技术领域
本发明涉及一种载有囊泡的多囊脂质体的制备方法，属于医药技术领域。
背景技术
多囊脂质体(Multivesicular,MVLs)是目前发展较为成熟的一种缓控释制剂，于1983年由英国Skyepharma PLC公司采用贮库泡沫技术(Depo FoamTM)成功研制。其是由多个水性腔室以非同心圆的形式构成，各个腔室之间以脂质双分子层相隔，中性脂质作为固定连接物分布在相邻腔室的交接点处，从而可形成牢固的拓朴结构。多囊脂质体作为亲水性药物的载体，其可大大提高水溶性药物的包封率，同时减少渗漏，在释放过程中，随着含药的小室逐渐破裂而释放药物，但完整的球状结构仍能保持原状，以达到缓释目的。
目前，多囊脂质体包埋药物的报道仍局限在对于普通水溶性药物或蛋白多肽的研究，如：张淼，于月玲，唐星.阿糖胞苷多囊脂质体的制备及体外释放度考察[J],2009,26(1):1-5.陶昱斐.酪丝亮肽多囊脂质体的研究[D]，2007。在上述及多篇多囊脂质体研究报道中，药物在体外释放时间一般为3-5天，缓释时间较短。药物突释现象仍较明显，这对于某些治疗窗要求严格的疾病治疗上还存在重大隐患。对于生物大分子药物而言，怎样尽可能保证药物在制备前后活性不丧失，以达到良好的治疗效果是一个热点问题。但生物大分子自身结构较为复杂，很容易在制备、保存或释放过程中由于体内外环境而经受化学降解或物理变化，从而丧失活性，尤其是多囊脂质体制备均是采用W/O/W复乳法，在油水界面，蛋白多肽类药物易发生结构破坏，从而导致其丧失部分生物活性。
因此，有必要研发一种新型缓控释制剂，使其在提高药物包封率，解决药物突释及保证药物活性方面具有较好优势。
发明内容
本发明针对现有技术不足，提供一种可解决突释现象且包封率高，制备过程中保证药物良好活性的载有囊泡的多囊脂质体的制备方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种载有囊泡的多囊脂质体的制备方法，步骤如下：
(1)三相溶液的制备
分别是溶液A：制备含有包埋小分子药物和/或生物大分子药物的囊泡和蔗糖的内水相；其中，所述溶液A含蔗糖质量浓度为2-10％；
溶液B：制备含有脂质及有机溶剂的脂质相；其中，所述脂质包括二油酰基磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰甘油，胆固醇和三油酸甘油酯；所述二油酰基磷脂酰胆碱占脂质总质量的百分比为20-60％，所述三油酸甘油酯占脂质总质量的百分比为5-20％，二棕榈酰磷脂酰甘油占脂质总质量的百分比为5-20％，所述胆固醇占脂质总质量的百分比为10-50％；
溶液C：制备含有葡萄糖和赖氨酸的外水相；其中，所述溶液C含葡萄糖质量浓度为5-15％，含赖氨酸质量浓度为10-80mmol/L；
(2)W/O初乳的制备
合并、混合所述溶液A和所述溶液B，高速剪切搅拌得到W/O初乳；其中，溶液A和溶液B的体积比为1∶0.5-1∶20；
(3)W/O/W多囊脂质体的制备
将W/O初乳分散到溶液C中，高速剪切搅拌，形成W/O/W型复乳；W/O/W型复乳再分散到溶液C中，30-40℃下旋转蒸发或氮吹，去除有机溶剂；将W/O/W型复乳进行离心，取沉淀加生理盐水重新分散，得到多囊脂质体；其中，W/O初乳和溶液C的体积比为1∶1-1∶10。
优选地，所述囊泡为胶束或纳米粒。
优选地，步骤(2)中所述溶液A和所述溶液B高速剪切搅拌条件为：剪切速度3000-15000rpm，时间2-15min。
优选地，步骤(3)中将所述初乳分散到所述溶液C中，条件为：剪切速度为3000-12000rpm，时间10-100秒。
