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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510098504.6 (22)申请日 2015.03.06 (73)专利权人 山东农业大学 地址 271018 山东省泰安市岱宗大街61号 (72)发明人 柴同杰 郭梦娇 王海荣 (51)Int.Cl. A61K 39/116(2006.01) A61K 39/114(2006.01) A61P 31/04(2006.01) A61P 1/00(2006.01) 审查员 程婷 (54)发明名称 一种鸡坏死性肠炎的A、 C型产气荚膜梭菌类 毒素和菌体二价两类抗原疫苗的制备方法 。
2、(57)摘要 本发明涉及动物细菌学领域， 提供了一种鸡 坏死性肠炎的A、 C型产气荚膜梭菌类毒素和菌体 二价两类抗原疫苗制备方法， 该方法以A型、 C型 产气荚膜梭菌增菌液接种于产毒培养基中， 在43 厌氧环境下振荡培养5h产毒素。 经甲醛灭活， 加入佐剂乳化获得A、 C型产气荚膜梭菌类毒素和 菌体二价两类抗原疫苗。 通过上述方法获得的疫 苗免疫商品鸡， 攻毒后其保护率达到100， 证明 该类毒素和菌体抗原复合疫苗， 既能针对细菌的 感染致病作用， 也能够针对细菌毒素的致病作用 对家禽产生很好的免疫保护效果。 权利要求书1页 说明书3页 CN 104623652 B 2016.08.17 CN。
3、 104623652 B 1.一种鸡坏死性肠炎的A、 C型产气荚膜梭菌类毒素和菌体二价两类抗原疫苗的制备方 法， 具体步骤如下： (1).菌种的复苏及增菌 将产气荚膜梭菌标准菌种A型NCTC528、 C型NCTC3180分别接种于血琼脂平板， 39在厌 氧箱中培养24h复苏； 挑取一个典型菌落接种于7ml硫乙醇酸盐流体培养基中39厌氧增菌 培养12h； (2).菌液的制备 上述获得的A型、 C型产气荚膜梭菌增菌培养液均以4ml接种于100ml产毒培养基中， 43 厌氧箱中160r/min振荡培养5h获得菌液； (3).菌液的灭活 将制取的菌液用1MNaOH调pH至7.2， 然后加入甲醛溶液使甲。
4、醛质量分数达到0.3进行 灭活， 充分振荡混匀置于37摇床， 4天后灭活完全； (4).疫苗的制备 灭活检验合格的菌液与灭菌的白油佐剂按体积比1： 2的比例充分乳化， 并按照每100毫 升上述乳化混合液加入0.01克硫柳汞的比例加入硫柳汞即可获得疫苗； 其中所述的产毒培养基， 其获得方法如下： 2.5克蛋白胨、 2克酵母提取物、 1.5克糊精、 1.4克L-精氨酸溶于100mlPBS缓冲液， 以1M HCl调pH至7.4即得； 所述的酵母提取物是试剂YEAST EXTRACT。 2.根据权利要求1所述制备方法， 其特征在于： 所述厌氧箱内气体组成按体积分数如 下： 88N2， 7H2， 5CO。
5、2。 3.根据权利要求1所述制备方法， 其特征在于： 所述的血琼脂为1g葡萄糖和3.8g豆琼脂 粉溶于100ml蒸馏水灭菌后， 加入5ml绵羊血获得。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104623652 B 2 一种鸡坏死性肠炎的A、 C型产气荚膜梭菌类毒素和菌体二价 两类抗原疫苗的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及动物细菌学领域， 本发明提供了一种鸡坏死性肠炎的A、 C型产气荚膜 梭菌类毒素和菌体二价两类抗原疫苗的制备方法。 背景技术 0002 坏死性肠炎(Necrotic Enteritis， 简称NE)主要由A型或C型产气荚膜梭菌引起， 但C型不普遍。 产生肠黏膜坏死等特。
