技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种兽用扶正解毒口服液及其制备方法。
背景技术
鸡传染性法氏囊病是由呼肠弧病毒引起的一种急性、高度传染性疾病，由于该病发病突然、病程短、死亡率高，且可引起鸡体免疫抑制，目前仍是养鸡业常见的主要传染病之一，每年给养鸡业造成巨大的经济损失。
兽药典中有扶正解毒散，由板蓝根、黄芪与淫羊藿组成，主要用于治疗鸡传染性法氏囊病。由于扶正解毒散是一种中药散剂，需要通过拌料来服用，一方面服用不方便，另一方面中药散剂不利于吸收，生物利用度相对较低，而鸡传染性法氏囊病发病突然、病程短，在治疗鸡传染性法氏囊病方面效果不是很明显。
发明内容
本发明目的旨在于提供一种兽用扶正解毒口服液，同时提供相应的制备方法则是本发明的另一个目的。
基于以上目的，本发明采取以下技术方案：
一种兽用扶正解毒口服液，由以下重量份的原料药制成：板蓝根20-40份、大青叶20-40份、半边莲20-40份、黄芪20-40份、海藻10-20份、香菇10-20份、淫羊藿10-20份。
一种兽用扶正解毒口服液，由以下重量份的原料药制成：板蓝根40份、大青叶40份、半边莲40份、黄芪40份、海藻20份、香菇20份、淫羊藿20份。
上述兽用扶正解毒口服液的制备方法，包括以下步骤：
a）按比例取各原料药并粉碎，加入8-10倍于原料药重量的水，加入复合酶0.5-1.0份，加热至45-60℃，搅拌提取1-2h，滤过；
b）滤渣再次加入8-10倍于原料药重量的水，加热至45-60℃，搅拌提取0.5-1h，滤过；
c）合并两次滤液，经膜分离、减压浓缩至原料药重量的1-2倍，加入防腐剂，灌装即得。
步骤a）中所述复合酶的重量百分比组成为：胃蛋白酶40-60%、胰蛋白酶40-60%。
步骤a）和步骤b）中搅拌用磁力搅拌器搅拌。
步骤c）中所述膜分离包括微滤和超滤，微滤采用管式陶瓷微滤膜，超滤采用中空纤维超滤膜，截留分子量50000。
用法：混饮，每1L水中添加1-2ml本发明口服液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：1）本发明在2010版《中国兽药典》扶正解毒散基础之上，加入了具有清热解毒、凉血消斑的大青叶，大青叶与板蓝根配伍具有增效协同作用，半边莲清热解毒、利水消肿，大青叶、板蓝根、半边莲三味药材配伍，具有扶正驱邪、清热解毒的功效；黄芪、海藻、香菇中均含有多糖类成分，具有增强免疫作用；
2）增加了有效成分含量，提高治疗疗效；
3）在预防和治疗鸡传染性法氏囊病方面，效果明显；
4）本发明口服液呈黄棕色至棕褐色的液体，味微涩，改变了传统给药途径，通过饮水添加，服用方便，利于吸收，并且大大降低了劳动强度，有利于集约化、规模化养殖；
5）本发明制备方法中，加复合酶，有利于有效成分的溶出，缩短提取时间；采用膜过滤分离技术除杂，和常用的醇沉法相比，保留了有效成分，保证了产品的稳定性，提高了提取效率，缩短生产周期，降低了生产成本。
具体实施方式
本发明通过具体实施例做进一步详细说明：
实施例1
一种兽用扶正解毒口服液，由以下重量份的原料药制成：板蓝根40份、大青叶40份、半边莲40份、黄芪40份、海藻20份、香菇20份、淫羊藿20份。
其制备方法为：a）按比例取各原料药并粉碎，加入10倍于原料药重量的水，加入复合酶（胃蛋白酶40%、胰蛋白酶60%）1.0份，加热至50℃，磁力搅拌提取2h，滤过；
b）步骤a）中所得滤渣加入8倍于原料药重量的水，加热至50℃，磁力搅拌提取1h，滤过；
c）合并两次滤液后，经管式陶瓷微滤膜微滤后，渗透液采用中空纤维超滤膜超滤后，滤清液经过减压浓缩至原料药重量的1倍，加入防腐剂，灌装即得。
磁力搅拌时，在容器内侧底部设置导线线圈，导线线圈与蓄电池连接，从而使盛装原料药和水的容器内侧底部和磁力搅拌器的搅拌子上产生极性相同的弱电流，使得磁力搅拌提取时加入了一定的磁场，达到较好的提取效果。
实施例2
一种兽用扶正解毒口服液，由以下重量份的原料药制成：板蓝根20份、大青叶20份、半边莲20份、黄芪20份、海藻10份、香菇10份、淫羊藿10份。
其制备方法参照实施例1，不同之处在于：步骤a）中复合酶（胃蛋白酶43%、胰蛋白酶57%）0.5份，温度45℃，磁力搅拌提取1h；步骤b）中温度为45℃。
实施例3
一种兽用扶正解毒口服液，由以下重量份的原料药制成：板蓝根30份、大青叶30份、半边莲30份、黄芪30份、海藻20份、香菇20份、淫羊藿20份。
其制备方法参照实施例1，不同之处在于：步骤a）和步骤b）中温度为55℃，复合酶（胃蛋白酶45%、胰蛋白酶55%）0.6份。
实施例4