有益效果：本发明采用内水相含囊泡，油相含脂质成分，形成了多囊脂质体小室包含囊泡的复合结构。该制备方法主要解决了以下两方面问题：(1)解决了脂溶性药物难以制成多囊脂质体的技术问题，可先将脂溶性药物制备成囊泡，然后再制成多囊脂质体；(2)解决了药物突释的普遍情况，保证药物在体内外生物活性，延长药物的半衰期，达到缓慢释放的目的。所述的多囊脂质体不仅可保证加载药物的包封率，还可提高生物大分子的生物活性，降低其免疫原性，减少突释效应，保证药物的持续缓慢释放。
附图说明
后文将参照附图以示例性而非限制性的方式详细描述本发明的一些具体实施例。附图中相同的附图标记标示了相同或类似的部件或部分。本领域技术人员应该理解，这些附图未必是按比例绘制的。附图中：
图1为本发明实施例一中的载有艾塞那肽的明胶纳米粒透射电镜照片；
图2为本发明实施例一中的载有艾塞那肽明胶纳米粒多囊脂质体的光学显微镜照片；
图3为本发明实施例一中的载有艾塞那肽明胶纳米粒多囊脂质体的体外释放曲线；
图4为本发明对比例一中的载有艾塞那肽多囊脂质体的显微镜照片；
图5为本发明对比例一中的载有艾塞那肽多囊脂质体的体外释放曲线。
具体实施方式
本发明提供了用于制备可以以延迟特性释放物质如药物、蛋白质和多肽或活性成分的新型制剂方法，即提供了一种载有囊泡的多囊脂质体的制备方法。步骤如下：
(1)三相溶液的制备
分别是溶液A：制备含有包埋小分子药物和/或生物大分子药物的囊泡和蔗糖的内水相；
其中，所述溶液A含蔗糖质量浓度为2-10％(w/v)；
溶液B：制备含有脂质及有机溶剂的脂质相；
其中，所述脂质包括二油酰基磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰甘油，胆固醇和三油酸甘油酯；所述二油酰基磷脂酰胆碱占脂质总质量的百分比为20-60％，所述三油酸甘油酯占脂质总质量的百分比为5-20％，二棕榈酰磷脂酰甘油占脂质总质量的百分比为5-20％，所述胆固醇占脂质总质量的百分比为10-50％；
溶液C：制备含有葡萄糖和赖氨酸的外水相；
其中，所述溶液C含葡萄糖质量浓度为5-15％(w/v)，含赖氨酸质量浓度为10-80mmol/L(w/v)；
(2)W/O初乳的制备
合并、混合所述溶液A和所述溶液B，高速剪切搅拌得到W/O初乳；
其中，溶液A和溶液B的体积比为1∶0.5-1:20；
所述溶液A和所述溶液B高速剪切搅拌条件为：剪切速度3000-15000r pm，时间2-15min；
(3)W/O/W多囊脂质体的制备
将W/O初乳分散到溶液C中，高速剪切搅拌，剪切速度为3000-12000rpm，时间10-100秒，形成W/O/W型复乳；W/O/W型复乳再分散到溶液C中，30-40℃下旋转蒸发或氮吹，去除有机溶剂；将W/O/W型复乳进行离心，取沉淀加生理盐水重新分散，得到多囊脂质体；
其中，W/O初乳和溶液C的体积比为1∶1-1∶10。
本发明所述小分子药物，选自抗生素类药物，化学治疗药物，治疗脉络膜新生血管药物如地塞米松。
所述生物大分子药物选自治疗性肽或蛋白质或单克隆抗体或核酸，如贝伐珠单抗，雷珠单抗，阿柏西普，siRNA和质粒DNA。利用本发明制备成的复合多囊脂质体，其脂质材料具有较好生物相容性，不会对皮肤、肌肉和局部组织造成刺激，生物大分子药物被双层包裹，保证活性不丧失，并且每个小室逐渐破裂释放囊泡，囊泡再逐一释放药物，以达到缓释目的。其重点解决了药物突释情况，保证药物活性，使药物可以在体内保持缓慢释放。
所述囊泡为胶束或纳米粒。
所述胶束由嵌段共聚物构成，如片段中包含聚乳酸-羟基乙酸、透明质酸，优选为mPEG-PLGA胶束。
所述纳米粒选自脱乙酰壳聚糖纳米粒、明胶纳米粒、透明质酸纳米粒、聚乳酸-羟基乙酸纳米粒以及它们材料修饰改造后形成的纳米粒。
