技术领域
本发明涉及一种阿托伐他汀钙脂质体制剂，特别是保持高生物利用度的无定形阿托伐他汀钙脂质体制剂，进一步涉及阿托伐他汀钙脂质体固体制剂及其制法，属于医药技术领域。
背景技术
心血管疾病是危害人类健康最常见、最严重的疾病之一，具有“发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高，并发症多”的“四高一多”的特点，目前，我国心脑血管疾病患者已经超过2.7亿人。近年来，国内外的高血压防治指南表明，加大降压力度，积极、持久地使高血压患者的血压降至140/90毫米汞柱以下(最佳应降至130/80毫米汞柱以下)，可以有效地减轻高血压引起的心脑肾等靶器官损害。进一步可以有效地治疗各种类型高血压、心绞痛、动脉粥样硬化，以及预防或治疗糖尿病、糖尿病并发症、脑卒中、心肌梗死、心功能不全、肾功能损害、心室肥厚、动脉瘤、心肌缺血以及青光眼等心脑血管疾病，降低心脑血管病的事件率、死亡率和病残率，改善患者生活质量，延长患者寿命。
阿托伐他汀或其药学上可接受的盐为他汀类血脂调节药，属HMG-CoA还原酶抑制剂。本身无活性，口服吸收后的水解产物在体内竞争性地抑制胆固醇合成过程中的限速酶羟甲戊二酰辅酶A还原酶，使胆固醇的合成减少，也使低密度脂蛋白受体合成增加，主要作用部位在肝脏，结果使血胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平降低，中度降低血清甘油三酯水平和增高血高密度脂蛋白水平，主要用于治疗或预防高胆固醇血症、混合型高脂血症、冠心病或脑中风。
阿托伐他汀钙，化学名为[R-(R，R)]-2-(4-氟苯基)-b，d-二羟基-5-(1-甲基乙基)-3-苯基-4-[(苯胺基)羰基]-1氢-吡咯-1-庚酸钙盐三水合物，分子式为(C33H34FN2O5)2Ca·3H2O，分子量为1209.42，化学结构式为：
阿托伐他汀钙具有高亲脂性，水溶性差，甲醇中易溶，在乙醇或丙酮中微溶，在水中极微溶，在氯仿、乙醚中几乎不溶且具有较强的苦味，对潮湿、光、热和低pH等均敏感，特别在低pH情况下可被降解成内酯。
目前临床上应用的基本上都为普通片，有时存在崩解迟缓、溶出缓慢等问题。与国产普通片剂相比，进口市售普通片剂立普妥其体外溶出较快，但其在处方中也添加了表面活性剂吐温80(王静，林阳，陈燕等.国产与进口阿托伐他汀钙片体外溶出度考察[J].中国药学杂志，2002，37(8)：632.)。
另外，阿伐他汀钙经肝内广泛首关代谢后，绝对生物利用度较低，仅为12％，口服剂量较大，给儿童、老人和吞咽困难的患者带来了不便。
更为重要地，阿托伐他汀钙一般是无定形形式或一种结晶形式(形式I、形式II、形式III和形式IV)存在(WO 97/3958A和WO 97/3959A)。其无定形形式与结晶形式相比表现出不同的溶解特征和生物利用度模式(Konno T.，Chem.Pharm.Bull.，1990，38：2003-2007)。对于某些治疗适应症，生物利用度是决定药物配方中所用物质形式的一个关键参数，并取决于药物配方中所用物质的形式。
由于各种阿托伐他汀形式的溶解度有所不同，如专利申请WO 97/3960特别强调的，并且还间接影响其生物利用度，因此确保药物配方中所用物质的均一性和稳定性非常重要。
脂质体(liposomes)最初是由英国学者Bangham和Standish将磷脂分散在水中进行电镜观察时发现的。磷脂分散在水中自然形成多层泡囊，每层均为脂质的双分子层；囊泡中央和各层之间被水相隔开，双分子层厚度约4nm，后来将这种类似生物膜结构的双分子小囊成为脂质体。
脂质体研究是当前一个十分活跃的领域，脂质体最早是指天然脂类化合物悬浮在水中形成的具有双层封闭结构的泡囊，现在也可以由人工合成的磷脂化合物来制备。20世纪60年代末Rahman等人首先将脂质体作为药物载体应用，近年来，随着生物技术的不断进展，脂质体制备工艺逐步完善，脂质体作用机制进一步阐明，加之脂质体适合体内降解、无毒性和无免疫原性，特别是大量试验数据证明脂质体作为药物载体可以保持药物稳定性、提高药物治疗指数、降低药物毒性和减少药物副作用，并减少药物剂量等优点。
