相关申请
本申请是1996年1月3日递交的申请08/580,980的部分继续申 请，08/580,980又是1995年6月7日递交的申请08/479,328的部分 继续申请，两个申请都是在审，均引入本文作为参考。
发明领域
本发明涉及鉴定所需分子的方法。在特别优选的实施方案中，本 发明涉及鉴定与病变现象如癌(如黑素瘤或肾癌)，霍奇金病，自体免 疫疾病等相关的分子。本发明还包括作为本发明的方法的结果发现的 分离分子如提呈的肽。这些分子特别包括，含蛋白质的分子，编码它 们的分离的核酸分子，和与含蛋白质的分子特异结合的抗体。为方便 起见，将本文描述的方法称为“血清学钓取法”。
背景和现有技术
已经十分肯定的是许多病变现象如感染，癌，自我免疫紊乱等等 其特征为某些分子的不适当的表达，所以这些分子可作为特殊病变或 不正常现象的“标记”。除了它们作为诊断“靶”，即，待鉴定材料 以便诊断这些不正常现象的作用，这些分子还可作为用于生产诊断剂 和/或治疗剂的试剂。一个非限制性的例子是利用癌标记生产特异于 特定标记的抗体。另一个非限制性的例子是利用与MHC分子复合的 肽产生抗不正常细胞的胞溶性T细胞。
当然，这些材料的制备以用于产生它们的试剂的来源为先决条 件。离开某些这样做的方法，从细胞中纯化是费力的。另一个优选的 方法是分离编码特定标记的核酸分子后利用分离的编码分子表达所 需的分子。
目前，已经利用两套计划检测在如人肿瘤中的这些抗原。这些方 案被称为遗传途径和生化途径。如引入本文作为参考的DePlaen等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2275(1988)例举了遗传途径。在该途径中， 将几百个从肿瘤得到的cDNA文库的质粒库转染进受体细胞如， COS细胞，或转染进测试特异抗原的表达的肿瘤细胞系的抗原阴性 突变体。引入本文作为参考的Falk等，自然学351：290(1991)，和 Kawakami等，自然学369：69(1994)例举的生化途径是根据在酸洗 脱与肿瘤细胞的MHC-I分子结合的肽后进行反相高效液相色谱 (R-HPLC)。在与缺失抗原加工能力和诱导胞溶性T-淋巴细胞的特 异反应的突变细胞系的空MHC-I分子结合后，鉴定抗原性肽。这 些反应包括在MTT测定方法或51Cr释放测定方法中可测量的CTL 增殖，TNF释放，和靶细胞的溶解。
对抗原的分子鉴定的这两套途径有下面的缺点：首先，它们是非 常麻烦，耗时和昂贵的；其次，它们依赖于建立具有预定特异性的胞 溶性T细胞系(CTLs)；第三，由于不仅从患有有关疾病的病人，而且 从健康的个体，依据它们的T细胞的全部组成，都可以得到有关的 CTL，所以还没有证明体内它们与相关病理或疾病的发生的关系。
至今，两种方法只成功地鉴定了人肿瘤中的极少数新抗原的事实 最好地证实了抗原的鉴定和分子鉴定的两套已知途径内在的问题。参 见如，van der Bruggen等，科学254：1643-1647(1991)；Brichard 等，实验医学杂志178：489-495(1993)；Coulie等，实验医学杂 志180：35-42(1994)，Kawakami等，美国科学院院刊91：3515- 3519(1994)。
如人所愿的有效的方法是不仅能用于检测与肿瘤相关的抗原，而 且能测定与任何不正常或病变现象相关的分子。这样的方法应简化这 些分子的鉴定，从而使它们能用于如抗体，胞溶性T细胞等的生产。
所以本发明的目的是开发简单检测和分子鉴定在人组织，特别是 肿瘤细胞中的抗原的方法和试剂，这些方法和试剂可用于疾病的分子 诊断和/或感染的和自体免疫的和恶性的疾病的免疫治疗和基因治 疗。在下面的公开物中描述了本发明。
附图的简要说明
图1显示了本发明的途径的原理。
图2显示了带有与1∶100稀释度的病人血清反应的来自肾细胞 明显的癌的cDNA衍生的阳性克隆的硝酸纤维膜。
图3显示了肾细胞癌，正常肾和其它人组织中的HOM-RCC -313克隆的Northern印迹分析图。
图4显示了编码HOM-RCC-313的基因的翻译区。
优选实施方案的详细说明
下面的公开内容描述了称为血清学钓取法的方法。其中，从患有 病变现象的个体中获取细胞样品。优选地，该细胞是病变的例子。例 如，如果个体有黑素瘤，细胞是黑素瘤细胞。如果个体患了如神经紊 乱，那么优选地细胞是患病细胞的样品。这条途径是有理由的，因为 患病细胞最可能是所需的含蛋白质的分子，即，与所需的病变现象有 特异关系的分子的最好来源。
应该注意到代表病变现象的细胞不是可用于本发明的方法的唯 一细胞。例如，非常重要的是，如，测定那些与细胞分化和成熟相关 的细胞“标记”。可想到的例子是生血干细胞。同样，本发明涉及如 特异配体的受体分子的分离。事实上，利用该方法可以测定任何所需 分子的存在。
然后将选择的细胞用于制备互补DNA(即，“cDNA”)文库。该 方法是熟练技术人员所熟知的，不需要在这里重复说明。当然这是根 据测定的事实即，如果细胞表达蛋白质，那么必须存在信使 RNA(mRNA)。这些mRNA分子不能长时间存在，是不稳定的，所以 利用它们操作是不可行的。利用cDNA时带给分子以稳定性对本方法 是非常有帮助的。
一旦制备了cDNA，就可用于构建载体文库。简要地说，处理载 体，如切割和拼接，以使其接受cDNA分子。载体的选择可以变化， 如熟练技术人员熟知的许多这样的例子。
特别优选的是基于病毒的载体。在真核细胞中，基于逆转录病毒 和腺病毒的载体是优选的。这样的载体含有所有或部分病毒基因组， 如长末端重复(“LTRs”)，启动子(如，CMV启动子，SV40启动 子，RSV启动子)，增强子等。当宿主细胞是原核细胞，则细菌病毒 即噬菌体是优选的。这样的载体的例子有基于如λ噬菌体的载体。在 任何情况下，载体可包括超过一个病毒的元件。
将得到的载体转染或转化进宿主细胞，宿主细胞可以是真核的或 原核的。
在本方案中可以利用任何通常用于转染或转化的细胞。优选的材 料包括大肠杆菌菌株，CHO细胞如CHO-1，COS细胞如COS- 7等。同样，酵母细胞，如糖酵母属菌株，假单胞菌属菌株如绿脓杆 菌，芽孢杆菌，已知的昆虫宿主细胞草地粘虫等都可以利用。
