技术领域
本发明涉及Notch通路抑制剂在制备治疗mTOR及其上游通路活化导致的哺乳动物包括人的肿瘤的药物中的用途，本发明还涉及Notch通路抑制剂和mTOR通路抑制剂组成的药物组合物在制备治疗mTOR及其上游通路活化导致的哺乳动物包括人的肿瘤的药物中的用途。
背景技术
信号传导通路异常是肿瘤的重要特征。其中，膜受体酪氨酸激酶-PI3K-AKT-mTOR信号通路对细胞存活、生长和增殖起重要作用，该通路往往在肿瘤中高度活化(1，2，3)。mTOR(Gene ID：2475)是一丝/苏氨酸激酶，它的功能主要是作为营养和能量的感受器，调节蛋白合成和自噬水平，进而调控细胞生长和存活(4-11)。mTOR可以以两种状态存在，对雷帕霉素敏感的mTOR复合物1(mTORC1)，和对雷帕霉素不敏感的mTOR复合物2(mTORC2)(4，5)。在人类肿瘤中，该通路的活化往往是通过其上游活化因子的功能获得型突变，如编码表皮生长因子受体(EFGR)、NF1、PI3K或AKT基因的突变；或通过其上游抑制因子的功能丧失型突变，如PTEN，LKB1或结节性硬化症(TSC)基因TSC1和TSC2(1，2)。但是，mTOR及其上游通路活化促进肿瘤生长的确切机制仍然未知(1，2，12-14)。
低分化是肿瘤细胞的一个重要特征，细胞分化异常发生在几乎所有肿瘤中，分化程度越低则临床预后越差。由TSC1或TSC2的失活变异导致的肺淋巴管肌瘤病(lymphangioleiomyomatosis，LAM)和结节硬化症(Tuberous Sclerosis Complex，TSC)(14，15)，其肿瘤具有细胞分化和增殖异常的特性(16-18)。TSC1/TSC2蛋白复合体是mTOR信号通路的主要负调节因子(12，13)。生理水平的mTOR为细胞分化所必需(19-22)，因此mTOR的高度活化可能对TSC1-TSC2蛋白复合体缺失情况下细胞的异常分化起作用。据推断，TSC和LAM的病理学特征可能是由细胞分化调节因子的失活而导致(19-22)。同时，我们的实验发现，mTOR功能亢进会抑制细胞的分化，因此mTOR活化致瘤的机制可能是通过Notch抑制细胞分化来实现的。
Notch(Gene ID：4851，其核苷酸序列见SEQ ID NO：1，氨基酸序列见SEQ ID NO：2)是细胞分化调节因子中重要的一员。它是一跨膜受体，与配体结合导致Notch胞内结构域(NICD)从膜上剪切并转移入核，而后与CSL家族DNA结合蛋白构成转录活化复合体，激活Notch下游靶基因，如hairy and Enhancer-of-split 1(Hes1)的转录(23)。以上全过程均在多水平上被调控(25)。Notch信号调节细胞的分化、增殖、存活，以及致癌性转化过程，该调节与剂量和环境有关(23，26-31)。因此，mTOR与Notch潜在的功能性相互作用可能对肿瘤生长起重要作用。
现有技术表明mTOR通路抑制剂雷帕霉素可能在下述疾病的治疗中发挥作用。(图1)
肺淋巴管肌瘤病(Lymphangioleiomyomatosis，LAM)
它是一种由肺部平滑肌无序增生直至遍布细支气管、肺泡间隔、血管周隙和淋巴管而导致的呼吸系统和淋巴管阻滞疾病，可发展为肺囊肿、气胸、乳糜性胸腔积液等。LAM仅在育龄女性中发病，同时见于结节硬化症患者。鉴于LAM仅于育龄妇女中发病，其治疗多围绕限制和消除雌激素的影响。但是，目前治疗情况并不理想，并大多伴有较严重的副作用(32，33)。此外，当肺功能恶化到不足以支撑身体需氧时，病人需进行肺移植手术。近年来，我们发现该病由TSC1或TSC2突变引起mTOR活化(34)。目前，用雷帕霉素治疗LAM的临床试验正在美国辛辛那提大学和美国卫生研究院(NIH)等医疗机构进行(NCT00414648)。
结节硬化症(TSC)
它是一种遗传疾病，它导致良性肿瘤在一系列重要器官中生长，如大脑、肾脏、心脏、眼、肺和皮肤。其发病症状包括癫痫、发育迟缓、行为异常、皮肤异常、肺和肾脏疾病等。TSC由TSC1和TSC2基因突变引起，导致mTOR过度活化(1，2，12-15，35)。已在小鼠模型中发现，雷帕霉素可用于治疗TSC引起的学习和记忆缺陷(36)，临床试验已经取得了一定效果，但停药后复发(46)。
多发性错构瘤综合症(Cowden syndrome)和PTEN错构瘤综合症
多发性错构瘤综合症是是少见的常染色体显性遗传失调。其特征是多发肿瘤样错构瘤以及某些癌症的高发风险(37)。该病高达80％的病例由PTEN缺失或变异导致，但有些病例发现有PTEN上游靶点或PTEN调控因子变异。该病目前治疗手段主要以手术切除和定期检查预防癌症高发为主。用雷帕霉素治疗多发性错构瘤综合症的临床试验也在多个临床机构进行中(NCT00971789)
纤维神经瘤病
纤维神经瘤病是一种遗传病，为常染色体显性遗传。它是发生在神经系统的良性肿瘤。神经嵴细胞大量增生，挤压周边组织，形成肿瘤，导致皮肤色素沉着、隆起、骨骼问题，脊神经根压迫和其他神经问题。对此病目前尚无有效治疗方法。该病由NF1突变引起mTOR活化(47)，因此用雷帕霉素治疗一型纤维神经瘤病的临床试验也在进行中(NCT00634270)。
其他疾病
如PTEN突变引起的Bannayan-Zonana综合症、前列腺癌、子宫内膜癌和晚期胶质瘤，PI3K突变引起的白血病，LKB1突变引起黑斑息肉综合症(Peutz-Jeghers syndrome，PJS)、家族心脏肥大和肺癌，NF1突变引起的纤维神经瘤病、肾错构瘤、糖尿病黄斑水肿、老年性黄斑变性、PKHD1突变引起的多囊性肾病、前列腺癌、EGFR突变引起的肺癌，AKT突变引起的肺癌，GOLPH3突变引起的肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和黑色素瘤，或结节硬化症相关的皮肤病变如面部血管纤维瘤(皮脂腺瘤)、色素脱失斑。
在上述内容中提及的药物雷帕霉素(Rapamycin)，又名西罗莫司(Sirolimus)，RAD001，CCI779，Bez235，分子式为