CN101804029A公开了一种阿托伐他汀脂质体，为了克服现有技术中存在的剂型采用单纯的未加任何修饰的阿托伐他汀钙原料药加pH大于5的碱化试剂制得的且该制剂的稳定性和生物利用度差，不能有效发挥阿托伐他汀的药理学活性的缺陷，将其制成阿托伐他汀或其药学上盐的脂质体，上述获得的脂质体及其固定制剂中的阿托伐他汀钙均未克服晶型导致生物利用度问题。
综上所述，鉴于现有技术中阿托伐他汀钙及其固定制剂存在的物化性质以及生物利用度的药效学方面中存在的问题，本发明人通过长期地研究，在付出创造性劳动之后，获得了具有远高于现有技术的生物利用度的阿托伐他汀钙脂质体制剂及其固体制剂。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于不仅克服现有技术中所已知的阿托伐他汀钙的苦味、难溶性以及不稳定性等性质，还能提高含阿托伐他汀钙的制剂的生物利用度。进一步地，本发明的阿托伐他汀钙脂质体由于采用了特定赋形剂，具有更强的抗血小板聚集、活化的作用，对于阿托伐他汀钙的治疗活性产生了协同作用。
本发明的目的之一是提供一种阿托伐他汀钙脂质体制剂，主要由阿托伐他汀钙、磷脂、附加剂制成，其重量份数比为：阿托伐他汀钙1份、磷脂2-5份、附加剂0.8-3份。
制备脂质体制剂常用的膜材料为磷脂和附加剂，其中磷脂通常可选用天然磷脂和合成磷脂，所述天然磷脂为蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄磷脂、蛋黄磷脂酰甘油、蛋黄磷脂酰丝氨酸、蛋黄磷脂酰肌醇、大豆卵磷脂、氢化大豆磷脂、大豆磷脂酰甘油、大豆磷脂酰丝氨酸、大豆磷脂酰肌醇中的一种或几种；所述合成磷脂为二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酸磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰甘油、二硬脂酸磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油中的一种或几种。常用附加剂的膜材料有胆固醇、十八胺、磷脂酸、去氧胆酸钠和泊洛沙姆188。用于制备脂质体制剂的膜材料还有磷脂酰乙醇胺、胆固醇乙脂、谷载醇、牛胆酸钠、磷脂酰丝胺酸、硬脂酰胺、单硬脂酰磷脂酸、单硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二鲸蜡基磷酸盐(DCP)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、单棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二豆蔻酰磷脂酰乙醇胺。附加剂一般用来调节膜结构，改变荷电性质，如胆固醇能使脂质体双分子层膜固化，从而减少自由基的生成，降低了氧化水平，使脂质体稳定性显著增强。
本发明优选的磷脂为大豆卵磷脂与二豆蔻酰磷脂酰乙醇胺的组合，进一步优选是重量份2∶1的组合。
本发明优选的附加剂为胆固醇与十八胺的组合，进一步优选是重量份1∶1的组合。
本发明的阿托伐他汀钙脂质体制剂还可以包含药学上可接受其他的赋形剂，以便更好地促进脂质体的稳定性并保持具有更佳生物利用度的阿托伐他汀钙的晶型。
本发明中脂质体制备采用的磷脂不仅仅是作为脂质体的赋形剂，其重要作用还在于可渗入血小板，使其发生形态改变，进而抑制ADP等所诱导的血小板脱颗粒分泌及蛋白磷酸化作用，因此，具有更强的抗血小板聚集、活化的作用。此外，能明显减少再灌注心肌心律失常的发生，直接保护血管内皮细胞及微血管系统，有利于缺血心肌功能的恢复，挽救缺血心肌，减轻心肌缺血再灌注损伤，缩小心肌梗死面积。