一旦受体细胞接受载体，便培养它们，以便表达外源的含蛋白质 的分子。本文使用“含蛋白质”是因为原核细胞只表达蛋白质，而众 所周知真核细胞具有翻译后修饰蛋白质的能力以便产生如糖蛋白，脂 蛋白。同时必须记住的是本文所用的“含蛋白质”也包括肽，如以 MHC分子提呈的肽。
下面描述的方法独立于上面描述的方法而发生，在本发明的这两 个方面没有时间关系。
在如癌和如自体免疫疾病的病变现象中，存在一些针对与病变相 关的分子的免疫反应。这一反应可以包括抗体应答，B细胞增殖， 特异T细胞亚群的增殖，细胞因子生产的增加等。在个体的体液如血 清中，可以发现与应答相关的分子和细胞。不管所需分子是重组地或 是自体产生，免疫效应器都将与其反应。问题在于发现它们，正如实 施例显示，这以唯一的途径进行，首先，将体液或其它所需的样品与 用于转染或转化的同样的宿主细胞样品反应，在这第一步中，宿主细 胞没有被转染或转化，它的结果是去掉任何特异于宿主细胞而不是靶 分子的免疫原性结合配体。这一步是必须的，因为正如上面指出的， 宿主细胞可以是在一些点上个体已经发展了针对其的免疫应答的细 胞，这首先的去杂(stripped)步骤除去了这些免疫成分。
然后进行第二个去杂步骤。在这一步中，将前面去杂的样品与如 上所述同样的宿主细胞的样品反应，这时宿主细胞已经用缺少来自个 体的cDNA的载体转染或转化。这第二个去杂步骤的原因是本发明人 之一所做的观察，在以前面的文献中没有报道。用作载体的材料如噬 菌体病毒等是有用的，因为它们天然地感染细胞。所以，λ噬菌体感 染寄生在人的较下部的消化道的大肠杆菌。过去没有考虑对大肠杆菌 的免疫应答包括这些感染原的应答。所以，通过进行两个去杂步骤， 申请人已经获得除去干扰免疫成分到没有先例的程度的惊人能力。正 如注意到的，首先是针对未转染或未转化的宿主细胞，其次是针对用 不携带cDNA的载体转染或转化的宿主细胞，其中的载体与如上所述 用于携带cDNA的载体的免疫学等价。
特别优选的是利用一些相似的但不同的方法进行这些去杂步骤 的每一步。例如下面的实验，显示吸收于固体柱，然后吸收于硝酸纤 维滤纸。关于为什么利用两个相似但不同的方法得出本文描述的结 果，申请人不希望受任何理论的限制。在下文中，应该注意到，本文 不论何时用到“接触样品”，它不仅局限于一个接触步骤，而且指超 过一个的，优选地是不同的，设计用来从样品中除去干扰结合配体的 接触方案。
应该理解的是这些去杂步骤可以完全独立于用于制备cDNA文 库的步骤来做。例如，如果在“0”天做抗原的测试，样品的去杂可 以在这天之前，一个星期之前等进行。也可以“储存”来自供体或个 体的去杂样品为了将来使用。
使用的样品优选地是血清，但不是必须的，任何含有免疫原性结 合配体的样品可以这样使用。
在本方法的下一步，将携带cDNA和表达异质蛋白质的裂解的转 染细胞与两次去杂处理的样品接触。这一样品应该只含有特异于异质 蛋白质并与其结合的免疫成分。如果通过与如活化滤膜，固体柱等等 接触已经固定了细胞裂解物，有助于这一结合。但是固相结合不是必 要的，因为本领域测定地认为许多可变的测定形式可用于鉴定所需分 子。
一旦免疫成分与靶分子结合，进行另一个步骤是如人所愿的，但 不是必须的。这一附加步骤包括利用第一个免疫成分的一些结合配 体，如携带可鉴定标记的抗-IgG。标记可以是染料，酶，金颗粒， 放射性标记，或任何用于免疫测定的标准标记。
一旦进行鉴定，除去免疫成分，留下靶分子。然后利用本领域的 任何标准方法研究靶分子。
技术人员将注意该方法也导致与所需分子结合的免疫成分的分 离。所以，在本发明的另一个方面，可以分离抗体，如，所需分子的 特异结合配体。
根据本发明可以鉴定和分离的另一种免疫成分是胞溶性T细胞 (下文中的“CTL”)，该T细胞特异于来自已鉴定分子的肽和与这些 肽结合形成复合物的MHC分子的复合物。普遍认可的是CTL应答包 括用循环的T细胞表面的T细胞受体(“TCRs”)鉴定MHC分子和 肽，通常约为8-12个氨基酸长，最优选为9或10个氨基酸长的复 合物。通过与这些“在运动中固定”的复合物结合，TCR发生反应， 包括特异于这些复合物的CTL的增殖的一系列反应。利用本发明的 方法，加另外的步骤可以生产和/或分离这样的CTL。
正如下面的实施例以及一般的公开物中指出的，可以容易地鉴定 编码所需抗原的cDNA。一旦cDNA被鉴定，可以利用它转染在表 面已经存在需要的MHC分子的宿主细胞或已经用编码这些MHC分 子的DNA转染的宿主细胞。表达所需分子的cDNA，加工该分子成 以MHC分子如HLA分子提呈的抗原性肽。从淋巴细胞如自体淋巴 细胞得到抗该复合物的CTL。然后由已知的有限稀释技术从应答细 胞群得到长寿命的CTL克隆。一旦观察到阳性CTL应答，利用已测定 的方法例如，筛选前面鉴定的CTL克隆的特异性的方法，可以鉴定提呈 给CTL的特异肽。或者，可以利用更新描述的方法，研究所需分子的 序列，鉴定潜在的MHC-结合基序，然后分析这些肽，首先分析与相关 MHC分子的结合，然后，如果MHC结合为阳性，分析它们产生识别肽 MHC复合物的CTL的能力。当然，利用已知的技术也可以从细胞中洗 脱肽并作序列分析。
熟练技术人员也将注意到，可以将所需分子的表达与表达其的特 定的宿主细胞联系起来。在这样做的时候，可以提取出表达所需分子 的cDNA，将其测序等。该方法的这一方面是本发明的另一特征。
在下面的实施例中将看到本发明的特异实施方案。图1大概地描 述了通用的方法。 实施例1
为了从人组织建立cDNA文库，根据引入本文作为参考的 Chomzynski，分析生物化学杂志162：156-159(1987)的方法从0.5μg肾 清晰的细胞癌得到和确立了总RNA。用寡聚-dT-纤维素从总RNA提 取mRNA。利用RNase H和DNA聚合酶I，用Gubler和Hoffmann， 基因25：263(1983)描述的方法完成了第一条链cDNA的合成。为了适 应cDNAKlenow酶，用T4 DNA连接酶将带有EcoRI限制酶位点的 衔接头连接到cDNA的末端(Ferretti L和Sgamerella V，核酸研究， 9：3695(1981))。在用酶XhoI限制酶消化后，用Sephacryl 400分离不 同长度的cDNA分子并转染进入λZAPII噬菌体载体(Short等人，核 酸研究16：7583(1988))。在与包装提取物连接后，将重组噬菌体DNA 包装成噬菌体并用于转染大肠杆菌。对文库滴定得到1.8×106个重 组初级克隆。将总的cDNA文库转染进大肠杆菌并扩增，扩增后的 cDNA文库的效价是每毫升1011个噬菌斑形成单位(Pfu/毫升)。将这 些转染细胞用于下面的实验。 实施例2