别名：
23，27-Epoxy-3H-pyrido[2，1-c][1，4]oxaazacyclohentriacontine，AY22989，西罗莫司
分子式：C51H79NO13
分子量：914.17
CAS登录号：53123-88-9
雷帕霉素是大环内酯抗生素，具有免疫抑制剂和抗癌作用。当它与FKBP12构成复合体后可与mTOR结合并抑制mTOR活性，同时雷帕霉素有将细胞周期阻断在G1期的作用。雷帕霉素作为临床药物具有毒性小，用量低的优点，对肾毒性较低，且无神经毒性。雷帕霉素具有以下功能：
1)免疫抑制剂，广泛用于器官移植
2)抗衰老和延长寿命：2009年一项研究表明，服用雷帕霉素可有效延长小鼠寿命。从小鼠20个月(相当于人类60岁)开始服用雷帕霉素，其总寿命将能延长9-14％(43)。
3)抗增殖
4)结节硬化症治疗
5)癌症治疗
6)孤独症的潜在治疗药物
已知的Notch通路抑制剂包括下述物质。
DAPT，其分子式为
别名：N-[N-(3，5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester，γ-secretase inhibitor(GSI)
分子式：C23H26F2N2O4
分子量：432.46
CAS登录号：208255-80-5
Compound E，别名：
(S)-2-(2-(3，5-difluorophenyl)acetamido)-N-((S)-1-methyl-2-oxo-5-phenyl-2，3-dihydro-1H-benzo[e][1，4]diazepin-3-yl)propanamide
分子式：C21H30O5
分子量：362.46
CAS登录号：50-23-7
能特异性抑制Notch的siRNA、microRNA和抗体等。
如上所述，mTOR与Notch潜在的功能性相互作用可能对肿瘤生长起重要作用，因此，如果能证实Notch通路的抑制剂可以抑制mTOR的活化，则由于mTOR活化导致的肿瘤或其他疾病均可以被Notch通路抑制剂所治疗，换言之，如果上述推测能够被证实，则现有mTOR抑制剂雷帕霉素可以治疗的肿瘤或其他疾病均可以被Notch通路抑制剂所治疗，从而为mTOR活化导致的肿瘤或其他疾病的治疗提供一条新的途径。
发明内容
因此，本发明的技术目的是探讨Notch通路抑制剂在mTOR通路活化导致的肿瘤的作用方式及该作用方式在mTOR通路活化导致的肿瘤中的用途。
因此，本发明的第一方面涉及一种Notch通路抑制剂在制备治疗mTOR及其上游通路活化导致的哺乳动物包括人的肿瘤的药物中的用途，其中所述Notch通路抑制剂是导致Notch信号传导抑制的作用剂，其原理包括但不限于抑制γ-分泌酶及抑制随之发生的Notch受体剪切，抑制Notch转移至细胞膜，抑制配体和受体的表达和功能，抑制配体更新、转移、剪切和内吞，改变Notch或Notch功能域的糖基化或泛素化，改变Notch协同因子或效应因子的表达或功能，通过改变骨髓或循环血液中未分化细胞的分化水平和数量改变Notch水平，优选地，所述Notch通路抑制剂选自DAPT、Compound E、MK0752、L-685，458、分泌蛋白EGFL7(Epidermal Growth Factor-like domain 7，GeneBank Gene ID：51162)、能抑制或阻碍Notch配体与受体结合的因子、能特异性抑制Notch的siRNA、能特异性抑制Notch的microRNA、能特异性抑制Notch的抗体，以及全身或局部转入、表达或激活编码Notch组成因子或其显性负相的DNA质粒，更优选地，所述Notch通路抑制剂选自DAPT或Compound E，最优选地，所述Notch通路抑制剂是DAPT；优选地，所述能特异性抑制Notch的siRNA或能特异性抑制Notch的microRNA的靶序列为GeneBank Gene ID：4851所示的核苷酸序列或其部分序列，优选地，所述siRNA为SEQ ID NO：25所示的序列，所述能特异性抑制Notch的抗体的抗原为GeneBank GeneID：4851所示的氨基酸序列或其部分序列；优选地，所述mTOR及其上游通路活化导致的哺乳动物包括人的肿瘤选自PDGFR突变引起的成神经管细胞瘤，EGFR突变引起的肺癌、AKT突变引起的肺癌，PI3K突变引起的白血病，PTEN突变引起的多发性错构瘤综合症或Bannayan-Zonana综合症、前列腺癌、子宫内膜癌和晚期胶质瘤，TSC突变引起的肺淋巴管肌瘤病、结节硬化症、或结节硬化症相关的皮肤病变如面部血管纤维瘤(皮脂腺瘤)、色素脱失斑，NF1突变引起的纤维神经瘤病、肾错构瘤、糖尿病黄斑水肿、老年性黄斑变性，PKHD1突变引起的多囊性肾病、前列腺癌，LKB1突变引起黑斑息肉综合症、家族心脏肥大和肺癌，GOLPH3突变引起的肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和黑色素瘤，更优选地，所述mTOR及其上游通路活化导致的哺乳动物包括人的肿瘤选自肺淋巴管肌瘤病、PTEN错构瘤综合症或纤维神经瘤病，最优选地，所述mTOR及其上游通路活化导致的哺乳动物包括人的肿瘤是肺淋巴管肌瘤病。