本发明的目的之一是提供一种制备上述阿托伐他汀钙脂质体制剂的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将磷脂、附加剂溶于有机溶剂中，混合均匀，除去溶剂后制得磷脂膜；
2)加入溶有阿托伐他汀钙的缓冲盐使磷脂膜完全水化，成脂质体混悬液；
进一步地，采用本领域的常规喷雾干燥的技术制备成脂质体粉末，冷冻干燥破坏其晶体形式。
本发明还进一步提供了一种上述阿托伐他汀钙脂质体的方法，具体步骤包括：
(1)将大豆卵磷脂与二豆蔻酰磷脂酰乙醇胺以及胆固醇与十八胺溶解于有机溶剂中，置于旋转薄膜蒸发仪上减压除尽有机溶剂，获得了磷脂膜；
(2)加入溶有阿托伐他汀钙的缓冲盐使磷脂膜完全水化，溶液混合均匀，保温50～70℃状态下超声处理40-60分钟；
(3)将上述步骤(2)所得溶液进行喷雾干燥，即得阿托伐他汀钙脂质体粉末。
上述所述的制备方法中，有机溶剂选自乙醇、异丙醇、甲醇、丁酮、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷或醋酸乙酯中的一种或几种，优选为体积比为3∶2的乙酸乙酯和乙醇的混合溶剂。
上述所述的制备方法中，缓冲盐溶液可以为磷酸盐缓冲液、枸橼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液中的一种，优选为pH值为5.6的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液。
本发明的目的之一是提供一种阿托伐他汀钙脂质体固体制剂，具有更为优秀的生物利用度。
所述阿托伐他汀钙脂质体固体制剂，包括颗粒剂、片剂、胶囊剂等临床上常用的剂型。
所述阿托伐他汀钙脂质体固体制剂，包含本发明的阿托伐他汀钙脂质体及其药学上可接受的赋形剂，所述赋形剂包括填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、芳香剂、矫味剂和它们的组合。各种赋形剂在药物组合物中的量可在本领域常规范围内变化。
进一步优选地，基于重量份计，本发明阿托伐他汀钙脂质体固体制剂包括：阿托伐他汀钙脂质体1份、填充剂1.6-3份、崩解剂0-0.2份、粘合剂0.04-0.2份、矫味剂0-17份、芳香剂0-0.6份和润滑剂0-0.06份。
所述填充剂可以选自淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、优化微晶纤维素、粉状纤维素、糖类、糖衍生物、补钙剂以及它们的组合；补钙剂选自碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、枸橼酸苹果酸钙、枸橼酸钙、苹果酸钙、乳酸钙或醋酸钙。
所述崩解剂可以选自羧甲淀粉钠、交联聚维酮、淀粉羟乙酸钠、L-羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠以及它们的组合。
所述粘合剂可以选自聚维酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、淀粉以及它们的组合；聚维酮优选为聚维酮K30。
所述润滑剂可以选自微粉硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硅酸钙、滑石粉以及它们的组合。
所述的矫味剂选自蔗糖、阿斯帕坦、糖精钠、三氯蔗糖、甜菊糖苷、甜菊素中以及它们的组合。
所述的芳香剂选自桔子香精、甜橙油、草莓香精、薄荷脑、奶油香精以及它们的组合。
本发明的目的之一是提供了一种制备上述阿托伐他汀钙脂质体固体制剂的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将阿托伐他汀钙脂质体粉碎，过80目筛，备用；
(2)将填充剂、崩解剂、矫味剂等粉碎，过80目筛，混合，备用；
(3)将上述原辅料混合均匀，加入粘合剂、芳香剂制软材，过筛制粒，烘干，加入润滑剂混合均匀，整粒；
(4)将干燥的颗粒进行分装或压片，制得阿托伐他汀钙固体制剂。