根据本发明上面所述，利用已经完全耗尽了抗来源于天然和裂解 性λ噬菌体转染的大肠杆菌的抗原的抗体的人血清完成免疫原性物 质的鉴定。为此，如下所述，通过吸收，血清被“去杂”。
在50毫升LB培养基中过夜培养大肠杆菌菌株XL1-Blue的 细菌。在光密度OD600＝1.0后，通过离心沉淀细菌。重悬浮于5m 毫升磷酸缓冲盐(PBS)中，并用超声波处理形成裂解物。将细菌裂解 物结合到活化的琼脂糖的基质上，然后将琼脂糖基质装入柱中，并用 于人血清的吸收。将血清在柱中流过10次。
用离心将指数生长期的大肠杆菌XL1-Blue细菌培养物沉淀， 用106个没有重组插入物的λZAPII噬菌体在0.01M硫酸镁中转染， 并在5毫升LB培养基中温育4小时。以同样于未转染细菌的方式， 利用转染的细菌的裂解物使人血清如上所述再通过柱10次。
为了完全耗尽血清，在琼脂平板上培养来自裂解噬菌体转染的大 肠杆菌细菌的干扰抗体(10小时，37℃)，并在这一培养步骤后将它 们的蛋白质影印到硝酸纤维膜上。之后，将根据上面步骤已经预吸收 的血清转移到影印的硝酸纤维膜上并重复吸收过程五次。按照本发明 加工的血清中基本上去除了抗来自大肠杆菌和噬菌体的抗原的抗 体。 实施例3
在这些实验中，通过下面步骤鉴定了特异于肾癌的抗原。用来源 于所述的cDNA文库的重组噬菌体转染大肠杆菌菌株XL1-Blue， 并以每个含有异丙基硫代吡喃型半乳糖苷(“IPTG”)LB培养基的平 板有4-5×103个噬菌斑形成单位(PFU)的密度铺板。在37℃温育 12小时后，在培养物的顶部放上硝酸纤维膜，再温育培养平板4小 时。接着，在有5％奶粉的Tris-缓冲盐(TBS)中温育硝酸纤维膜1 小时。在TBS中洗硝酸纤维膜3次后，在TBS/0.5％奶粉(w/v)中以1∶ 1000稀释根据实施例2得到的去杂的人血清，并温和摇动温育过夜。 在与硝酸纤维膜一起温育后，取出血清，保留用于其它试验。在与血 清温育后，在TBS中洗涤硝酸纤维膜3次，并与多克隆的碱性磷酸 酶缀合的山羊抗人IgG温育1小时。之后，用TBS/0.01％吐温20(v/v) 重复洗涤硝酸纤维膜。用溶解于TBS的氮蓝四唑氯化物和溴氯-吲 哚-磷酸显色反应，人抗体与表达的蛋白质的结合变成可见的沉积于 硝酸纤维膜上的环状的蓝色沉积物。血清的有效预吸收使得能在37 ℃下显色膜几个小时而不会使由于抗大肠杆菌和噬菌体抗原的抗体 引起的背景反应性影响试验的质量。
将阳性克隆定位于琼脂平板上，转移到转染缓冲液中，并用于第 二轮转染和亚克隆。总共对1.8×106个重组克隆进行了筛选，鉴定 了5个不同的阳性反应克隆。 实施例4
通过转染以及检测与加工的人血清的反应性的重复循环将按照 实施例3得到的阳性克隆，即那些具有来源于加工的人血清结合抗体 的克隆，进行亚克隆形成单克隆。通过从λZAPII噬菌体载体体内切 除克隆带有相关cDNA插入物的P-bluescript噬菌粒(Hay和Short， Strategies 5：16-19，1992)并用于转染大肠杆菌SOLR菌株。在修改的 Birnboim和Doly，核酸研究杂志7：1513(1979)的方法中，在用NaOH碱裂解后，从细菌分离质粒。利用M13正向和M13反向寡核苷酸， 根据Sanger(Proc.Natl.Acad.Sci.USA74：5463(1977))的经典方法序列分 析重组质粒的DNA。在核酸和蛋白质数据库(基因库，EMBL，Swiss Prot)检查得到的DNA序列和产生的氨基酸序列。用内部寡核苷酸继 续序列分析cDNA插入物的序列。分析显示与保藏于数据库的任何序 列都没有同源性。全长的cDNA克隆称为SK313，已经用RACE方 法(Frohman MA，Dush MK，Martin GR，美国科学院院刊85：8998(1988)) 克隆了SK313，其在5’末端具有碳酸酐酶功能区。SEQ IDNO： 1示出了该分子的核酸序列。图2显示了来自这些实验的带有阳性克 隆的硝酸纤维膜。 实施例5
作为这些实验的补充，根据Chomzynski和Sacchi，生化分析162： 156(1987)的方法从一系列恶性和正常人组织中分离RNA。在变性 后，通过电泳在含有1％甲醛的琼脂糖凝胶上分离总的分离的 RNA(Goldberg，美国科学院院刊77：5794(1980))，然后根据已知方法 (Seed，核酸研究10：1799(1982))影印到尼龙膜上。将鉴定的克隆的 放射性标记的cDNA插入物用于杂交。根据已知方法(Geoffrey和 Berger，Enzymol.152：419(1987))进行杂交。用放射自显影和X射线胶 片证实相关RNA的存在。分析证明与正常肾相比，在19个肾细胞癌 的4个中克隆HOM-RCC-313的mRNA过量表达。在结肠的粘 膜组织和正常肾中只发现非常弱的表达。没有证实其它组织中的表 达。 实施例6
为了证明抗按照本发明鉴定的抗原的抗体的发生，分析了来自健 康个体和肿瘤病人的血清。为此，如上所述加工这些血清，并去除抗 来源于大肠杆菌和噬菌体的抗原的抗体。为了检测特异于抗原的抗 体，将来源于反应性克隆的噬菌体与来源于同样的cDNA文库的不反 应噬菌体以1∶10的比例混合并如上所述测试与人试验血清中的抗 体的反应性。将已经用于抗原鉴定的血清作为阳性克隆，不反应噬菌 体作为阴性对照。如果有预期百分数的噬菌体噬菌斑显示阳性反应， 则血清样品对于抗原反应性抗体是阳性的。在克隆HOM-RCC- 313代表肾细胞癌抗原的情况中，人血清的分析显示只有来自肾细胞 癌患者的血清含有反应性抗体。来自健康对照和有其它肿瘤的病人的 血清不含有这样的抗体。