一种兽用扶正解毒口服液，由以下重量份的原料药制成：板蓝根40份、大青叶40份、半边莲40份、黄芪20份、海藻10份、香菇10份、淫羊藿10份。
其制备方法参照实施例1，不同之处在于：步骤a）中加入8倍于原料药重量的水，加入复合酶（胃蛋白酶48%、胰蛋白酶52%）0.7份，温度为60℃，磁力搅拌提取1h；b）加入10倍于原料药重量的水，温度为60℃。
实施例5
一种兽用扶正解毒口服液，由以下重量份的原料药制成：板蓝根25份、大青叶35份、半边莲22份、黄芪27份、海藻13份、香菇15份、淫羊藿12份。
其制备方法参照实施例1，不同之处在于：步骤a）中加入9倍于原料药重量的水，加入复合酶（胃蛋白酶50%、胰蛋白酶50%）0.8份，温度为48℃，磁力搅拌提取1h；b）中加入10倍于原料药重量的水，温度为45℃；c）中滤浓缩至原料药的2倍。
实施例6
一种兽用扶正解毒口服液，由以下重量份的原料药制成：板蓝根28份、大青叶23份、半边莲30份、黄芪22份、海藻15份、香菇17份、淫羊藿11份。
其制备方法参照实施例1，不同之处在于：步骤a）温度为52℃，加入复合酶（胃蛋白酶60%、胰蛋白酶40%）0.9份，磁力搅拌提取1.5h；b）中温度为50℃。
实施例7
一种兽用扶正解毒口服液，由以下重量份的原料药制成：板蓝根32份、大青叶38份、半边莲25份、黄芪35份、海藻17份、香菇12份、淫羊藿11份。
其制备方法参照实施例1，不同之处在于：步骤a）中加入8倍于原料药重量的水，温度为58℃，磁力搅拌提取1h；b）中温度为58℃。
实施例8
一种兽用扶正解毒口服液，由以下重量份的原料药制成：板蓝根35份、大青叶25份、半边莲28份、黄芪25份、海藻12份、香菇19份、淫羊藿15份。
其制备方法参照实施例1，不同之处在于：步骤a）中加入9倍于原料药重量的水。
实施例9
一种兽用扶正解毒口服液，由以下重量份的原料药制成：板蓝根38份、大青叶30份、半边莲35份、黄芪29份、海藻18份、香菇14份、淫羊藿19份。
其制备方法参照实施例1，不同之处在于：步骤c）中滤液浓缩至原料药的1.5倍。
实施例10
采用薄层色谱法对实施例1样品口服液中的板蓝根、黄芪和淫羊藿进行鉴别。
10.1板蓝根的鉴别
供试品溶液的制备：取实施例1样品口服液10ml，蒸干，残渣加80%甲醇20ml，超声处理30分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml溶解，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：取(R，S)-告依春对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。
阴性对照溶液的制备：按照实施例1的原料药（无板蓝根）比例与制备方法制备出阴性对照样品，取其溶液10ml，处理方法同上述供试品溶液的制备，制得阴性对照溶液。
展开条件的选择：参照薄层色谱法（《中华人民共和国兽药典》附录Ⅵ B）试验，吸取上述三种溶液，分别点于以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶GF254薄层板上，以 石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（1：1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254nm）下检视。观察供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应的位置上，是否显相同颜色的斑点。
取实施例1的三个平行样品，按上述方法进行鉴别，其结果：供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，而阴性对照溶液在相应的位置上无干扰。
10.2黄芪的鉴别
供试品溶液的制备：取实施例1样品口服液20ml，加入水饱和正丁醇振摇提取3次，每次30ml，合并正丁醇液，用氢氧化钠溶液洗涤3次，每次30ml，弃去碱液，再用水洗涤3次，每次30ml，弃去水液，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2ml溶解，加入中性氧化铝（100～120目）2g拌匀，蒸干，用50ml 40％甲醇分次搅拌、洗涤、过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg黄芪甲苷的溶液，作为对照品溶液。