本发明的阿托伐他汀钙脂质体固体制剂，的优点在于：
(1)制得的阿托伐他汀钙脂质体的单位体积中的阿托伐他汀钙含量高，表明了本发明的配方与工艺既可以保证脂质体达到高的包封率，又有稳定的载药量。另外，可以增加阿托伐他汀钙的稳定性，保证其药效，通过稳定性试验和加速时间证明了这一点。
(2)由于磷脂的吸收协同了阿托伐他汀钙的治疗活性，进一步提高了生物利用度高。
(3)本发明制得的阿托伐他汀钙脂质体固体制剂符合工业化大生产的要求，制备工艺简单，成本低。
(4)制得的脂质体固体制剂提高了制剂的产品质量，减少了毒副作用。
具体实施方式
实施例1 阿托伐他汀钙脂质体的制备
处方：
阿托伐他汀钙 100g
大豆卵磷脂 133.3g
二豆蔻酰磷脂酰乙醇胺 66.7g
胆固醇 40g
十八胺 40g
制备工艺：
(1)将133.3g大豆卵磷脂与66.7g二豆蔻酰磷脂酰乙醇胺以及40g胆固醇与40g十八胺溶解于2000ml体积比为3∶2的乙酸乙酯和乙醇的混合溶剂中，置于旋转薄膜蒸发仪上减压除尽有机溶剂，获得了磷脂膜；
(2)加入溶有100g阿托伐他汀钙的pH值为5.6的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液800ml使磷脂膜完全水化，溶液混合均匀，保温70℃状态下超声处理40分钟；
(3)将上述步骤(2)所得溶液进行喷雾干燥，即得阿托伐他汀钙脂质体粉末。
对比例1 阿托伐他汀钙脂质体的制备(各组分的用量比例不同)
处方：
阿托伐他汀钙 100g
大豆卵磷脂 100g
二豆蔻酰磷脂酰乙醇胺 100g
胆固醇 50g
十八胺 30g
制备工艺同实施例1，制得阿托伐他汀钙脂质体。
对比例2 阿托伐他汀钙脂质体的制备(采用冻干方式制成)
处方：
阿托伐他汀钙 100g
大豆卵磷脂 133.3g
二豆蔻酰磷脂酰乙醇胺 66.7g
胆固醇 40g
十八胺 40g
制备工艺：
(1)将133.3g大豆卵磷脂与66.7g二豆蔻酰磷脂酰乙醇胺以及40g胆固醇与40g十八胺溶解于2000ml体积比为3∶2的乙酸乙酯和乙醇的混合溶剂中，置于旋转薄膜蒸发仪上减压除尽有机溶剂，获得了磷脂膜；
(2)加入溶有100g阿托伐他汀钙的pH值为5.6的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液800ml使磷脂膜完全水化，溶液混合均匀，保温70℃状态下超声处理40分钟；
(3)将上述步骤(2)所得溶液分装于不锈钢盘中，置于冷冻干燥机内进行冻干：
a、预冻：将分装好的药液按2℃/分钟速度降温至-40℃，保温冷冻3小时；
b、升华：将预冻好的药液抽真空，至15Pa，然后在8小时内匀速缓慢升温至-20℃，保温2小时，再在5小时内匀速升温至10℃；
c、干燥：将升华完毕阶段结束后的药液在4小时内匀速升温至30℃，保温干燥3小时，制得阿托伐他汀钙脂质体。
实施例2 阿托伐他汀钙脂质体的制备
处方：
阿托伐他汀钙 100g
大豆卵磷脂 333.3g
二豆蔻酰磷脂酰乙醇胺 166.7g
胆固醇 150g
十八胺 150g
制备工艺：
(1)将333.3g大豆卵磷脂与166.7g二豆蔻酰磷脂酰乙醇胺以及150g胆固醇与150g十八胺溶解于6000ml体积比为3∶2的乙酸乙酯和乙醇的混合溶剂中，置于旋转薄膜蒸发仪上减压除尽有机溶剂，获得了磷脂膜；
(2)加入溶有100g阿托伐他汀钙的pH值为5.6的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液3000ml使磷脂膜完全水化，溶液混合均匀，保温50℃状态下超声处理60分钟；
(3)将上述步骤(2)所得溶液进行喷雾干燥，即得阿托伐他汀钙脂质体粉末。
对比例3 阿托伐他汀钙脂质体的制备(组分不同)
处方：
阿托伐他汀钙 100g
二豆蔻酰磷脂酰乙醇胺 166.7g
胆固醇 150g
吐温80 150g
制备工艺同实施例2，制得阿托伐他汀钙脂质体。
实施例3 阿托伐他汀钙脂质体颗粒的制备
处壳(1000袋)：