所述有机溶剂为三氯甲烷、乙醚、甲醇或丙酮中的一种或多种。
需要理解的是，本发明中，所述二油酰基磷脂酰胆碱，其是形成多囊脂质体的主要成分，只有具有含有双分子层的磷脂，药物才能被包封在其中。
本发明中，所述三油酸甘油酯，其是形成多囊脂质体的关键因素，否则，只能得到普通脂质体；三油酸甘油酯填充于多囊脂质体囊与囊之间的空隙中，起着连接稳定各个小室的作用；不同链长的三甘油酯，影响药物的体外释放速率。
本发明中，所述二棕榈酰磷脂酰甘油，其作用是增强所形成的多囊脂质体之间的稳定性，主要是由于中性磷脂由于范德华力作用易产生凝聚效应，相同电荷之间的排斥力可更好防止颗粒的凝集。其在脂质相中的浓度为1-10mg/ml,荷负电磷脂效果更佳。经过实验对比发现，含有二棕榈酰磷脂酰甘油的多囊脂质体比不含有的在球形圆整及分散程度上均有较明显优势，前者粘连在一起，分散性不好。
本发明中，所述胆固醇作为膜稳定剂，可改善磷脂膜的流动性，减少药物的渗漏率，用量过多或过少都会影响多囊脂质体的稳定性和包封率，脂质相中胆固醇的浓度在5-20mg/ml，实验发现若不加胆固醇，所制得的多囊脂质体很快便破碎，达不到缓释效果。
本发明中，所述内水相中的渗透压调节剂为蔗糖,所述外水相中的渗透压调节剂为葡萄糖。所述的内水相渗透压调节剂、外水相渗透压调节剂的存在，是保证内外水相压力差在一定范围内，增加多囊脂质体的稳定性，尽可能减少发生药物泄露。
下面通过实施例来具体阐述本发明所述一种载有囊泡的多囊脂质体的制备方法。
实施例一
载有艾塞那肽的明胶纳米粒的多囊脂质体
(1)制备溶液A：1份载有艾塞那肽的明胶纳米粒和渗透压调节剂的内水相，具体为将制备好的纳米粒分散于溶有渗透压调节剂的水相中；
制备溶液B：含有200份的脂质有机溶剂；
制备溶液C：含有渗透压调节剂和辅助乳化剂的外水相；
(2)合并、混合溶液A和溶液B，12000rpm高速剪切搅拌得到W/O初乳；
其中，溶液A和溶液B的体积比为1:0.5-1:20；
溶液A含蔗糖质量浓度为2-10％(w/v)；
溶液B中含二棕榈酰磷脂酰甘油质量浓度为0.01-1％(w/v)；
(3)将W/O初乳分散到溶液C中，剪切速度为5000rpm，时间10秒，形成W/O/W型复乳；
其中，W/O初乳和溶液C的体积比为1:1-1:10进行；
溶液C含葡萄糖质量浓度为5-15％(w/v)，含赖氨酸质量浓度为10-80mmol/L(w/v)；
(4)将W/O/W型复乳再分散到溶液C中，30-40℃下旋转蒸发或氮吹，去除有机溶剂；
其中，W/O/W型复乳与溶液C的体积比为1:1-1∶100；
(5)将W/O/W型复乳进行2000rpm离心，取沉淀加生理盐水重新分散，得到多囊脂质体混悬液。
图1为载有艾塞那肽的明胶纳米粒透射电镜照片，从图1可以看出，载有艾塞那肽的明胶纳米粒形态圆整。图2为载有艾塞那肽明胶纳米粒的多囊脂质体的光学显微镜照片，从图2可以看出，多囊脂质体的粒径大小均一、球形圆整。图3为载有艾塞那肽明胶纳米粒的多囊脂质体的体外释放曲线。
实施例二
载有石杉碱甲的mPEG-PLGA胶束的多囊脂质体
(1)制备溶液A：1份载有石杉碱甲的mPEG-PLGA胶束和渗透压调节剂的内水相，具体为将制备好的纳米粒分散于溶有渗透压调节剂的水相中；
溶液B：含有200份的脂质有机溶剂；
溶液C：含有渗透压调节剂和辅助乳化剂的外水相；
(2)合并、混合溶液A和溶液B，12000rpm高速剪切搅拌得到W/O初乳；
其中，溶液A和溶液B的体积比为1:0.5-1:20；
溶液A含蔗糖质量浓度为2-10％(w/v)；
溶液B中含二棕榈酰磷脂酰甘油质量浓度为0.01-1％(w/v)；