阴性对照溶液的制备：按照实施例1的原料药（无黄芪）比例与制备方法制备出阴性对照样品，取其溶液20ml，处理方法参照供试品溶液的制备，制得阴性对照溶液。
展开条件的选择：参照薄层色谱法（《中华人民共和国兽药典》附录Ⅵ B）试验，吸取上述三种溶液，分别点于同一硅胶Ｇ薄层板上，以氯仿－乙酸乙酯－水（10：5：2）10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃ 加热至斑点显色清晰。置日光下检视和紫外光灯（365nm）下检视。
取实施例1的三个平行样品，参照上述方法进行鉴别，其结果：供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上，置日光下检视，显相同颜色斑点；置紫外光灯（365nm） 下检视，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照样品在相应的位置上无干扰。
10.3淫羊藿的鉴别
供试品溶液的制备：取实施例1的样品30ml，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次30ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇 2ml溶解，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：取淫羊藿对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg淫羊藿的溶液，作为对照品溶液。
阴性对照溶液的制备：按照实施例1的原料药（无淫羊藿）比例与制备方法制备阴性对照样品，取其溶液30ml，处理方法参照供试品溶液的制备，制得阴性对照溶液。
展开条件的选择：参照薄层色谱法（《中华人民共和国兽药典》附录Ⅵ B）试验，吸取上述三种溶液，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，以乙酸乙酯－丁酮-甲酸－水（10:2:2:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365nm）下检视。
取实施例1的三个平行样品，按上述方法进行鉴别，其结果：供试品色谱中，在与对照品溶液色谱相应的位置上，显相同的荧光斑点，阴性对照样品在相应的位置上无干扰。
实施例11 板蓝根含量的测定
采用高效液相色谱法对实施例1、2和3样品中的板蓝根含量进行测定。
高效液相色谱仪P200Ⅱ、色谱数据工作站EC2000、紫外可变波长检测器UV200Ⅱ（购自大连依利特科学仪器有限公司）。
对照品：含量99.5%的 (R，S)-告依春，批号111753-2011c3，由中国食品药品检定研究院提供。
试剂：甲醇（色谱纯）、重蒸水，其它试剂都采用分析纯。
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；磷酸-乙腈-水(5：70：925)为流动相；检测波长为245nm。理论板数按(R，S)-告依春峰计算应不低于5000。
供试品溶液的制备：精确量取本品5ml，置25ml容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，滤过，取滤液，即得。
对照品溶液的制备：精确称取(R，S)-告依春对照品适量，加甲醇制成每1ml含40μg(R，S)-告依春的溶液，即得。
测定方法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μ1，注入高效液相色谱仪，测定，即得。样品中板蓝根含量测定结果如下表1所示。
由表1可知，样品中板蓝根含量：每1ml含板蓝根以(R，S)-告依春计）≥40.0μg。
实施例12 微生物含量测定
按照《中华人民共和国兽药典》2010年版二部附录97页微生物限度检查法，对实施例1、2和3进行测定，测定结果如表2所示。
由表2可知，根据本发明的配方及其制备方法制出的样品中的微生物含量，符合相关规定。
实施例13药效试验
试验药物：实施例1制备的样品口服液。
病毒：鸡传染性法氏囊病毒 IBDV强毒株（毒号：BC-6/85），法氏囊阳性，购自中国兽药监察所。
试验动物：30日龄海兰蛋鸡雏共300只，购自河南雏鹰集团，均未经法氏囊疫苗免疫。
动物饲料：购自郑州市嘉吉饲料有限公司。
饲养条件：均饲养在标准鸡舍，自由采食与饮水。
13.1试验方法
13.1.1 IBDV半数感染量（EID50）的测定