本发明的第二方面涉及一种活性成分由治疗有效量的Notch通路抑制剂和mTOR通路抑制剂组成的药物组合物在制备治疗mTOR及其上游通路活化导致的哺乳动物包括人的肿瘤的药物中的用途，其中Notch通路抑制剂和mTOR通路抑制剂的剂量比为1∶10000-10000∶1，优选地，所述剂量比为1∶5000-5000∶1，优选地，所述剂量比为1∶2500-2500∶1，，优选地，所述剂量比为1∶10000-1∶1000，优选地，所述剂量比为1∶5000-1∶2500，优选地，所述剂量比为1∶1000-1000∶1，优选地，所述剂量比为1∶100-100∶1，优选地，所述剂量比为1∶10-10∶1，最优选地，所述剂量比为1∶1，优选地，所述Notch通路抑制剂选自DAPT、Compound E、MK0752、L-685，458、分泌蛋白EGFL7(Epidermal Growth Factor-like domain 7，GeneBank Gene ID：51162)、能抑制或阻碍Notch配体与受体结合的因子、能特异性抑制Notch的siRNA、能特异性抑制Notch的microRNA、能特异性抑制Notch的抗体，以及全身或局部转入、表达或激活编码Notch、其蛋白复合物组成因子，或其显性负相的DNA质粒，优选地，所述Notch通路抑制剂选自DAPT或Compound E，最优选地，所述Notch通路抑制剂是DAPT；优选地，所述能特异性抑制Notch的siRNA或能特异性抑制Notch的microRNA的靶序列为GeneBank Gene ID：4851所示的核苷酸序列或其部分序列，优选地，所述siRNA为SEQ ID NO：25所示的序列，所述能特异性抑制Notch的抗体的抗原为GeneBank Gene ID：4851所示的氨基酸序列或其部分序列；优选地，所述mTOR通路抑制剂选自雷帕霉素、Temsirolimus(CCI-779)、RAD001、ridaforolimus，优选地，所述mTOR通路抑制剂是雷帕霉素，优选地，所述mTOR及其上游通路活化导致的哺乳动物包括人的肿瘤选自PDGFR突变引起的成神经管细胞瘤，EGFR突变引起的肺癌、AKT突变引起的肺癌，PI3K突变引起的白血病，PTEN突变引起的多发性错构瘤综合症或Bannayan-Zonana综合症、前列腺癌、子宫内膜癌和晚期胶质瘤，TSC突变引起的肺淋巴管肌瘤病、结节硬化症、或结节硬化症相关的皮肤病变如面部血管纤维瘤(皮脂腺瘤)、色素脱失斑，NF1突变引起的纤维神经瘤病、肾错构瘤、糖尿病黄斑水肿、老年性黄斑变性，PKHD1突变引起的多囊性肾病、前列腺癌，LKB1突变引起黑斑息肉综合症、家族心脏肥大和肺癌，GOLPH3突变引起的肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和黑色素瘤，优选地，所述mTOR及其上游通路活化导致的哺乳动物包括人的肿瘤选自肺淋巴管肌瘤病、PTEN错构瘤综合症或纤维神经瘤病，优选地，所述mTOR及其上游通路活化导致的哺乳动物包括人的肿瘤是肺淋巴管肌瘤病。
换言之，本发明为了明确mTOR和Notch两条通路的关系，检测了多种具有特定遗传背景的小鼠成纤维细胞(mouse embryonicfibroblasts，MEF)以及TSC2失活的小鼠肾脏肿瘤、人癌细胞系、人乳腺癌和LAM组织。研究发现RTK-PI3K-AKT通过mTOR导致Notch活化，而TSC1或TSC2缺失导致的小鼠肾癌和人LAM组织呈现出mTOR-Notch的高度活化。mTOR信号与Notch信号的活化在低分化的乳腺癌组织中高度相关。抑制Notch通路可阻断mTOR及其上游通路活化细胞的肿瘤发生。因此，本发明证实Notch及其配体如Jagged1和下游分子如Hes1均可作为新确认的mTOR下游靶点，均可成为RTK-PI3K-AKT-mTOR通路活化所导致疾病的治疗靶点。本发明使用的细胞和小鼠模型能很好的模拟相关疾病，如TSC1/2变异的MEF作为LAM和TSC细胞模型，PTEN变异作为多发性错构瘤综合症模型，裸鼠成瘤作为肿瘤发生模型，AKT活化突变作为肺癌模型等。本发明的工作表明，Notch作为mTOR的下游调控分子，mTOR过度活化引起的肿瘤可用Notch的抑制剂来治疗。mTOR抑制剂雷帕霉素可抑制细胞增生和炎症反应，正被广泛用于肿瘤治疗的临床试验，其中即包括上述疾病。本发明证实，可以使用mTOR抑制剂雷帕霉素治疗的肿瘤和疾病，其发病往往与Notch通路上调有关，因此可使用Notch抑制剂，如DAPT、Compound E等制剂，及对Notch有抑制作用的siRNA、microRNA以及抗体等治疗可以使用mTOR抑制剂雷帕霉素治疗的肿瘤和疾病，或联合使用雷帕霉素和Notch抑制剂治疗可以使用mTOR抑制剂雷帕霉素治疗的肿瘤和疾病以达到更好疗效。
附图说明
图1：多种人类疾病与mTOR及其上游通路的关系。蓝色字体代表疾病名称，蓝色双直线连接疾病及其相关蛋白。
图2：mTOR是Notch信号的正调节因子。
A.WT，Tsc2-/-，Pten-/-和WT MEF感染含myristoylated AKT1(myrAKT1)的pLXIN-hyg或对照载体pLXIN-hyg(V)的逆转录病毒，经10nM雷帕霉素(R)处理24小时后免疫杂交检测Hes1和phospho-S6(Ser235/236)(p-S6).
B.相同年龄的小鼠正常肾脏组织和Tsc2del3/+肾脏肿瘤组织免疫杂交检测mTOR和Notch信号水平。
C.左侧：Hes1 promoter reporter荧光素酶实验检测WT和Tsc1-/-MEFs经或未经10nM雷帕霉素(R)处理24小时后Hes1-荧光素酶相对活性。右侧：实时定量RT-PCR检测WT和Tsc2-/-MEF中Hes1 mRNA相对水平。误差线代表三次实验的平均值±标准差，*P＜0.05。
D.WT、Tsc2-/-、Pten-/-和WT MEF感染含AKT1E17K(mutAKT)的pLXIN-hyg或其对照载体pLXIN-hyg(V)的逆转录病毒，经10nM雷帕霉素(R)处理24小时，而后免疫杂交检测Notch1活性(NICD)和p-S6。
E.WT MEF感染含NICD的pMig(pMig-ICN1)或其对照载体pMIG(V)的逆转录病毒，经10nM雷帕霉素(R)处理24小时，免疫杂交检测p-S6、NICD和Hes1.
图3、mTOR及其上游通路活化细胞中Notch配体Jagged1表达上升
A.WT，Tsc2-/-，Pten-/-，和WT MEF感染含myristoylated AKT1(myrAKT1)的pLXIN-hyg或对照载体pLXIN-hyg(V)的逆转录病毒，经10nM雷帕霉素(R)处理24小时，而后免疫杂交检测Jagged1.
