重楼皂苷VI在制备抗肺癌药物中的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510760701.X (22)申请日 2015.11.10 (71)申请人 广州中医药大学 地址 510006 广东省广州市番禺区大学城 外环东路232号 (72)发明人 刘中秋 卢琳琳 林竹芬 吴鹏 王莹 戚笑笑 (74)专利代理机构 广州市天河庐阳专利事务所 (普通合伙) 44244 代理人 胡济元 (51)Int.Cl. A61K 31/7048(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/04(2006.01) A61P 11/00(。

2、2006.01) (54)发明名称 重楼皂苷VI在制备抗肺癌药物中的应用 (57)摘要 本发明涉及含有机有效成分的医药配制品， 具体涉及重楼皂苷VI在制备抗肺癌药物中的应 用。 本发明所述的重楼皂苷VI对肺癌细胞和动物 移植瘤的生长具有良好的抑制作用， 具体表现 在： (1)在体外对A549和NCI-H1299肺癌细胞有很 强的生长抑制作用； (2)能够诱导细胞凋亡和细 胞周期阻滞， 并且对细胞凋亡和细胞周期相关的 蛋白有明显影响； (3)对体内移植瘤有明显的抑 制作用。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 106668041 A 2017.05.17 CN 106668041 A 1。

3、/1 页 2 1.重楼皂苷 VI 在制备抗肺癌药物中的应用。 2.根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述药物由重楼皂苷 VI 和医学上可接受 的辅料组成， 其中， 重楼皂苷 VI 在药物中的质量百分含量为 10 50。 3.根据权利要求 1 或 2 所述的应用， 其特征在于， 所述药物为颗粒剂、 片剂或胶囊剂。 权 利 要 求 书 CN 106668041 A 2 1/4 页 3 重楼皂苷 VI 在制备抗肺癌药物中的应用 技术领域 ： 0001 本发明涉及含有通过配糖键与非糖化合物连接的糖基的化合物， 具有涉及重楼皂 苷 VI， 该化合物可用于制备抗肺癌的药物。 背景技术 ： 00。

4、02 肺癌是全球最常见的恶性肿瘤， 其发病率和死亡率居于各类恶性肿瘤之首， 已成 为严重危害人类健康和生命的疾病之一。 近年来， 受各种因素的影响， 全球各国肺癌的发病 率和死亡率都明显上升， 而中国是世界上肺癌患者数量最多的国家。 因此， 寻求新的有效的 肺癌治疗药物， 进一步提高临床疗效， 己成为当前迫切需要研究的问题。 我国作为中草药的 聚集地， 有着得天独厚的优势， 因此， 从中草药中寻找具有高效、 低毒特点的抗肿瘤药物是 非常适宜的手段之一。 0003 重楼 (Rhizoma Paridis) 是来源于百合科植物云南重楼或七叶一枝花的干燥根 茎， 在中医中药抗癌配方中的治疗具有上千年。

5、的历史 , 是抗癌中药配方中的常用草药。现 代研究证明重楼的主要活性物质是甾体皂苷， 主要包括薯蓣皂苷和偏诺皂苷两大类化合 物， 化合物重楼皂苷 VI 即是上述甾体皂苷中的一种， 其化学结构式如下式 ( ) 所示。 0004 0005 目前已发现重楼皂苷 VI 具有抗肿瘤、 消炎、 抑菌、 止血等多种生物活性， 但尚未见 该化合物治疗肺癌的报道。 发明内容 ： 0006 本发明要解决的技术问题是提供重楼皂苷 VI 的新用途， 即在制药中的新应用。 0007 上述新用途实际上是， 重楼皂苷 VI 在制备抗肺癌药物中的应用。 0008 上述应用中， 所述药物由重楼皂苷 VI 和医学上可接受的辅料组。