将 IBDV强毒株按照菌种分发证书上的毒力用灭菌生理盐水稀释，取10日龄SPF鸡胚48枚分成8组，每组6枚，将病毒液用灭菌生理盐水分别做10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7七个不同的稀释度，每一组SPF鸡胚接种一个浓度，每个SPF鸡胚接种0.1ml，剩余的一组鸡胚作为对照组，接种0.1ml的生理盐水，全部鸡胚接种后在37℃条件下培养，保持湿度，每天在照蛋器下观察鸡胚存活情况，24h内死亡的鸡胚弃去不计在内，通过连续观察7d，统计各组鸡胚死亡数，按Reed-Muench法计算EID50为10-6/0.1ml。因此，以100 EID50 作为攻毒浓度制备IBDV攻毒液。
13.1.2疾病模型的预试
将IBDV 强毒株用灭菌生理盐水稀释至100EID50，取饲养至24日龄健康非免疫、体重接近的鸡40羽，随机分成低感染组、中感染组、高感染组和健康对照组4组。低感染组、中感染组、高感染组中每羽分别点眼接种0.05ml、0.10ml、0.15ml的IBDV攻毒液。
每天观察记录鸡的精神状态、临床症状、发病情况及死亡情况，连续观察5d，确定复制疾病模型的最佳条件为每羽点眼0.05ml。
13.1.3给药剂量的影响
将30日龄的海兰蛋鸡雏随机分为健康对照组、散剂对照组、高剂量治疗组、中剂量对照组、低剂量对照组、感染对照组6 组，每组 20 只，自由采食与饮水。除健康对照组外，其余组每只经过点眼接种0.05ml IBDV攻毒液进行攻毒，临床症状以法氏囊发生病变和胸肌、腿肌出血为准。
除健康对照组外，其余组海兰蛋鸡雏全部开始陆续出现不同程度的症状，精神萎靡、羽毛松乱逆立，拉黄白色水样稀便或食欲急剧下降等，能检测到IBDV时，散剂对照组拌料给予市售扶正解毒散（购自河南鼎盛生物医药有限公司，下同），混饲1‰，连续服用7d；高剂量治疗组、中剂量治疗组、低剂量治疗组均混饮给药（实施例1样品），每组给药剂量（药与所兑水的体积比例）分别为：2‰、1‰、0.5‰，连续服用 7d；感染对照组不给药，自由饮水。
攻毒后第3d将各组海兰蛋鸡雏每组取5羽剖杀，试验结束时未死亡的鸡，每组任取5羽剖检观察，同时剖检5羽健康对照组做对比，比较每组海兰蛋鸡雏法氏囊、腺胃、胸腿肌的病理变化，并根据病变评分标准进行打分，如肝脏、脾脏、肠道也有病变也应做同样的病变打分，病变打分标准见表3所示，每组典型病变计分情况见表4。
在试验结束时，各组剩余的海兰蛋鸡雏全部处死，用分析天平称重（先期死亡者称取尸重），剖检取出法氏囊、脾脏、胸腺，用滤纸吸净表面水分，电子天平（感量 0.1g）称重，计算法氏囊指数、脾指数和胸腺指数，计算公式如下：
法氏囊指数（mg/g）= 法氏囊重（mg）/体重（g）；
胸腺指数（mg/g）= 胸腺重（mg）/体重（g）；
脾指数（mg/g）= 脾脏重（mg）/体重（g）。
不同给药方案对海兰蛋鸡雏器官指数的影响见表5所示：
注：与健康对照组比较
P<0.05，
P<0.01；与感染对照组比较 ▲ P<0.05，▲▲ P<0.01
由表3、4和5可知，通过不同给药方案对攻毒后的海兰蛋鸡雏进行治疗、观察、统计，与感染对照组之间病鸡体重、抗体水平以及脏器指数相比，治疗效果明显，本发明的口服液较好的改善了病鸡的临床病态，且最佳给药剂量为1‰，是一种疗效确切的抗IBDV中成药。
13.1.4对比试验
13.1.4.1试验方法
将30日龄的海兰蛋鸡雏随机分为健康对照组、治疗对照组、治疗组、预防对照组、预防组、攻毒对照组6 组，每组 30 只，自由采食与饮水。除健康对照组外，其余组通过点眼每只接种IBDV攻毒液0.05ml进行攻毒，临床症状以法氏囊发生病变和胸肌、腿肌出血为准，每组给药方案见表6。
于攻毒12h 后对每组剖检 1 只，如果有 2 只海兰蛋鸡雏出现法氏囊轻微发黄等病变，便开始给药。
13.1.4.2试验结果
（1）发病情况、临床症状与病理变化
攻毒3d后，开始表现轻微临床症状，各组海兰蛋鸡雏的法氏囊眼观病理变化见表7。其中，健康对照组、预防对照组及预防组海兰蛋鸡雏精神、饮食欲均正常，治疗组和治疗对照组海兰蛋鸡雏精神、饮食欲基本正常。攻毒对照组的海兰蛋鸡雏基本上均发病，呈现典型症状，病鸡精神萎顿、呆立或伏卧，聚堆怕冷，全群呈极度衰弱状态，采食量明显减少，饮水量增加，排白色或水样稀便，有的鸡泄殖腔周围沾污粪便，其中有2只鸡死亡，死亡鸡剖检，法氏囊严重发黄、有胶冻样渗出物、剖开后内部呈豆腐渣样、有大量薪液和出血点。攻毒14d各组鸡的法氏囊眼观病理变化见表8。
由表7和8可知，本发明口服液对鸡感染IBDV病毒液后有一定的保护作用，攻毒后给药组鸡出现病理变化的数量少，且病变程度轻于各预防组及散剂对照组和攻毒对照组，本发明口服液具有抗病毒和提高免疫力的功能，可用于鸡传染性法氏囊病的治疗和预防。