用限制酶EcoRI消化从质粒DNA切除克隆HOM-RCC-313 的cDNA，并通过琼脂糖凝胶电泳分离，接着从凝胶提取。然后将该 cDNA用于构建表达带有细菌蛋白邻氨基苯甲酸合成酶的融合蛋白 的载体。将正确的开放读码框架中的相关片段克隆进pATH质粒载体 (Koerner等，Meth.Enzymol.194：477(1991)。在如上所述将质粒转化 进菌株BL21的大肠杆菌中(spindler等，J.Virol.49：132(1984))后，得 到蛋白质表达的诱导。将表达的融合蛋白用SDS凝胶电泳分离，从 凝胶上切下，洗脱并冷冻干燥。用溶解于弗氏佐剂的100μg冷冻干 燥物皮下注射免疫接种兔。用不完全弗氏佐剂以2星期的间歇重复免 疫接种3次。从兔子中取血，得到抗血清。以如上所述的方式去除得 到的抗血清中与大肠杆菌和噬菌体反应的抗体，并如对人血清所述测 试其与肾癌抗原的反应性。以1∶＞100，000的稀释度测试反应性。 实施例7
利用从患有(i)恶性黑素瘤，(ii)星型细胞瘤，和(iii)霍奇金病的不 同个体取出的活体解剖组织继续前面实施例中阐述的方案。下面的表 1概括了结果，包括上面实施例1-6陈述的关于肾癌研究得到的那 些结果。
表1 自体血清与来源于人肿瘤cDNA的重组克隆的抗体反应性。用病人自体 血清筛选cDNA文库，将阳性克隆亚克隆形成单克隆。用质粒引物扩增来自每个 克隆的插入物，并通过琼脂糖凝胶电泳分离。通过与相关的插入物杂交进行 Southern 印迹 肿瘤 测试的克隆 阳性克隆 不同的插入物 恶性黑素瘤 1.0×106 40 10 肾细胞癌 1.8×106 7 5 星型细胞癌 1.2×106 49 5 霍奇金病 1.0×106 14 4
对不同插入物的分析显示黑素瘤细胞表达已知的肿瘤排斥抗原 前体MAGE-1(参见van der Bruggen等，科学254：1643-7(1991)， 引入本文作为参考)，以及一个新抗原。SEQ ID NO：2阐述了该抗 原的部分cDNA序列。
当星型细胞瘤研究完成时，观察到的插入物似乎对应于以前描述 的Tegt基因(Old，癌症41：361-375(1981)，引入本文作为参考)。
当霍奇金病研究完成时，用标准方法分离了一个以前未知的抗 原，在文库中鉴定了编码它的cDNA。该抗原是新观察到的，类似凝 集素结构，其cDNA的一部分已经在SEQ ID NO：3中阐述。同时 观察到的是抗Bilbe等，EMBO J 11：2103-13(1992)描述的休眠素的抗 体。这是中间纤丝相关蛋白，已经显示它的表达限于霍奇金病和 Reed-Sternberg细胞以及培养的单细胞。 实施例8
进行抗实施例1-7所述抗原的抗体的发生的进一步研究。表2 概括了这些测定。在这些研究中，将来自阳性克隆的噬菌体与不反应 噬菌体混合(比例：1∶10)，然后用于转染细菌(大肠杆菌)。在如上 所述的酶联免疫吸附测定(ELISA)中利用病人血清的稀释液(1∶200)。 “HOM-MEL-40”指新的黑素瘤抗原(SEQ ID NO：2)，而“HOM -MEL-55”指MAGE-1(van der Bruggen等，如上所述)。“HOM -RCC3.1.3”是SEQ ID NO：1的肾癌抗原。“HOM-GLO- 30.2.1”指以前鉴定的星型细胞瘤相关抗原，“HOM-HD-21” 指SEQ ID NO：3的新的类凝集素抗原，“HOM-HD-397”是 以前鉴定的休眠素抗原。
表2 抗人肿瘤抗原的体液免疫应答，将来自阳性克隆的噬菌体与cDNA文库的不反应的噬菌体以1∶10的比例混合并用于转染细 菌。用利用血清的酶联分析检测克隆的IgG抗体。n.t.＝未测试 抗原 HOM-MEL-40+HOM-MEL.-55 HOM-ROC-3.1.3+ HOM-GLIO-30.2.1 HOM-HD-21+ HOM-HD-397 相同/同源性 MAGE-1 CAH-类似物 tegt 凝集素-类似物 休眠素 黑素瘤病人 2/11 4/11 n.t. n.t. n.t. n.t. 肾癌病人 0/8 0/8 2/14 0/7 0/7 5/7 星形细胞瘤病人 0/10 0/10 0/11 2/13 0/11 7/11 霍奇金病人 0/10 0/10 0/17 0/17 10/18 14/17 健康对照 0/12 0/12 0/15 0/20 0/17 12/17
只在患有同样类型肿瘤的病人的血清中检测到抗除了休眠素以 外的肿瘤抗原的抗体(尽管各有差别)的事实表明肿瘤生长对于发展 抗肿瘤抗原的体液应答是必要的。
在健康对照中存在休眠素的原因不清楚。可以推测可以防止抗有 关的抗原的耐受性的发生，因为抗原可以有与另一个抗原类似的序 列，供体可以有恶化前细胞，或在非恶性状态如病毒感染或其它炎症 过程下在正常细胞中抗原可以被激活。 实施例9
为了测定本文所述的新鉴定抗原的表达方式，利用各种人组织进 行Northern印迹分析。
用熟知的Chomzynski等，如上所述的异硫氰酸胍/酚/氯仿方法， 从组织样品(肿瘤和正常组织)中提取RNA。通过在福尔马林/MOPS 凝胶中的电泳检查RNA的完整性。然后，将每泳道含40μg RNA的 凝胶影印到尼龙膜上。然后用SEQ ID NO：1，2或3的cDNA探 测这些Northern印迹。在42℃，有甲酰胺时，与32p标记的探针杂 交。在65℃，在1×SSC，0.2％SDS中洗涤滤膜，并曝光16小时。 这些是下文定义的“严格条件”。在曝光后，洗涤滤膜，与GAPDH 再杂交。
表3概括了这些结果。
表3 各种组织中肿瘤抗原的表达方式(选择)。用与GAPDH杂交相匹配的来自肿瘤和正常人组织的RNA样品进行Northern印迹分 析。在放射自显影的显象密度分析后计算表达率。患病组织的正常对应物得到的信号定为1。n.t.＝没有测试。 抗原 HOM-MEL-4C+ HOM-RCC-3.1.3+ HOM-GLIO-30.2.1 HOM-HD-21+ 相同/同源性 CAH-类似物 Tegt 凝集素类似物 肾 - 1 1.5 - 脑 - n.t. 1 n.t. 扁桃体 - - 1 1 胃 - - 1.5 - 结肠粘膜 - 0.2 1.5 - 乳腺 - - 1.0 - 肾癌 在4/19情况中＞5 n.t. - -