(3)将W/O初乳分散到溶液C中，剪切速度为5000rpm，时间10秒，形成W/O/W型复乳；
其中，W/O初乳和溶液C的体积比为1∶1-1∶10；
溶液C含葡萄糖质量浓度为5-15％(w/v)，含赖氨酸质量浓度为10-80mmol/L(w/v)；
(4)将W/O/W型复乳再分散到溶液C中，30-40℃下旋转蒸发或氮吹，去除有机溶剂；
其中，W/O/W型复乳与溶液C的体积比为1∶1-1∶100；
(5)将W/O/W型复乳进行2000rpm离心，取沉淀加生理盐水重新分散，得到多囊脂质体混悬液。
其中所述纳米粒、胶束可替换为脂质体。
对比例一
艾塞那肽多囊脂质体
(1)制备溶液A：含1份艾塞那肽及渗透压调节剂的内水相，具体为将药物溶有渗透压调节剂的水相中；
溶液B：含有10份的脂质有机溶剂；
溶液C：含有渗透压调节剂和辅助乳化剂的外水相
(2)合并、混合溶液A和溶液B，12000rpm高速剪切搅拌得到W/O初乳；
其中，溶液A和溶液B的体积比为1∶0.5-1∶20；
溶液A含蔗糖质量浓度为2-10％(w/v)；
溶液B中含二棕榈酰磷脂酰甘油质量浓度为0.01-1％(w/v)；
(3)将W/O初乳分散到溶液C中，剪切速度为5000rpm，时间10秒，形成W/O/W型复乳；
其中，W/O初乳和溶液C的体积比为1∶1-1∶10进行；
溶液C含葡萄糖质量浓度为5-15％(w/v)，含赖氨酸质量浓度为10-80mmol/L(w/v)；
(4)将W/O/W型复乳再分散到溶液C中，30-40℃下旋转蒸发或氮吹，去除有机溶剂；
其中，W/O/W型复乳与溶液C的体积比为1∶1-1∶100；
(5)将W/O/W型复乳进行2000rpm离心，取沉淀加生理盐水重新分散，得到多囊脂质体混悬液。
其显微镜照片见图4，体外释放曲线见图5；结果显示，艾塞那肽多囊脂质体球形较圆整。
通过实施例一与对比例一的体外释放曲线可知，实施例中药物累积释放度变化缓慢，具有明显的缓释效果，药物可持续释放15天；对比例中，药物释放具有较明显的突释现象，且药物释放较迅速，可持续7天左右。
对比例二
牛血清白蛋白多囊脂质体
(1)制备溶液A：含有1份牛血清白蛋白及渗透压调节剂的内水相，具体为将药物溶有渗透压调节剂的水相中；
溶液B：含有10份的脂质有机溶剂；
溶液C：含有渗透压调节剂和辅助乳化剂的外水相；
(2)合并、混合溶液A和溶液B，12000rpm高速剪切搅拌得到W/O初乳；
其中，溶液A和溶液B的体积比为1∶0.5-1∶20；
溶液A含蔗糖质量浓度为2-10％(w/v)；
溶液B中含二棕榈酰磷脂酰甘油质量浓度为0.01-1％(w/v)；
(3)将W/O初乳分散到溶液C中，剪切速度为5000rpm，时间10秒，形成W/O/W型复乳；
其中，W/O初乳和溶液C的体积比为1∶1-1∶10进行；
溶液C含葡萄糖质量浓度为5-15％(w/v)，含赖氨酸质量浓度为10-80mmol/L(w/v)；
(4)将W/O/W型复乳再分散到溶液C中，30-40℃下旋转蒸发或氮吹，去除有机溶剂；
其中，W/O/W型复乳与溶液C的体积比为1∶1-1∶100；
(5)将W/O/W型复乳进行2000rpm离心，取沉淀加生理盐水重新分散，得到多囊脂质体混悬液。
所述的载有囊泡的多囊脂质体用于玻璃体、口服、肌注、皮下、鞘内、腹腔、硬膜外、关节腔等多种注射途径。
本发明一种载有囊泡的多囊脂质体被广泛用于手术和临床治疗，其治疗范围包括但不限于，眼科疾病(如老年性黄斑变性、青光眼、眼部炎症和玻璃体视网膜疾病等)、肿瘤、肝病与神经系统疾病等。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在本发明的权利要求书的范围内。