6、征性病变， 病死禽以肝肿大、 肠道出血和肠黏膜有麸皮 样坏死灶为特征。 多种禽类可发生此病， 已证实坏死性肠炎在肉鸡、 蛋鸡、 火鸡和鹌鹑中都 有发生。 随着对抗生素类促生长剂的禁用， 该病在全世界主要养禽的国家和地区都有发生， 全球经济损失达20亿美元。 0003 产气荚膜梭菌是厌氧、 产孢子、 革兰氏阳性大杆菌。 它是脊椎动物肠道共栖菌， 但 在正常宿主肠道内数量较低。 它也是一种条件致病菌， 如果条件适宜， 会在肠道大量繁殖。 产气荚膜梭菌致病主要是其产生的外毒素引起。 可产生至少17种毒素或潜在毒性的外源蛋 白， 根据起主要致病作用的 、 、 、 毒素可将其分为A、 B、 C、 D、 。
7、E 5个产毒素型。 0004 目前研究， 肉用种母鸡免疫A型和C型类毒素可产生较强的IgY血清抗体反应， 并可 传递给后代， 虽然A型抗体应答高于C型， 但免疫C型类毒素对亚临床坏死性肠炎和肝炎的肉 鸡保护效果更为显著。 2010年Crouch等运用NetvaxTM公司的A型类毒素与轻质矿物油乳化 成苗， 肌肉注射免疫接种肉种母鸡安全， 精神状态和生产性能无全身副反应， 可明显减少由 NE引起的后代仔鸡的死亡和肠道损伤。 2011年， Saleh等运用当地流行毒株制备A型、 C型及A +C型类毒素， 皮下注射免疫7日龄商品肉鸡， 0.5ml/只， 21日龄以同样剂量及途径加免一次， 在35日龄。
8、进行混喂(2L产气荚膜梭菌肉汤培养物+1kg饲料或1L产气荚膜梭菌肉汤培养物+ 2L水)攻毒， 结果证明免疫鸡， 特别免疫A+C型类毒素的鸡肠道损伤明显下降， 但是上述方法 中采用的是直接以类毒素免疫肉鸡， 具有较多的局限性， 如免疫期短， 需要多次加强免疫等 缺陷。 因此如何克服上述缺陷， 对于疫苗的研制具有很重要的意义。 发明内容 0005 本发明提供了一种鸡坏死性肠炎的A、 C型产气荚膜梭菌类毒素和菌体二价两类抗 原疫苗的制备方法， 该方法以A型、 C型产气荚膜梭菌增菌液各4ml接种于产毒培养基中， 在 43厌氧环境下(88N2、 7H2、 5CO2)振荡培养5h。 经甲醛灭活， 加入佐。
9、剂乳化获得A、 C型 产气荚膜梭菌类毒素和菌体二价两类抗原疫苗。 通过上述方法获得的疫苗， 含有 、 两种主 要毒素抗原， 且类毒素和产气荚膜梭菌菌体抗原成分俱全， 对于产气荚膜梭菌感染引起的 家禽的坏死性肠炎有着极佳的免疫效果， 免疫商品鸡攻毒后其保护率达到100， 证明该类 毒素和菌体抗原复合疫苗， 既能针对细菌的感染致病作用， 也能够针对细菌毒素的致病作 用对家禽产生很好的免疫保护效果。 0006 发明人在本发明中所采用的A、 C型产气荚膜梭菌采用现有菌种， 特别选自标准菌 说 明 书 1/3 页 3 CN 104623652 B 3 种A型NCTC528、 C型NCTC3180(均保藏。
10、于National Collection of Type Cultures英国微生 物菌种保藏中心)， 可通过现有渠道直接获得， 故而该生物材料属于现有技术中可直接获得 的材料， 不需进行单独的生物保藏。 0007 本发明的具体技术方案如下： 具体步骤如下： 0008 (1).菌种的复苏及增菌 0009 将产气荚膜梭菌标准菌种A型NCTC528、 C型NCTC3180分别接种于血琼脂平板， 39 在厌氧箱中培养24h复苏； 挑取一个典型菌落接种于7ml硫乙醇酸盐流体培养基中39厌氧 增菌培养12h； 0010 (2).菌液的制备 0011 上述获得的A型、 C型产气荚膜梭菌增菌培养液均以4ml。
11、接种于100ml产毒培养基 中， 43厌氧箱中160r/min振荡培养5h获得菌液； 0012 (3).菌液的灭活 0013 将制取的菌液用1MNaOH调pH至7.2， 然后加入甲醛溶液使甲醛质量分数达到0.3 进行灭活， 充分振荡混匀置于37摇床， 4天后灭活完全； 0014 (4).疫苗的制备 0015 灭活检验合格的菌液与灭菌的白油佐剂按体积比1： 2的比例充分乳化， 并按照每 100毫升上述乳化混合液加入0.01克硫柳汞的比例加入硫柳汞即可获得疫苗； 0016 其中所述的产毒培养基， 其获得方法如下： 2.5克蛋白胨、 2克酵母提取物、 1.5克糊 精、 1.4克L-精氨酸溶于100m。