B.WT MEF感染含myristoylated AKT1(myrAKT1)的pLXIN-hyg或对照载体pLXIN-hyg(V)的逆转录病毒，实时定量RT-PCR检测Jagged mRNA水平。在Tsc2-/-和WT MEF中对Jagged1、Jagged2、Dll1、Dll3和Dll4进行同样检测。误差线代表三次实验的平均值±标准差，*P＜0.05。
C.siRNA敲低Jagged1处理Pten-/-MEF细胞导致Jagged1，NICD，和Hes1表达水平下降。无靶点随机siRNA用为对照。
图4、mTOR通过Notch调节细胞分化
A.稳定表达外源性PPARγ的WT，Tsc1-/-或Tsc2-/-MEF细胞感染pMIG-DNL1(D/N)或pMIG(V)逆转录病毒，而后诱导脂肪分化。上：脂滴油红O染色(200X)；下：免疫杂交。
B.WT或Tsc1-/-MEF细胞稳定表达外源性的PPARγ，在脂肪分化过程中经或未经100nM Compound E(Comp.E)处理。左：脂滴油红O染色(200X)；右：免疫杂交。
C.在Tsc2-/-MEF细胞中siRNA敲低Notch1，诱导脂肪分化。无靶点随机siRNA用为对照。Left panel：左：脂滴油红O染色(200X)；右：免疫杂交。
D.WT MEF细胞感染pLXIN-hyg表达Jagged1或对照载体pLXIN-hyg(V)逆转录病毒，诱导脂肪分化。左：脂滴油红O染色(200X)；右：免疫杂交。
图5、阻断Notch可抑制mTOR活化细胞的肿瘤发生，
A.Tsc2-/-MEF、AKT1E17K(mutAKT1)MEF细胞和PC3细胞经或未经50μM DAPT处理，MTT检测细胞增殖。误差线代表三次实验的平均值±标准差，*P＜0.05。
B.Pten-/-MEF感染pMIG-DNL1-GFP(D/N)或对照载体pMIG(V)病毒，经裸鼠皮下注射，检测肿瘤形成(上)和存活(下)。
图6、在人肿瘤中mTOR调节Notch信号，
A.人乳腺癌细胞系(MCF7and MDA-MB-468)、前列腺癌细胞系(PC3)、肺癌细胞系(A549)、胰腺癌细胞系(PANC-1)和肝癌细胞系(HepG2)经10nM雷帕霉素(R)处理24小时，免疫杂交检测mTOR-Notch信号通路组成成分。
B.PC3细胞感染pLXIN-hyg或pLXIN-hyg-Pten逆转录包装病毒，而后免疫杂交检测PTEN和mTOR-Notch信号通路组成成分。
C.人乳腺癌组织免疫杂交检测mTOR-Notch信号通路组成成分水平。图示为一组代表性组织样品。样品组织分化程度如图所示。
图7、Notch信号被mTOR复合物1调控，
A.Tsc2-/-MEF经siRNA敲低mTOR表达48小时，而后免疫杂交检测Notch活化水平。无靶点随机siRNA用为对照。
B.Tsc2-/-MEFs经siRNA敲低rictor表达48小时，而后免疫杂交检测Notch活化水平。无靶点随机siRNA用为对照。
C.示意图显示RTK-PI3K-AKT-mTOR通路通过Jag-Notch级联调节细胞分化和增殖。当受体酪氨酸激酶被激活，PI3K活化AKT，AKT磷酸化TSC2，同时减少TSC1/TSC2复合物对Rheb-GTP的GAP活性，提高Rheb-GTP水平。Rheb-GTP活化mTORC1，随之mTORC1通过上调STAT3-p63提高Notch信号。mTORC1通过Notch信号剂量依赖性调节细胞分化和增殖，异常时发生肿瘤或发育缺陷等疾病。
具体实施方式
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。
实施例
实施例1实验材料：
1)试剂
A.细菌培养相关试剂：
酵母粉、胰蛋白胨、琼脂粉(OXOID公司)；氨苄青霉素(北京鼎国生物科技有限公司)。
B.细胞培养相关试剂：
DMEM培养基、RPMI-1640培养基、胎牛血清(GibcoBRL公司)；
青霉素、链霉素(华北制药股份有限公司)；
胰蛋白酶、雷帕霉素、DAPT、Compound E、潮霉素，均购自Sigma公司；
Lipofectamin2000(Invitrogen)；
C.基因克隆及实时定量PCR相关试剂：
DNA高保真聚合酶PfuUltraTM High-Fidelity(Stratagene)；
限制性内切酶ClaI、NotI、BglII、BamHI、XhoI(TaKaRa)
T4DNA连接酶(TaKaRa)
1kb DNA Ladder、DL2000(天根生物有限公司)
GoldViewTM(GV)核酸染料、琼脂糖(赛百盛生物公司)
高纯度质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒(威格拉斯生物技术公司)
Trizol(Invitrogen)
TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(Trans公司)
TransStart SYBR Green qPCR SuperMix(Trans公司)
Dual-GloTM Luciferase Assay System(Promega)
D.Westren blot相关试剂：
Bradford蛋白质定量试剂盒(Tiangen生物技术公司)
预制胶-Bis-Tris 4％-12％(Invitrogen)
Plus2 Pre-Stained Standard(Invitrogen)
十二烷基磺酸钠SDS、三羟甲基氨基甲烷Tris(Promega)；
Tween-20(Ameresco)；DTT(Sigma)
PVDF膜(Immobilon-P，0.45uM，Millipore)；
ECL检测试剂盒(Thermo)
X光片及显影定影浓缩液(Fuji公司)。
E.其他常规试剂
2)抗体：β-Actin(5441)、Notch1抗体购自Sigma公司；phospho-AKT(Ser473)、PTEN抗体购自Cell Signaling公司；aP2和Hes1抗体购自CHEMICON公司；Notch1(NICD)抗体购自Epitomics；TSC2、AKT、Jagged1、c/EBPα抗体及辣根过氧化物酶偶联的二抗均购自美国Santa Cruz公司；pS6(Ser235/236)和S6抗体由多肽(CAKRRRLpSpSLRA和CNGYDTSAQEDMT-NH2)注射兔子，得到免疫血清。