在15/19情况中≤1 霍奇金病 n.t. - n.t. ＞10 星型细胞瘤 n.t. n.t. 在8/12中＞5 -
在4/12中为1 黑素瘤 ++ - n.t. -
正如将看到的，与新黑素瘤相关的抗原在黑素瘤而不是其它组织 中强烈表达。类似碳酸酐酶的抗原在约20％的肾细胞癌中强烈表 达，在正常肾组织中仅微弱表达。与正常脑组织相比Tegt在8/12的 星型细胞瘤组织中过量表达。与正常扁桃体相比，在患病扁桃体中与 霍奇金病相关的类似凝集素分子的mRNA增加约10倍，表明过量表 达可能是引发自体B细胞应答的蛋白质的常见特征。 实施例10
对HOM-MEL-40序列进行了进一步的研究。利用标准的遗 传分析技术，证明HOM-MEL-40的mRNA的5’区含有酪氨 酸激酶的结合区。这表明HOM-MEL-40可以作为受体。该RNA 的3’部分与“SSX”(一个已知参与滑膜肿瘤的SYT-SSX易位 的分子)的RNA分子相同。 实施例11
同时进行了其它实验研究HOM-MEL-40。标准的Northern 印迹显示，除了睾丸，HOM-MEL-40在正常组织中不表达。相 反，它在50％的黑素瘤，20％的前列腺癌，20％的胃癌，26％的 结肠直肠癌，12％的肺癌和20％的乳腺癌和肝细胞癌中表达。它也 在1/10的胃癌，和1/5的甲状腺癌中发现。
进行的其它Western印迹工作显示抗HOM-MEL-40的抗体 存在于测试的89个黑素瘤病人中的10个中，而在49个健康男性个 体中只有3个存在该抗体。
在另一个研究中，观察到HLA-A2阳性肿瘤细胞提呈来源于 HOM-MEL的九聚物。这表明HOM-MEL-40特异疫苗用于诱 导CTL是可能的。 实施例12
在前面的实施例中描述的噬菌体测试不适于筛选大量的血清样 品。为了大量筛选，开发了修改的标准Western印迹分析。这一变化 是根据本文描述的组氨酸标记的重组HOM-MEL-40。
利用pfu聚合酶，在从黑素瘤组织制备的质粒cDNA上将HOM -MEL-40扩增20个循环以上。所用的寡核苷酸引物是： 5’-GCCAAATACTTCTCTAAGGAAGAGTGG-3’(SEQ ID NO：4)；(有义) 5’-TTCACTGTTGTGAACACTTGCTTTCAC-3’(SEQ ID NO：5)；(反义) 在95℃/1分钟；60℃/1分钟；和72℃/1分钟，接着最后延伸72 ℃10分钟进行聚合酶链式反应(PCR)。利用已知技术凝胶纯化扩增产 物，然后将其在读框中连接到SmaI消化的去磷酸化的并凝胶纯化的 pQE32载体。这导致产生在N-末端具有6个组氨酸分子的“尾巴” 的融合蛋白质。
然后将该构建体转化进大肠杆菌SG13009(pREP4)菌株中，接着 在含有卡那霉素和氨苄青霉素的平板上选择。挑出单个菌落，用2mM 异丙基硫半乳糖苷(IPTG)诱导它们小规模地表达，这使得能检查蛋白 质的表达。然后对每种克隆在Ni-NTA柱上进行小规模纯化。
鉴定了一个表达预期长度的蛋白质的克隆。利用已知技术分离该 克隆，进行序列分析，证明是HOM-MEL-40。在鉴定后，进行 重组蛋白质的大规模诱导。具体地说，用2mM IPTG诱导细胞，在5 小时后收获，与含8M脲，100mM Na2PO4，10mM Tris-HCl(pH8)， 0.01％Triton X的缓冲液混合过夜裂解细胞。离心所有细胞碎片，将 上清液加到预平衡的Ni-NTA树脂上，用2倍体积的前面提到的pH8 的缓冲液，然后用至少10倍体积的pH6.3的缓冲液进行洗涤，然后 用本文描述的缓冲液，加250mM咪唑洗脱蛋白质。每升细菌培养物 的组氨酸标记蛋白质的产量范围为15-40mg。
然后利用组氨酸标记蛋白质进行Western印迹。在这些测试中， 将5μg作为内部阴性对照的重组组氨酸标记的蛋白质与2×SDS样 品缓冲液(0.1M Tris-HCl，pH6.8，0.2M二硫苏糖醇，4％SDS，0.2％ 溴酚蓝，20％甘油)混合，然后在12％SDS-PAGE中电泳，接着 利用半干转移影印到尼龙膜上。
在用5％溶解于PBS的低脂肪牛奶封闭任何非特异结合(1小时) 后，用来自肿瘤病人或健康对照的1∶100稀释的血清温育膜。然后 用碱性磷酸酶缀合的鼠抗人IgG温育印迹1小时。然后连续地用兔抗 鼠IgG(30分钟)，抗碱性磷酸酶，然后0.25mg/毫升碱性磷酸酶温育 膜。在每个温育步骤之后，用TBS和0.1％吐温充分洗涤膜。用5- 溴-4-氯-3-吲哚-磷酸(BCIP)，和氮蓝四唑染色进行观察。在观 察者对样品状态未知时，以任意顺序(健康/黑素瘤阳性)分析血清。所 有分析重复进行。
印迹分析在SDS-PAGE上显示了分子量约为24kD的产物，与 根据推测的氨基酸序列计算的分子量21.6kD一致。
对89个黑素瘤样品，6个卵巢癌样品，和10个肾癌样品进行了 如上所述的免疫印迹试验。其中11个黑素瘤样品，1个卵巢癌样品， 和3个肾细胞癌样品是阳性。来自患有结肠直肠癌，肺癌，乳腺癌， 胃癌，或胰腺癌的个体的血清是阴性。同时分析了总共41个健康对 照，其中3个是阳性。然后如上所述利用噬菌体测试对在Western印 迹中反应的所有血清以及20个阴性血清样品重新评价。在11个黑素 瘤病人中的10个和阳性卵巢癌病人中证实了反应性。肾细胞癌病人 和健康对照是阴性，并且在Western印迹中是所有阴性的样品。
有16个黑素瘤病人提供了血清和肿瘤样品。发现肿瘤表达HOM -MEL-40可以和样品中的抗体反应性相比。正如将在下面的表中 所见，16个病人中8个有HOM-MEL-40阳性肿瘤，但在它们 的血清中只有3个有抗抗原的抗体。在HOM-MEL-40阴性肿瘤 病人的血清中没有检测到抗体。 实施例13
引入本文作为参考的Rammensee等，免疫遗传学41：178- 228(1995)公开了许多与HLA-2.1结合的肽，其中一些也引起CTL 增殖。这些肽中的一些的通式为：XaaLeu(Xaa)6(Ile，Leu，Val)(SEQ ID NO：6)。筛选HOM-MEL-40的推导的氨基酸序列中可以作为HLA -A2.1结合物/CTL刺激物的序列，发现了下列序列：