6、成， 其中， 重楼皂 苷 VI 在药物中的质量百分含量为 10 50。所述药物可以是常见的口服制剂， 如颗粒 剂、 片剂或胶囊剂。 0009 本发明所述的重楼皂苷 VI 对肺癌细胞和动物移植瘤的生长具有良好的抑制作 用， 具体表现在 ： (1) 在体外对 A549 和 NCI-H1299 肺癌细胞有很强的生长抑制作用 ； (2) 能 够诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞， 并且对细胞凋亡和细胞周期相关的蛋白有明显影响 ； (3) 说 明 书 CN 106668041 A 3 2/4 页 4 对体内移植瘤有明显的抑制作用。 附图说明 0010 图 1 为重楼皂苷 VI 对肺癌细胞周期的阻滞情况的统计分析。

7、图， 图的 PVVII 表示重 楼皂苷 VI。 0011 图 2 为重楼皂苷 VI 诱导肺癌细胞发生凋亡的统计分析图， 图的 PVVII 表示重楼皂 苷 VI。 0012 图 3 为重楼皂苷 VI 对细胞凋亡和 G2/M 检查点相关蛋白的影响的统计分析图， 图 的 PVVII 表示重楼皂苷 VI。 具体实施方式 0013 下述实施例 1 5 所用重楼皂苷 VI 购于成都曼斯特生物科技有限公司。 0014 实施例 1 ： 重楼皂苷 VI 对体外肺癌细胞的抑制作用 0015 取对数生长期的肿瘤细胞， 以3000/孔接种于96孔培养板中， 培养过夜， 细胞生长 状态良好后， 弃去原有的培养基， 然后。

8、按照设计的药物浓度 ： 重楼皂苷 VI 以 0， 0.78， 1.56， 3.12， 6.25， 12.5M 作用于 A549 和 NCI-H1299 细胞 24， 48， 72h 后停止培养 ； 然后加入 0.5mg/ml 的 MTT 溶液， 处理 4h 后， 弃上清， 最后加入 150l DMSO 振荡混匀， 置于酶标仪中 测定其吸光度值 ( 测定波长为 570nm)。结果如表 1 所示， 重楼皂苷 VI 可明显抑制肺癌细胞 A549 和 NCI-H1299 的增殖， 具有细胞毒作用， 是一种肿瘤治疗药物 (IC50见表 1)。 0016 表 1 重楼皂苷 VI 对 A549 和 NCI-。

9、H1299 细胞的半数抑制率 0017 0018 0019 实施例 2 ： 流式细胞仪分析重楼皂苷 VI/VI 对肺癌细胞周期的影响情况 0020 取对数生长期 A549 和 NCI-H1299 细胞， 以 2105/ 孔接种于六孔培养板中， 培养 过夜， 弃去培养基， 加入重楼皂苷 VI(0， 1， 2， 4M)， 处理细胞 24h 后 ； 用胰酶消化、 收集细 胞、 离心、 PBS 清洗 2 次， 再用预冷的体积分数为 75乙醇溶液混悬细胞， 密封保存后置于 4冰箱过夜。次日， 离心， PBS 洗 1 次， 接着每管细胞中加入 500l PBS 溶液 ( 含有 25l 说 明 书 CN 1。

10、06668041 A 4 3/4 页 5 PI(1mg/ml) 和 0.5l RNA 酶 (10mg/ml)， 涡旋混匀， 然后将细胞置于 37避光孵育 30min， 充分混匀后， 采用流式细胞仪检测细胞周期的分布情况， 样品于 l h 内检测完毕。结果如图 1 所示， 肺癌细胞经重楼皂苷 VI 作用后， 细胞的 DNA 的分布表现为 G2/M 期细胞比率增加。 0021 实施例 3 ： 流式细胞仪检测重楼皂苷 VI 的细胞凋亡情况 0022 取对数生长期 A549 和 NCI-H1299 细胞， 以 2105/ 孔接种于六孔培养板中， 培 养过夜， 弃去培养基， 加入重楼皂苷 VI(0， 1。