3)质粒和载体：pLXIN-hyg由pLXIN-neo改造而来：PCR方法获得潮霉素的序列，并在两端带有合适的酶切位点，用相同的酶处理pLXIN-neo载体和潮霉素的PCR产物，将载体上的新霉素序列切下，然后经T4连接酶连入潮霉素，从而获得pLXIN-hyg。pLXIN-hyg-Jagged1构建如下：PCR方法获得Jagged1的序列，并在两端带有合适的酶切位点，用相同的酶处理pLXIN-hyg载体，然后经连接酶处理连入Jagged1。慢病毒载体pMIG(pMSCV-IRES-GFP)购自Addgene。pMIG-DNL1-GFP表达MAML13-74-GFP融合蛋白的pMSCV质粒，即将Notch信号下游共转录激活子MAML1的DNA结合结构域的13-74位氨基酸连入pMIG载体中，使其与GFP形成融合蛋白，这样表达出的融合蛋白与细胞内正常的MAML1竞争结合DNA，但无转录活性，用于阻断MAML1，从而阻断Notch通路。pMSCV-PPARγ的构建如下：PCR方法获得-PPARγ的序列，并在两端带有合适的酶切位点，用相同的酶处理pMSCV载体，然后经T4连接酶连入-PPARγ。pMIG-ICN1(表达人类NICD蛋白)，按文献报道(38，39)的方法构建。pLXIN-hyg-myrAKT1(E17K)经如下过程构建：使用PfuUltraTM High-Fidelity DNA聚合酶(Stratagene)重叠PCR扩增AKT1pLNCX-HA-AKT1。PCR扩增pLNCX载体5’AKT1，引物序列P1：5’-gcgtggatagcggtttgactc-3’(SEQ ID No：1)和P2：5’-gatgtacttccctcgtttg-3’(SEQ ID NO：2)。AKT1剩余序列由P3：5’-caaacgagggaagtacatc-3’(SEQ ID NO：3)和P4：5’-tgaatcgattcaggccgtgccgctggc-3’(SEQ ID NO：4)扩增产生。两次PCR产物混合作为模板，由P4和P5：5’-tcaggatccatgagcgacgtggctattgtg-3’(SEQ ID NO：5)扩增，产生AKT1E17K全长。AKT1E17K的Bam H I和Cla I消化产物插入pLXIN-hyg产生pLXIN-hyg-AKT1(E17K)。pLXIN-hyg-Pten由pLXIN-hyg载体插入经Xho I/Not I消化的人PTENPCR产物，PCR引物序列为P6：5’-tgacctcgagatgacagccatcatc-3’(SEQ IDNO：6)和P7：5’-tcatgcggccgctcagacttttgtaat-3’(SEQ ID NO：7)；Hes1荧光素酶报告基因载体及其对照载体pRL-TK、pLNCX-HA-AKT1购自美国Addegene公司。
4)用于实时定量PCR实验的引物：
Jagged1；
P85’-cgcggatccagccgccactgcagccatgaag-3’(SEQ ID NO：8)
P9：5’-ccgctcgaggagagctgcagtctgctttggacc-3’(SEQ ID NO：9)
Jagged2
P10，5’-aatgacaccactccagatgag-3’(SEQ ID NO：10)
P11：5’-ggccaaagaagtcgttgcg-3’(SEQ ID NO：11)
Dll1
P12：5’-gacctcgcaacagaaaaccca-3’(SEQ ID NO：12)
P13：5′-tccgtagtagtgctcgtcaca-3′(SEQ ID NO：13)
Dll3
P14：5’-ctggtgtcttcgagctacaaat-3’(SEQ ID NO：14)
P15；5’-tgctccgtatagaccgggac-3’(SEQ ID NO：15)
Dll4
P16：5’-cttgctgtgggtaagatttggc-3’(SEQ ID NO：16)
P17：5’-cttcttgcataggcgagaaca-3’(SEQ ID NO：17)；
Hes1：
P18 5’-GAGCACAGAAAGTCATCAAAGCCTATC-3’(SEQ IDNO：18)
P19：5’-GCCGGGAGCTATCTTTCTTAAGTGC-3’(SEQ ID NO：19)
β-actin：
P20：5’-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’(SEQ ID NO：20)
P21：5’-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3’(SEQ ID NO：21)
5)siRNA序列：
Jagged1，5′caaggaaauuaccgauaaa-3′(SEQ ID NO：22)
Rictor，5’-aagcccuacagccuucauuua-3’(SEQ ID NO：23)
m TOR，5’-gaacucgcugauccagaug-3’(SEQ ID NO：24)
Notch，5′-uugaugucgaucucgcagg-3′(SEQ ID NO：25)
以上各引物由上海生工生物工程有限公司合成。
6)细胞系：本申请实验中所用细胞系：小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)，包括野生型细胞，Tsc1、Tsc2、Pten敲除的细胞(记为Tsc1-/-、Tsc2-/-和Pten-/-细胞)，如前所述(12，40，41，42)。用于慢病毒包装的人胚肾细胞293T和逆转录病毒包装细胞系pt67购自Clontech公司。肝癌细胞系HepG2；肺腺癌细胞系A549；胰腺癌细胞系PANC-1；前列腺癌细胞系PC3；乳腺癌细胞系MDA-MB468、MCF7购自ATCC。
7)小鼠肾脏肿瘤组织：本实验所用小鼠肾脏肿瘤组织来自两只Tsc2第三外显子杂合缺失的小鼠(月龄分别为19和22个月)和两只野生型小鼠作为对照。小鼠模型构建如文献所述(44)。样品研磨或加适量裂解液后经超声破碎，98℃煮沸10min使蛋白变性，12000g离心5min除去组织碎片，而后按照常规免疫杂交方法检测蛋白含量。操作规程经美国波士顿比较医学动物中心(Center for Animal Resources andComparative Medicine，Boston，MA，USA)批准。
8)人乳腺癌组织：乳腺癌组织标本，取自北京协和医院2008年12月至2009年3月间收治的乳腺浸润性导管癌病例。术中取材后(肿瘤中心部位约100mg)迅速置于1.5mlEP管内投入冰壶中冷冻保存，置于-80℃超低温冰柜中。全部患者均为女性，年龄31～72岁，中位年龄51.6岁。取部分样本经病理切片检测分化程度，部分样品研磨或加适量裂解液后经超声破碎，98℃煮沸10min使蛋白变性，12000g离心5min除去组织碎片，而后按照常规免疫杂交方法检测蛋白含量。
9)实验动物
裸鼠(BALB/c种系)，雄性，6-8周龄，购于北京协和医学院动物所。实验小鼠在裸鼠专用培养环境中饲养。
实施例2实验方法
1)真核细胞转染
A、质粒DNA的转染
(1)选取对数生长期状态良好的细胞，转染前一天，用0.25％胰酶-EDTA消化，接种于12孔板中，使培养细胞在24小时内达到70％的汇合率以适合转染(不同细胞根据经验可有不同的要求)。
(2)转染前2-4小时，将细胞培养基换成不含抗生素、不含血清的DMEM培养基，使细胞处于饥饿状态有助于DNA进入细胞。
(3)将5μL的Lipofectamine 2000稀释于100μL无抗生素无血清培养基中，轻柔混匀，室温放置5min。
(4)将1.6μg的质粒DNA稀释于100μL无抗生素无血清DMEM培养基中，轻柔混匀。