Arg Leu Gln Gly Ile Ser Pro Lys Ile (SEQ ID NO：7)；
Arg Leu Arg Glu Arg Lys Gln Leu Val (SEQ ID NO：8)；
Lys Ile Gln Lys Ala Phe Asp Asp Ile (SEQ ID NO：9) 利用熟知的技术和Fmoc保护的氨基酸合成这些肽。利用葡聚糖凝胶 G25，接着在C-18柱上的反相HPLC纯化肽。将缺乏与抗原提呈 相关的转运蛋白的T2细胞(DeMars等，美国科学院院刊82：8183- 8187(1985)；Slater等，免疫遗传学21：235-241(1990))如下用于 肽结合测试。在存在或没有100μM HOM-MEL-40肽时，将5 ×105个T2细胞的样品在37℃温育4小时。阳性对照是来源于EBV LMP2的肽： Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val(SEQ ID NO：10) 和起源于HIV逆转录酶的肽： Ile Leu Lys Glu Pro Val Gly Val (SEQ ID NO：11)。 用抗-HLA-A2.1特异性单克隆抗体(即，BB7.2)标记，接着用FITC 缀合山羊抗鼠抗体温育测量HLA2.1对T2细胞的正调节。用流式细 胞计数分析样品，由比例： 得到HLA-A2.1的正调节。可以看到三个肽中的每个均与HLA- A2.1结合，如FACS分析测定，其中SEQ ID NO：8显示最强的HLA -A2.1正调节。
正如前面显示，本发明涉及测定或分离免疫反应物质的方法。如 本文所用“免疫反应物质”指任何在产生它的个体中引起一些形式的 免疫应答的物质，该应答可以是B细胞或T细胞应答。这样的免疫 反应物质包括蛋白质，肽，糖蛋白，脂蛋白，含肽复合物(例如，MHC/ 肽复合物)，抗体等。为了测定这些物质，利用熟知的标准方法从个 体的细胞中制备cDNA文库。然后将该cDNA插入适当的载体，如 真核细胞特异性病毒或噬菌体(即，细菌病毒)，形成转染/转化文库， 然后将该文库掺入宿主细胞。处理宿主细胞以便它们表达它们所接受 的文库成份(克隆的cDNA)，然后裂解宿主细胞，以便得到表达物质 作进一步的处理。
然后将裂解物质与确信含有免疫反应物质的免疫原结合配体的 “去杂”样品接触。本文所用的“免疫原结合配体”是指任何与免疫 系统相关的物质，该物质与靶即免疫反应物质结合。这样的结合配体 包括，但不限于，抗体，T细胞，细胞因子，配体，受体等，以及这 些分子截短的部分，互补核酸分子等。注意对于这些成分中的一些， 如T细胞，需要包括本文阐述的步骤在内的进一步步骤。
如上所指，去杂样品已经与(i)未转染或未转化宿主细胞，和(ii) 用不含有适当cDNA的载体转染或转化的宿主细胞接触处理。
去杂样品可用于鉴定表达物质的结合配体，因为通过本文所述的 吸收步骤已经除去了否则将干扰预期的特异免疫反应的许多免疫成 分。
在表达物质的鉴定后可以接着分离编码它的cDNA。可以在置于 含有宿主细胞的菌落的培养皿上的膜如硝酸纤维膜上刺孔，然后利用 免疫反应，在固相上显示位置。每个菌落是基于有限的cDNA转染， 从而简化了相关的cDNA的分离和鉴定。
本发明也涉及编码与特定状态相关的分子的SEQ ID NO：1，2 或3所示的分离的核酸分子。除了它们作为编码物质的作用，这些分 子也可以用作鉴定表达相关抗原的细胞的探针，因为已经显示这些 cDNA分子(SEQ ID NO：1，2和3)是基于转译成抗原的mRNA。
本发明还包括分离的核酸分子，其互补序列与SEQ ID NO：1， 2或3中的一个杂交，其编码与SEQ ID NO：1，2或3编码的蛋白 质等价的蛋白质。本文所用的“严格条件”指至少如在50μl/cm23.5 ×SSC，1×Denhardt溶液，25mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)，利用32P -标记探针，在65℃杂交18小时，接着洗涤4次(每次洗涤1小时， 65℃，2×SSC，0.1％SDS)，和最后在1.0×SSC，0.2％SDS中 洗涤30分钟。如果需要，最后的洗涤可以变化到0.5×SSC到0.2 ×SSC，或甚至0.1×SSC，并且SDS可以降低到0.1％以增强严格 性。
本发明还包括那些与肿瘤抗原相关的肽，如与HLA-A2.1分子 结合从而引起胞溶性T细胞导致的溶解的SEQ ID NO：7，8和9 所示的那些肽。本发明还包括通式为Xaa Leu Xaa7，(SEQ ID NO：12) 的肽，其中第六个氨基酸残基是Ser，Lys或Phe，第九个氨基酸残基 是Val或Ile。这些分子也可以非常简单地作为HLA-A2.1细胞的 标记，因为众所周知，肽/MCH复合物的形成是非常特异的。
本发明的其它特征对于技术熟练人员将是明了的，不需要在这里 重复说明。
已经使用的术语和表达法被用作说明性的术语并不受限制，使用 这些术语和表达法不排除所示和所述的特征的等价物及其部分，应该 认识到在本发明的范围内各种修改是可能的。 序列表
(1)一般资料
(i)申请人：米夏埃尔·普夫罗因德舒；汉斯-格奥尔格·拉门赛
(ii)发明名称：鉴定或分离分子的方法和由此鉴定的分子
(iii)序列数目：13
(iv)通信地址：
(A)收信人：Felfe和Lynch
(B)街道：805第三大道
(C)城市：纽约市
(D)州：纽约
(E)邮政编码：10022
(v)计算机可读形式：
(A)介质类型：磁盘，3.5英寸，360kb存储量
(B)计算机：IBM
(C)操作系统：PC-DOS
(D)软件：Wordperfect
(vi)当前申请数据：
(A)申请号：08/644,116
(B)申请日：1996年5月10日
(C)分类：435
(vi)在先申请数据：
(A)申请号：08/580,980
(B)申请日：1996年1月3日
(vii)在先申请数据：
(A)申请号：08/479,328
(B)申请日：1995年6月7日
(viii)律师/代理人资料：
(A)姓名：Hanson，Norman D.