阿托伐他汀钙脂质体(以阿托伐他汀钙计) 50g
淀粉 150g
蔗糖 850g
聚维酮K30 10g
橘子香精 30g
制备工艺：
(1)将含有50g阿托伐他汀钙的脂质体粉碎，过80目筛，备用；
(2)称取150g淀粉、850g蔗糖过80目筛混合，备用；
(3)将上述原辅料混合均匀，再与30g橘子香精混合均匀，加入3％聚维酮K3080％乙醇溶液330ml制软材，过20目筛制粒，60℃烘干，18目筛整粒，备用；
(4)将干燥的颗粒分装，制得阿托伐他汀钙脂质体颗粒剂。
实施例4 阿托伐他汀钙脂质体片剂的制备
处方(1000片)：
阿托伐他汀钙脂质体(以阿托伐他汀钙计) 50g
淀粉 100g
微晶纤维素 50g
羧甲淀粉钠 10g
聚维酮K30 5g
硬脂酸镁 3g
制备工艺：
(1)将含有50g阿托伐他汀钙的脂质体粉碎，过80目筛，备用；
(2)称取100g淀粉、50g微晶纤维素、10g羧甲淀粉钠过80目筛混合，备用；
(3)将上述原辅料混合均匀，加入5％聚维酮K3080％乙醇溶液100ml制软材，过20目筛制粒，55℃烘干，加入3g硬脂酸镁混合均匀，18目筛整粒，备用；
(4)将干燥的颗粒压片，制得阿托伐他汀钙脂质体片。
实施例5 阿托伐他汀钙脂质体胶囊的制备
处方(1000粒)：
阿托伐他汀钙脂质体(以阿托伐他汀钙计) 50g
淀粉 30g
微晶纤维素 50g
羟丙甲纤维素 2g
滑石粉 3g
制备工艺：
(1)将含有50g阿托伐他汀钙的脂质体粉碎，过80目筛，备用；
(2)称取30g淀粉、50g微晶纤维素过80目筛混合，备用；
(3)将上述原辅料混合均匀，加入2％羟丙甲纤维素60％乙醇溶液100ml制软材，过20目筛制粒，60℃烘干，再与3g滑石粉混合均匀，18目筛整粒，备用；
(4)将干燥的颗粒填充胶囊，制得阿托伐他汀钙脂质体胶囊剂。
试验例1 包封率的测定
取实施例1-2和对比例1-3制得的脂质体混悬液10ml置于已处理的透析袋中，将透析袋浸入透析液(即制备脂质体的水化介质)100ml中，置磁力搅拌器上搅拌，定时更换透析液，12h后将透析液中内容物取出置100ml量瓶中，加入5％乳化剂OP的乙醇溶液10ml破乳，用水定容至刻度。分别取述的实施例1-2和对比例1-3的溶液各20μl，进样分析，计算出阿托伐他汀钙脂质体中包裹阿托伐他汀钙的量W包，根据公式：包封率＝(W包/W总)×100％计算包封率。
表1包封率测定结果
由以上结果可知，本发明制得的阿舒伐他汀钙脂质体包封率很高，基本符合实际生产要求；而本发明范围外的对比例处方配比制得的脂质体包封率很低，和实施例相比有明显的差距，不适合生产要求。
试验例2 稳定性研究
将以上实施例3-5的样品与上市制剂阿托伐他汀钙片(北京红惠生物制药股份有限公司，批号20100428)，在高温40℃、相对湿度75％±5％条件下6个月，进行加速试验考察，比较溶出度和稳定性，结果如下：
表2加速试验考察
由以上结果可知，本发明实施例3-5的样品溶出度均在90％以上，远远高于上市制剂78％左右，说明本发明制得的阿托伐他汀钙脂质体固体制剂提高了其溶解性，从而相应的提高了生物利用度。加速试验6个月后，本发明实施例3-5的样品溶出度、含量和有关物质没有明显变化，而上市制剂含量和溶出度下降较大，有关物质升高明显，说明本发明制得的阿托伐他汀钙脂质体固体制剂的稳定性有所提高。
试验例3 生物利用度研究
将对比例1-3制备的脂质体按实施例4的工艺制成片剂，再按专利文献CN101804029A中的实施例1和6的步骤制备阿托伐他汀钙片剂，和实施例4制备的片剂，上市制剂(北京红惠生物制药股份有限公司，批号20100428)进行生物利用度的比较，结果如下：
表3生物利用度的比较
由以上结果可以看出本发明实施例4制备的片剂生物利用度远远大于对比例1-3和专利文献CN101804029A中的处方制备阿托伐他汀钙片剂，也大于上市制剂生物利用度，说明本发明制备的脂质体固体制剂由于特定磷脂组合的协同作用大大地提高生物利用度，获得了预料不到技术效果。