(5)将DNA稀释液与Lipofectamine 2000稀释液混合，轻柔混匀，室温放置20min。
(6)将12孔板的细胞更换新鲜的无血清无抗生素的DMEM培养基500μL，将上述混合物加入到孔板的细胞中，充分混合，置于37C、5％CO2培养箱中培养4-6h，换成含10％胎牛血清的完全培养基，继续培养24-48小时，根据不同的目的可进行筛选或者检测。
B、siRNA的转染
常规化学合成siRNA(广州锐博生物公司)，用RNase free ddH2O配置成20μM的贮存液，分装后于-80℃保存半年以上，避免反复冻融，使用时冰上放置，实验过程需要RNase free的环境和tip、EP管。
而后使用lipofectamine 2000(Lipo 2000，Invitrogen)转染siRNA：
(1)转染前一天，接种适当数量的细胞至12孔细胞培养板中，每孔中加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到30～50％。转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，从而降低细胞的转染效率。
(2)准备siRNA-lipo2000混和液
a.将转染试剂lipo2000轻轻摇匀，然后按每孔2μL的量，用100μL不含血清培养基稀释，轻轻混和，室温孵育5min；
b.100μL不含血清的培养基稀释siRNA，使其终浓度为100nM，轻轻混和；
c.将稀释好的lipofectamine2000与siRNA轻轻混和，室温静置20min以形成siRNA-lipo2000混和物。
(3)将siRNA-lipo2000混和液细胞培养板中，用无血清培养基补足500μL体积，轻轻摇晃，使之混和；将培养板置于37℃，5％CO2的培养箱中培养，4～6小时后，可以将孔里含有siRNA-lipo2000混合液的培养基移去，更换新鲜的生长培养基，继续培养至24～48h进行检测或其他实验。
(4)干扰效率检测：一般在siRNA转染后24h即可以采用RT-PCR(半定量)或Real-time PCR(定量)检测到靶mRNA水平的降低。蛋白水平的检测一般从36h开始检测，检测时间受细胞内蛋白质表达量、蛋白质本身的半衰期等因素的影响，可在36、48、72、96h多点检测，手段有Western-blot、免疫组化等。
3)病毒的获得及稳定转染细胞系的建立
A、逆转录病毒：相关质粒利用上述转染方法，转染到逆转录病毒包装细胞系pt67细胞中，48小时后用100μg/ml潮霉素B(pLXIN-hyg)或2μg/mL嘌呤霉素(pMSCV)进行筛选，待阴性对照组细胞(正常的PT67细胞)全部死亡，则认为余下的细胞为转染成功的阳性细胞，产生病毒分泌到培养基中。收集培养上清，经0.45-μm滤膜过滤，-80℃可储存两个月，或可直接用于感染其他细胞。感染实验组细胞时，将1mL病毒液与1mL培养基混合加入到六孔板细胞中，同时加入4μg/ml的聚凝胺增强感染效率。感染后48小时换成相应的药物筛选培养基，直到得到阳性克隆。
B、慢病毒：表达DN-MAML1的载体pMIG-DNL1为慢病毒载体。慢病毒包装细胞293T接种于10-cm细胞培养皿中，汇合率达70％时即可进行转染。pMIG_DNL1或空载体对照pMIG与辅助质粒delta8.9、VSVG以4∶3∶1的比例进行共转染，48小时收集培养上清并过滤得到病毒液，同样方法感染实验组细胞，可在荧光显微镜下观察绿色荧光阳性的细胞达80％以上可用于后续实验，达近100％时才可作为稳定细胞系保存。
4)细胞中总RNA的提取
A、25cm2培养瓶或者60mm培养皿培养的细胞汇合率达80％，生长状态良好，弃去培养上清，加入1ml TRIZOL，裂解收集细胞到1.5mL离心管中，室温静置10分钟，让细胞充分裂解；
B、加200μL氯仿，剧烈震荡混匀，室温下放置10分钟至分层；
C、在4℃12000×g下离心15分钟，分成3层；
D、将最上层透明上清转入新管，并加入500μL异丙醇，轻轻颠倒混匀，此时管中可能出现絮状沉淀。
E、室温静置10分钟后，或者-80℃沉淀更长时间，在4℃12000×g下离心10分钟，可见胶状的RNA沉淀；
F、倒掉上清，用75％乙醇洗一次；
G、在4℃7500×g下离心5分钟后，倒掉上清，至室温干燥；
H、加适量的RNAase free ddH2O溶解RNA，放在冰上；
I、紫外分光光度计测定RNA浓度：用溶解RNA的ddH2O将RNA稀释40倍，并以该ddH2O作为空白对照，测定OD260、OD280、OD260/OD280、RNA浓度，一般OD260/OD280的比值在1.8-2.0之间时RNA质量最好，本实验中该比值大于1.75时才用于后续实验。
5)Real-time PCR反应
利用Trans Start SYBR Green qPCR SuperMix(Trans公司)
A.反应体系(50μl反应体系为例)
B.PCR条件为：
阶段195℃ 5min
阶段2步骤195℃ 15sec
步骤255℃ 30sec 40个循环
步骤372℃ 15sec
C.追加溶解曲线反应检测引物特异性，从退火温度开始PCR仪每10sec上升0.5℃直到90℃，由峰形图看PCR产物溶链温度从而检测引物特异性。
D.结果分析：由仪器配套专用软件进行结果分析，通过与内参对比检测不同细胞中目的基因mRNA的表达情况。
6)荧光素酶报告基因检测实验
细胞接种于六孔板中，密度达70％时，将Hes1-luc报告质粒(500ng/孔)和编码Renilla荧光素酶的质粒载体pRL-TK(作为内参，25ng/孔)共转染实验组细胞。24小时后，一组细胞用10nM的雷帕霉素处理24小时，用250μL裂解液(Dual-GloTM Luciferase Assay System)裂解收集细胞样品。样品反复冻融两次，离心后的上清用于荧光素酶活性分析。利用Dual-GloTM Luciferase Assay System分析、Berthold荧光分光光度计测量，Hes1转录活性由荧光素酶相对活性来评估。
7)脂肪细胞分化的诱导实验
A.脂肪诱导培养基的配制
起始诱导培养基：含8％胎牛血清的DMEM培养基中按以下浓度加入：
3-异丁基-甲基黄嘌呤抗坏血酸(IBMX) 0.5mmol/L
地塞米松 1μmol/L
胰岛素 10mg/L
维持诱导培养基：含8％胎牛血清的DMEM培养基中只加入10mg/L胰岛素。
B.诱导分化步骤：诱导前一天将1×105个细胞接种于6孔板，培养12小时后，细胞密度应在60-70％左右，将培养液换成起始诱导培养基；48-72小时后换成维持诱导培养基，隔天换液。以上步骤均可调节实验条件如加抑制剂或者改变某个蛋白表达来处理细胞，约一周左右时间可见80％的细胞分化为成熟的脂肪细胞。
C.脂肪细胞分化的评定：收集分化后期的实验组细胞样品，进行westernblot实验检测脂肪细胞特异性标志aP2和c/EBPα以确定分化情况；另外脂肪细胞分化后可见细胞内有脂滴形成，染料油红O可使这种脂滴特异性着色，染色步骤如下：