(B)登记号：30，946
(C)档案号：LUD 5410.2
(ix)电讯资料：
(A)电话：(212)688-9200
(B)电传：(212)838-3884
(2)SEQ ID NO：1的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：2679个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链性：双链
(D)拓扑结构：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1 CGCGAAGATG CCCCGGCGCA GCCTGCACGC GGCGGCCGTG CTCCTGCTGG 50 TGATCTTAAA GGAACAGCCT TCCAGCCCGG CCCCAGTGAA CGGTTCCAAG 100 TGGACTTATT TTGGTCCTGA TGGGGAGAAT AGCTGGTCCA AGAAGTACCC 150 GTCGTGTGGG GGCCTGCTGC AGTCCCCCAT AGACCTGCAC AGTGACATCC 200 TCCAGTATGA CGCCAGCCTC ACGCCCCTCG AGTTCCAAGG CTACAATCTG 250 TCTGCCAACA AGCAGTTTCT CCTGACCAAC AATGGCCATT CAGTGAAGCT 300 GAACCTGCCC TCGGACATGC ACATCCAGGG CCTCCAGTCT CGCTACAGTG 350 CCACGCAGCT GCACCTGCAC TGGGGGAACC CGAATGACCC GCACGGCTCT 400 GAGCATACCG TCAGCGGACA GCACTTCTCC GCCGAGCTGC ACATTGTCCA 450 TTATAACTCA GACCTTTATC CTGACGACAG NACTGCCAGC AACAAGTCAG 500 AAGACCTCGC TGTCCTGGGT GCTCTCATTG AGATGGGCTC CTTCAATCCG 550 TCCTATGACA AGATCTTCAG TCACCTTCAA CATGTAAAGT ACAAAGGCCA 600 GGAAGCATTC GTCCCGGGAT TCAACATTGA AGAGCTGCTT CCGGAGAGGA 650 CCGCTGAATA TTACCGCTAC CGGGGGTCCC TGATCACACC CCCTTGCAAC 700 CCCACTGTGC TCTGGACAGT TTTCCGAAAC CCCGTGCAAA TTTCCCAGGA 750 GCAGCTGCTG GCTTTGGAGA CAGCCCTGTA CTGCACACAC ATGGACGACC 800 CTTCCCCCAG AGAAATGATC AACAACTTCC GGCAGGTCCA GAAGTTCGAT 850 GAGAGGCTGG TATACACCTC CTTCTCCCAA GTGCAAGTCT GTACTGCGGC 900 AGGACTGAGT CTGGGCATCA TCCTCTCACT GGCCCTGGCT GGCATTCTTG 950 GCATCTGTAT TGTGGTGGTG GTGTCCATTT GGCTTTTCAG AAGGAAGAGT 1000 ATCAAAAAAG GTGATAACAA GGGAGTCATT TACAAGCCAG CCACCAAGAT 1050 GGAGACTGAG GCCCACGCTT GAGGTCCCCG GAGCTCCCGG GCACATCCAG 1100 GAAGGACCTT GCTTTGGACC CTACACACTT CGGCTCTCTG GACACTTGCG 1150 ACACCTCAAG GTGTTCTCTG TAGCTCAATC TGCAAACATG CCAGGCCTCA 1200 GGGATCCTCT GCTGGGTGCC TCCTTGTCTT GGGACCATGG NCACCCCAGA 1250 GCCATCCGAT CGATGGATGG GATGCACTCT CAGACCAAGC AGCAGGAATT 1300 CAAAGCTGCT TGCTGTAATT GTGTGAGATT GTGAAGTGGT CTGAATTCTG 1350 GAATCACAAA CCAACCATGC TGGTGGGCCA TTAATGGTTG GAAAACACTT 1400 CCATCCGGGG CTTTGCCAGA GCGTGCTTTC AAGTGTCCTG GAAATTCTGC 1450 TGCTTCTCCA AGCTTTCAGA CAAGAATGTG CACTCTCTGC TTAGGTTTTG 1500 CTTGGGAAAC TCAACTTCTT TCCTCTGGAG ACGGGACATC TCCCTCTGAT 1550 TTCCTTCTGC TATGCAAAAC CTTTAATCTG CACCTTACAN ACTCGGGGAC 1600 AAATGGGGAC AGGAAGGATC AAGTTGTAGA GNAGAAAAAG AAAACAAGAG 1650 ATATACATTG TGATATATAT TAGGGACACT TTCACAGTCC TGTCCTCTGG 1700 ATCACAGACA CTGCACAGAC CTTAGGGAAA TGGCAGGTTC AAAGTTCCAC 1750 TTCTTGGTGG GGATGAGAAG GGAGAGAGAG CTAGAGGGAC AAAGAGAATG 1800 AGAAGACATG GATGATCTGG GAGAGTCTCA CTTCGGAATC AGAATTGGAA 1850 TCACATTCTG TTTATCAAGC CATAATGTAA GGACAGAATA ATACAATAAT 1900 AAGTCCAAAT CCAACCTCCT GTCAGTGGAA CAGTTATGTT TTATACTCTA 1950 CAGATTTTAC AAATANATGA GGCTNGTTCC TTGAAAANTG TGTTGNNTTG 2000 CTGTNGTCCN NTGGAGGAGA CATGAGTTCC GAGATGACCA ACTCNNGCNT 2050 TGNATNCTNG GAGGNAATAN GGCAGAACCA AAATGACTGT AGAACTTATT 2100 CTCTGTAGGC CAAATTTCAT TTCAGCCACT TCTGCAGGAT CCTACTGCCA 2150 ACCTGGAATG GAGACTTTTA TCTACTTCTC TCTCTCTGAA GATGTCAAAT 2200 CGTGGTTTAG ATCAAATATA TTTCAAGCTA TAAAAGCAGG AGGTTATCTG 2250 TGCAGGGGGC TGGCATCATG TATTTAGGGG CAAGTAATAA TGGAATGCTA 2300 CTAAGATACT CCATATTCTT CCCCGAATCA CACAGACAGT TTCTGACAGG 2350 CGCAACTCCT CCATTTTCCT CCCGCAGGTG AGAACCCTGT GGAGATGAGT 2400 CAGTGCCATG ACTGAGAAGG AACCGACCCC TAGTTGAGAG CACCTTGCAG 2450 TTCCCCGAGA ACTTTCTGAT TGCACAGTCT CATTTTGACA GCATGAAATG 2500 TCCTCTTGAA GCATAGCTTT TTAAATATCT TTTTCCTTCT ACTCCTCCCT 2550 CTGACTCTAG GAATTCTCTC TTCTGGAATC GCTTGAACCC AGGAGGCGGA 2600 GGTTGCAGTA AGCCAAGGTC ATGCCACTGC ACTCTAGCCT GGGTGACAGA 2650 GCGAGACTCC ATCTCAAAAA AAAAAAAAA 2679
