FEV0.2)/最大肺活量(FVC)与呼气峰流速(PEF)显著 下降(P0.01)， 说明烟熏复合气道内注入LPS法可造成大鼠表现出明显的气流受限现象。 与COPD组比较， COPD+PM2.5组的气流受限明显加重， 表现为气道阻力显著升高(P0.01)， 肺顺应性显著降低(P0.01)， 0.2s呼气量(FEV0.2)/最大肺活量(FVC)与呼气峰流速(PEF) 显著下降(P0.01)。 与COPD+PM2.5组比较， COPD+PM2.5+P1组、 COPD+PM2.5+P2组和COPD+ PM2.5+P3组大鼠的气道阻力显著降低(P0.。
21、05或0.01)， 肺顺应性显著升高(P0.01)， 0.2s呼气量(FEV0.2)/最大肺活量(FVC)与呼气峰流速(PEF)显著提高(P0.05或0.01)， 提 示化橘红总黄酮提取物具有很好的抑制PM2.5诱导COPD急性发作的作用； 尤其是抑制PM2.5 诱导COPD急性加重发作期的气流受限加重的作用。 0041 表2化橘红总黄酮提取物对PM2.5诱导的COPD急性加重发作期气流受限加重的抑 制作用(n12) 0042 0043 注： 与正常对照组比较： #P0.01； 与COPD组比较：$P0.01； 与COPD+PM2.5组比 较： *P0.05， *P0.01。 说 明 书 4/4 页 6 CN 106728205 A 6 。