试剂配制：
油红O 0.5g
异丙醇 100ml
此为油红饱和液，可长期保存，密封避光备。
工作液：60mL储存液加入40mL ddH2O，静置或者过滤以除去残渣；
(1)用PBS缓冲液轻洗细胞2-3次，加4％甲醛(PBS配制)室温固定30分钟；
(2)弃去固定液，PBS洗细胞2次；
(3)加入上述配好的油红O工作液，室温染色1小时或37℃半小时；
(4)弃去油红O染料，可用60％异丙醇快速洗细胞两次，以减少背景染色，然后加ddH2O浸没细胞，拍照(也可于常温储存方便时拍照)。
8)细胞增殖实验
MTT法测定细胞增殖情况：96孔板每孔接种5000个细胞，12小时内用不同浓度的DAPT或者DMSO(空白对照)处理细胞。加药前及加药后的24h、48h和72h分别检测细胞增殖情况。检测时，小心吸去培养上清，加入100μl新鲜培养基，每孔加20μl MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养2-4h，然后吸掉上清，每孔加入150μl DMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。同时设置空白对照孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，每组设定3复孔。以加药前的吸光值作为100％，各时间点与其相比，应用Excel表格绘制出生长曲线。
9)Western Blotting
A、所用溶液
细胞裂解液：2％SDS，10％glycerol，10mM Tris，pH 6.8，100mMDTT；
MES电泳缓冲液：9.76g MES，6.06g Tris base，20％SDS，加水至1升；
转膜缓冲液：3.03g Tris碱，14.41g甘氨酸，200mL甲醇，加去离子水定容到1000mL；
封闭液：含有5％脱脂奶粉的TBS-T溶液或含5％BSA的TBS-T溶液；
TBS-T缓冲液：100mL 1M Tris-Cl(pH7.5)，9g NaCl，0.5％Tween20，加去离子水定容至1000mL；
B、实验步骤
(1)收集样品
细胞样品：六孔板培养的细胞密度达80-90％，用预冷的1×PBS洗两遍，然后加入800μL裂解液，98℃煮沸10分钟，12000g离心5min，除去细胞碎片，上清即可进行电泳分离或储存在-20℃冰箱备用。
组织样品：取肾脏组织或肿瘤组织，加入适量裂解液，超声破碎，98℃煮沸10分钟，离心取上清，备用。
(2)电泳：使用Invitrogen公司的Bis-Tris预制胶，MES电泳缓冲液，电泳条件为恒压100v 30min，120v 1.5h左右，分离各蛋白。
(3)转膜：将合适大小的PVDF膜首先置于甲醇中浸润15sec-5min，然后将膜、海绵和whatman 3MM滤纸浸泡在转膜缓冲液中平衡。按照‘滤纸-膜-胶-滤纸’的顺序，赶走中间的气泡，放于两个海绵垫之间，转膜时胶在负极，膜在正极。转膜条件为恒流300mA2h，冷环境。
(4)封闭：转膜结束后，用TBST润洗膜除去残余甲醇，于封闭液中室温封闭1h或者4℃封闭过夜。
(5)抗原抗体反应：封闭后的膜用TBST洗去封闭液。按一定比例稀释一抗(3％脱脂奶或BSA或者特定的抗体稀释液)，室温孵育至少1h或4度过夜。回收一抗，TBST洗膜3次，每次5-10分钟。二抗以1∶5000的比例稀释，室温孵育1-3h，TBST洗膜3次，每次5-10分钟。
(6)显色反应(ECL发光法)：ECL发光试剂A、B液等体积混合，轻轻吸干膜上的TBST液体，加混匀的发光试剂反应约1min后，吸干发光试剂，于暗室中用X光片曝光，根据条带强弱选取不同的曝光时间，经显影、定影，即可观察结果。
10)Balb/c裸鼠成瘤实验
SPF级6-8周龄雄性裸鼠12只，随机分成2组，每组6只。将对照组和实验组细胞用胰酶消化，无血清DMEM将细胞悬起，并用DMEM洗一遍，细胞计数，然后用DMEM无血清培养基制成单细胞悬液1×106/100μl，用一次性无菌注射器注入裸鼠背部皮下，注射前用75％乙醇消毒局部皮肤。接种后置于SPF级动物实验中心饲养。每日观察裸鼠一般情况，包括活动量、进食、大小便、肤色，待肿瘤出现后隔日用游标卡尺测量肿瘤块最大直径(L)和最小直径(W)，以V＝1/2×L×W2计算肿瘤的体积，并记录体重情况。当肿瘤体积大于1cm3、或有坏死溃疡及体重降低超过10％，记为裸鼠已经死亡，断颈处死。所得数据用GraphPad Prism软件分析。
11)人类肿瘤芯片数据生物信息学分析：LAM患者结节样本在RedHat Linux平台(http://www.redht.com)经R语言(version 2.8.1，http://www.R-project.org)分析。相关基因通过由sigPathway运算法则计算得出的p值和t值确定(P＜0.01)。基因与探针对应参照AffymetrixHuman Genome U133芯片注释(R package of Affymetrix HumanGenome U133 Set，chip hgu133a)
12)统计学分析：小鼠肿瘤发生和生存曲线使用GraphPad Prism进行Kaplan-Meier log-rank检验得出。细胞增殖和实时定量反转录PCR(real-time RT-PCR)数据使用Excel软件进行Student’s t检验(2-tailed)。人乳腺癌组织的蛋白质表达通过使用AlphaEaseFC Imaging软件(购自Alpha Innotech)进行定量分析，以β-actin为对照，计算相关蛋白的相对表达水平，使用Stata 9.0软件(StataCorp)进行正常最小平方回归(Ordinary Least Squares regression，OLS)分析，检测蛋白表达水平的相关性。
实施例3实验结果
1、mTOR是Notch通路的活化调节因子
为检验mTOR对Notch信号有调节作用这一推断，首先使用Tsc1或Tsc2缺失导致mTOR高度活化的MEF细胞，通过检测Notch的直接下游分子Hes1来检查mTOR高度活化是否导致Notch通路异常。发明人发现，Hes1表达水平在抑癌基因Tsc2或Pten缺失或原癌基因AKT1活化变异(myrAKT1)导致mTOR构成性高表达的细胞中大幅提升(图2A)。在全部使用的细胞系中，雷帕霉素处理都导致Hes1表达水平下降，说明Hes1表达水平依赖于mTOR(图2A)。小鼠肾脏肿瘤中由Tsc2第3外显子缺失导致mTOR活化，引起Hes1表达升高(图2B)。启动子荧光素酶实验和real-time PCR检测显示Hes1启动子活性和转录水平在mTOR活化情况下升高，显示Hes1表达水平升高可能是由于mTOR依赖的转录水平活化(图2C)。此外，Notch剪切为NICD结构域水平在Tsc2或Pten缺失或原癌基因AKT1活化变异(myrAKT1)细胞中均升高，而这一升高可被雷帕霉素抑制(图2D)。为了进一步证明Notch依赖的Hes1表达为mTOR下游事件，检测了NICD异常表达对Hes1表达的影响，发现此时Hes1表达不受雷帕霉素影响(图2E)。以上数据显示体内、体外mTOR活化导致Notch信号活化，NICD生成，和Notch下游靶点的升高。