11、， 2， 4M) 处理细胞 48h 后， 消化、 收集细胞、 离 心、 PBS 清洗 2 次， 倒掉上清液， 用滤纸倒扣滤干 ； 再用凋亡试剂盒中的 lBinding Buffer 100l/Tube悬浮细胞， 然后加入Annexin-FITC和PI各5l/Tube， 避光， 室温放置15min ； 最后再分别加入 400l/Tube 的 1Binding Buffer， 充分混匀后， 采用流式细胞仪检测细 胞的凋亡情况， 样品于 1h 内检测完毕。结果如图 2 所示， 肺癌细胞经重楼皂苷 VI 作用后， 细胞的凋亡率呈现剂量依赖性增加。 0023 实施例 4 ： Western blotti。

12、ng 法检测细胞凋亡和 G2/M 检查点相关蛋白 0024 重楼皂苷 VI(0， 1， 2， 4M)I(0， 0.5， 1， 2M) 分别与 A549 和 NCI-H1299 细胞共 同孵育 48h 后， 胰酶消化、 收集细胞， 用 RIPA 裂解液提取总蛋白， 然后进行蛋白定量。采 用 western blotting 检测细胞凋亡相关蛋白 Fas， DR3， DR5， DcR3， PARP， Cleaved PARP， Cleaved Caspase-3， p53 和 phosphor-p53 及 G2/M 检查点相关蛋白 Cyclin B1， p21Waf1/ Cip1的表达情况。 结果。

13、如图3所示， 重楼皂苷VI能够显著性上调A549细胞中p53和p-p53 的蛋白表达， 下调了 Cyclin B1 和 p21Waf1/Cip1 的蛋白表达水平 ； 而重楼皂苷 VI 能显著 性上调 NCI-H1299 细胞中 p21Waf1/Cip1， 下调 Cyclin B1。另外， 重楼皂苷 VI 上调 A549 和 NCI-H1299 细胞中的 Fas、 DR3、 DR5， PARP， Cleaved PARP 和 Cleaved Caspase-3 的蛋白表 达水平， 降低 DcR3 的蛋白表达水平。 0025 实施例 5 ： 建立裸鼠移植瘤模型研究重楼皂苷 VI 对移植瘤生长的影响。

14、 0026 建立人非小细胞肺癌A549细胞裸鼠移植瘤模型 ： 选用4到6周的雌性BALB/c nu/ nu 小鼠， 将肿瘤细胞制成悬液， 然后按照细胞数为 2106/ 只接种于裸鼠的右侧腋窝下。每 周称量 2 3 次体重和用游标卡尺测量 2 3 次肿瘤的大小。然后按照以下公式计算肿瘤 体积 ： Tumor Volume(TV)1/2(LW2)， 其中L是肿瘤纵轴的长度， W是肿瘤横轴的长度， 并绘制裸鼠肿瘤的生长曲线。 当肿瘤的平均体积达到约100mm3时， 将裸鼠随机分为8个组， 每组 8 只。按照如下方案给药 ： 空白对照组 (0.9生理盐水 ) ； 重楼皂苷 VI 的高、 中、 低剂 量。

15、组 (4、 3、 2mg/kg)。裸鼠每周腹腔注射给药 5 次， 持续给药 4 周。给药结束后， 处死裸鼠， 然后取出肿瘤组织冻存于 -80。部分肿瘤组织用 RIPA 裂解液裂解提取总蛋白， 然后进行 蛋白定量。采用 western blotting 方法检测细胞凋亡相关蛋白 DR3， DR5， p53 和 G2/M 检 查点相关蛋白 Cyclin B1， p21Waf1/Cip1 的表达情况。结果如下表 2 和图 3 所示， 重楼皂苷 VI 能够显著性抑制 A549 裸鼠移植瘤的生长， 具有体内抗肿瘤活性。 0027 表 2 重楼皂苷 VI 处理 4 周后各组裸鼠体重变化、 肿瘤体积生长曲线、 肿瘤重量和 抑瘤率 (MeanSD) 0028 说 明 书 CN 106668041 A 5 4/4 页 6 说 明 书 CN 106668041 A 6 1/3 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 106668041 A 7 2/3 页 8 图 2 说 明 书 附 图 CN 106668041 A 8 3/3 页 9 图 3 说 明 书 附 图 CN 106668041 A 9 。