12、lPBS缓冲液， 以1M HCl调pH至7.4即得； 0017 所述的酵母提取为是试剂YEAST EXTRACT， 市场直接购得。 0018 上述培养基为发明人针对本发明的产气荚膜梭菌设计的全新培养基， 较之现有的 培养基可以更好的符合产气荚膜梭菌培养产毒的需要， 具有明显的针对性和有效性， 且配 制工艺简便、 节约生产成本且稳定性好， 能够满足工业化生产之要求。 0019 其中所述厌氧箱内气体组成按体积分数如下： 88N2， 7H2， 5CO2； 0020 所述的血琼脂为1g葡萄糖和3.8g豆琼脂粉溶于100ml蒸馏水灭菌后， 加入5ml绵羊 血获得。 0021 其中， 为了获得A型和C型菌。
13、的最佳接种比例， 发明人在步骤菌液的制备时， 将A型、 C型产气荚膜梭菌增菌培养液接种体积比分为2ml： 6ml、 4ml： 4ml、 6ml： 2ml三组分别进行了 对应的培养试验， 之后利用常规的双夹心ELISA试剂盒测定各组产毒素量， 测定结果接种比 例为4ml： 4ml时， 产毒素量最大， 故而选择该体积比。 0022 为了验证上述疫苗的效果， 发明人对其进行了效力检测， 具体方法如下： 0023 9日龄健康易感鸡10只， 其中5只皮下注射上述疫苗0.1ml， 另5只鸡不接种作对照， 21日后各肌肉注射致死量的A、 C型产气荚膜梭菌毒素， 观察10日， 对照组全部死亡， 免疫组 全部存。
14、活， 表明该疫苗对鸡的保护率为100。 0024 综上所述， 本发明所获得的疫苗与现有弱毒疫苗、 基因工程疫苗相比， 具有如下有 益效果： (1)本发明疫苗含有 毒素和 毒素两种与鸡坏死性肠炎相关的毒素抗原， 并通过双 夹心ELISA方法测定A型和C型菌的接种比例， 结果表明接种比例在4ml： 4ml时达到最高产毒 素量； (2)由于产毒素量高， 疫苗中每单位所含的类毒素抗原高， 机体相应产生抗毒素抗体 高， 动物保护率高。 疾病发生时， 机体产生的抗毒素抗体可直接中和产气荚膜梭菌产生的外 说 明 书 2/3 页 4 CN 104623652 B 4 毒素， 达到良好的免疫预防效果。 具体实施。
15、方式 0025 实施例1 0026 一种鸡坏死性肠炎的A、 C型产气荚膜梭菌类毒素和菌体二价两类抗原疫苗的制备 方法， 具体步骤如下： 0027 (1).菌种的复苏及增菌 0028 将产气荚膜梭菌标准菌种A型NCTC528、 C型NCTC3180分别接种于血琼脂平板， 39 在厌氧箱中培养24h复苏； 挑取一个典型菌落接种于7ml硫乙醇酸盐流体培养基中39厌氧 增菌培养12h； 0029 (2).菌液的制备 0030 上述获得的A型、 C型产气荚膜梭菌增菌培养液均以4ml接种于100ml产毒培养基 中， 43厌氧箱中160r/min振荡培养5h获得菌液； 0031 (3).菌液的灭活 0032。
16、 将制取的菌液用1MNaOH调pH至7.2， 然后加入甲醛溶液使甲醛质量分数达到0.3 进行灭活， 充分振荡混匀置于37摇床， 4天后灭活完全； 0033 (4).疫苗的制备 0034 灭活检验合格的菌液与灭菌的白油佐剂按体积比1： 2的比例充分乳化， 并按照每 100毫升上述乳化混合液加入0.01克硫柳汞的比例加入硫柳汞即可获得疫苗； 0035 其中所述的产毒培养基， 其获得方法如下： 2.5克蛋白胨、 2克酵母提取物、 1.5克糊 精、 1.4克L-精氨酸溶于100mlPBS缓冲液， 以1M HCl调pH至7.4即得； 0036 所述的酵母提取为是试剂YEAST EXTRACT， 市场直接。
17、购得。 0037 其中所述厌氧箱内气体组成按体积分数如下： 88N2， 7H2， 5CO2； 0038 所述的血琼脂为1g葡萄糖和3.8g豆琼脂粉溶于100ml蒸馏水灭菌后， 加入5ml绵羊 血获得。 0039 实施例2 0040 疫苗效力检验， 具体方法如下： 0041 9日龄健康易感鸡10只， 其中5只皮下注射实施例1中获得的疫苗0.1ml， 另5只鸡不 接种作对照， 21日后各肌肉注射致死量的A、 C型产气荚膜梭菌毒素， 观察10日， 对照组全部 死亡， 免疫组全部存活， 表明该疫苗对鸡的保护率为100， 证明该类毒素和菌体抗原复合 疫苗， 既能针对细菌的感染致病作用， 也能够针对细菌毒素的致病作用对家禽产生很好的 免疫保护效果。 说 明 书 3/3 页 5 CN 104623652 B 5 。