2、mTOR正调节Notch配体Jagged1表达
鉴于前文所述mTOR活化导致Notch活化，我们继而检验了已发现在一些恶性程度较高癌症中高表达的Notch配体Jagged1的表达水平。(45).Jagged1在mTOR活化细胞中表达水平升高，经rapamycin处理下降(图3A)，显示Jagged1的表达受mTOR调节。Jagged1 mRNA在Tsc2-/-和AKT突变表达细胞系中上升，显示mTOR上调Jagged1至少其一部分发生在mRNA水平(图3B)。siRNA敲低Jagged1实验显示，mTOR上调的Jagged1作用于Notch活化和下游Hes1表达(图3C)。与Jagged1相反，其它Notch配体，如Jagged2，Dll1，Dll3，or Dll，其mRNA水平在WT和Tsc2-/-MEF中均无显著差异(图3B)。我们观察到mTOR调节Jagged1与特定细胞系有关，在其他细胞系中我们观察到mTOR提高Jagged2表达水平，同时mTOR调节Jagged1或Jagged2显示相互排斥性。同时，Notch可以通过正反馈途径上调Jagged1，因此Jagged1表达水平的升高可能同时受上游和下游信号通路影响。
3、mTOR通过Notch通路调节细胞分化
鉴于mTOR是Jagged1-Notch-Hes1通路的正调节因子，我们检查了mTOR活化的Notch信号对细胞分化能力的影响。通过显性失活Notch转录共激活因子MAML1(DN-MAML1)(图4A)或Compound E(γ-分泌酶抑制剂，有抑制Notch剪切的作用)(图4B)抑制Notch信号后，抑制表达PPARγ的WT MEF脂原性分化。反之，Tsc1-/-或Tsc2-/-MEF细胞表达PPARγ，经DN-MAML1(图4A)或Compound E(图4B)处理，能显著回复其脂原性分化能力(图4B)。再者，siRNA敲低Notch增加表达PPARγ的Tsc1-/-or Tsc2-/-MEF细胞脂原性分化(图4C)。此外，过表达Jagged1导致的Notch-Hes1活化减少表达PPARγ的WTMEF细胞的脂原性转化。综上，Notch是mTOR信号通路的下游受动因子，mTOR高度活化可通过上调Notch抑制细胞分化。mTOR的两面性可能正是通过Notch对分化所起的双重作用实现。
4、抑制Notch阻碍mTOR活化细胞的肿瘤发生
Notch在肿瘤发生中所起作用与环境有关。在AKT-mTOR信号活化细胞中Notch增强。本发明认为Notch信号活化可能对AKT-mTOR介导的肿瘤发生有重要作用，也因此可以成为mTOR活化肿瘤的治疗靶点。本发明而后发现，通过N-[N-(3，5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester(DAPT)抑制Notch可减弱Tsc2或PTEN(PC3 cells)抑癌基因缺失或AKT1E17K表达导致的mTOR活化的MEF细胞和人肿瘤细胞的增殖(图5A)。此外，通过显性失活的Notch，DNL1(DN-MAML1)抑制Notch活性，可使Pten-/-MEF在裸鼠中的成瘤作用降低(图5B)。
5、在人肿瘤细胞中，mTOR调节Notch信号系统
本发明而后检验了mTOR调节Notch信号是否在人肿瘤细胞中也存在。人乳腺癌细胞系(MCF7和MDA-MB-468)、前列腺癌细胞系(PC3)、肺癌细胞系(A549)、胰腺癌细胞系(PANC-1)和肝癌细胞系(HepG2)经雷帕霉素处理后，Phospho-S6、Notch配体Jagged1和Hes1水平下降(图6A)。此外，在PTEN缺失的前列腺癌细胞系PC3中恢复PTEN可恢复AKT-mTOR-Notch信号(图6B)。因此mTOR-Jagged1-Notch-Hes1信号传导也可见于人肿瘤细胞系。
以上证据证明mTOR调节Notch信号系统存在于人肿瘤细胞系中，本发明预期同样信号调节也存在于人体内肿瘤。本发明检测了已知TSC1或TSC2突变引起mTOR高度活化的LAM组织的mRNAmicroarray数据，与正常肺动脉平滑肌细胞相应数据对照(GeneExpression Omenibus database，GEO)，发现能被mTOR活化，并作为LAM诊断的潜在标记物，VEGF-D，以及Jagged2和Hes1在LAM组织中显著上调(表1)，表明mTOR在人肿瘤中调节Notch。
应用正常最小平方回归方法(Ordinary Least Squares regression，OLS)分析p-S6和Hes1的免疫杂交，本发明发现在导管性乳腺癌组织中p-S6水平与Hes1表达密切相关。(图6C，表2)
表1、人肺LAM组织mTOR-Notch信号系统高度活化
mRNA microarray数据来自14个肺LAM结节和7个肺动脉平滑肌的细胞样本(Gene Expression Omenibus database)；Gene accession：VEGF-1，206742_at；Jagged2-1，209784_s_at；Jagged2-2，32137_at；Hes1-1 203394_s_at；Hes1-2，203395_s_at.I：升高
表2、mTOR与Notch信号系统在人乳腺癌组织中具有相关性
注：人乳腺癌组织中mTOR对Notch作用的OLS回归分析。*，**，***表示显著性依序分别为10％，5％和1％。
6、Notch信号由mTOR复合物1(mTORC1)调控
mTOR可以以两种状态存在，对雷帕霉素敏感的mTOR复合物1(mTORC1)，和对雷帕霉素不敏感的mTOR复合物2(mTORC2)(4，5)。前文所述的mTOR对Notch信号的作用均为雷帕霉素敏感，提示Notch被mTORC1调控。为确认这一模型，在Tsc2-/-MEF细胞中敲低mTOR或rictor(mTORC2重要组成成分)(图7)，结果显示，mTOR下调明显降低Notch信号(图7A)，然而rictor低表达对Notch信号没有明显作用(图7B)。这些结果验证了mTORC1调节Notch信号，这一作用不依赖于mTORC2(图7C)
总结
通过以上数据，本发明阐明了mTOR及其上游通路可通过调节Notch及其下游分子，进而调节细胞增殖和肿瘤发生，mTOR及其上游通路活化引发肿瘤很有可能是通过活化Notch完成。因此本发明证实，mTOR通路活化的相关疾病可通过使用Notch抑制剂，或使用mTOR抑制剂，如雷帕霉素及其他上游抑制剂，联合Notch抑制剂进行治疗。Notch抑制剂包括化学抑制剂，如DAPT和Compound E以及其他抑制剂，如siRNA、microRNA和特异性抗体等。
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序列表
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