(2)SEQ ID NO：2的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：931个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链性：双链
(D)拓扑结构：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2 ACTTTCTCTC TCTTTCGATT CTTCCATACT CAGAGTACGC ACGGTCTGAT 50 TTTCTCTTTG GATTCTTCCA AAATCAGAGT CAGACTGCTC CCGGTGCCAT 100 GAACGGAGAC GACGCCTTTG CAAGGAGACC CACGGTTGGT GCTCAAATAC 150 CAGAGAAGAT CCAAAAGGCC TTCGATGATA TTGCCAAATA CTTCTCTAAG 200 GAAGAGTGGG AAAAGATGAA AGCCTCGGAG AAAATCTTCT ATGTGTATAT 250 GAAGAGAAAG TATGAGGCTA TGACTAAACT AGGTTTCAAG GCCACCCTCC 300 CACCTTTCAT GTGTAATAAA CGGGCCGAAG ACTTCCAGGG GAATGATTTG 350 GATAATGACC CTAACCGTGG GAATCAGGTT GAACGTCCTC AGATGACTTT 400 CGGCAGGCTC CAGGGAATCT CCCCGAAGAT CATGCCCAAG AAGCCAGCAG 450 AGGAAGGAAA TGATTCGGAG GAAGTGCCAG AAGCATCTGG CCCACAAAAT 500 GATGGGAAAG AGCTGTGCCC CCCGGGAAAA CCAACTACCT CTGAGAAGAT 550 TCACGAGAGA TCTGGACCCA AAAGGGGGGA ACATGCCTGG ACCCACAGAC 600 TGCGTGAGAG AAAACAGCTG GTGATTTATG AAGAGATCAG CGACCCTGAG 650 GAAGATGACG AGTAACTCCC CTCAGGGATA CGACACATGC CCATGATGAG 700 AAGCAGAACG TGGTGACCTT TCACGAACAT GGGCATGGCT GCGGACCCCT 750 CGTCATCAGG TGCATAGCAA GTGAAAGCAA GTGTTCACAA CAGTGAAAAG 800 TTGAGCGTCA TTTTTCTTAG TGTGCCAAGA GTTCGATGTT AGCGTTTACG 850 TTGTATTTTC TTACACTGTG TCATTCTGTT AGATACTAAC ATTTCATTGA 900 TGACGAAGAC ATACTTAATC GATATTTGGT T 931
(2)SEQ ID NO：3的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：1692个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链性：双链
(D)拓扑结构：线性 (xi)序列描述：SEQ ID NO：3 GATCCCCCGG GCTGCAGGAA TTCGGCACGA GCAAAGGACT TCCTAGTGGG 50 TGTGAAAGGC AGCGGTGGCC ACAGAGGCGG CGGAGAGATG GCCTTCAGCG 100 GTTCCCAGGC TCCCTACCTG AGTCCAGCTG TCCCCTTTTC TGGGACTATT 150 CAAGGAGGTC TCCAGGACGG ACTTCAGATC ACTGTCAATG GGACCGTTCT 200 CAGCTCCAGT GGAACCAGGT TTGCTGTGAA CTTTCAGACT GGCTTCAGTG 250 GAAATGACAT TGCCTTCCAC TTCAACCCTC GGTTTGAAGA TGGAGGGTAC 300 TTGGTGTCCA ACACGAGGCA GAACGGAAGC TGGGGGCCCG AGGAGAGGAA 350 GACACACATG CCTTNCCAGA AGGGGATGCC CTTTGACCTC TGCTTCCTGG 400 TGCAGAGCTC AGATTTCAAG GTGATGGTGA ACGGGATCCT CTTCGTGCAG 450 TACTTCACAT CTCGTCATGC CCTGTCCACC GTTGTGGACA CCATCTCCGT 500 CAATGGCTCT GTGCAGCTGT CCTACATCAG CTTCCAGCCT CCCGGCGTGT 550 GGCCTGCCAA CCCGGCTCCC ATTACCCAGA CAGNNNTCAT CCACACAGTN 600 GCAGAGCGCC CNCTGGACAG ATGTCTCTAC TCCCGCCATC CCACCTATGA 650 TGTACCCCCA CCCCGCCTAT CCGATGCCTT TCATCACCAC CATTCTGGGA 700 GGGCTGTACC CATCCAAGTC CATCCTCCTG TCAGGCACTG TNCTGCCCAG 750 TGCTCANGAG GTTCCACATC NAACCTGTGC NCTGGGAACC ACATCGCCTT 800 CCACCTGAAC CCCCGTTTTG ATGAGAATGC TGTGGTCCGC AACACCCAGA 850 TCGACAACTC CTGGGGGTCT CAGGAGCGAA GTCTGCCCCG AAAAATGCCC 900 TTCGTCCGTG GCCAGAGCTT CTCAGTGTGG ATCTTGTGTG AAGCTCACTG 950 CCTCAAGGTG GCCGTGGATG GTCAGCACCT GTTTGAATAC AACCATCGCC 1000 TGAGGAACCT GCCCACCATC AACAGACTGG AAGTGGGGGG CGACATCCAG 1050 CTGACCATGT GCAGACATAG GCGGCTTCCT GGCCCTGGGG CCGGGGGCTG 1100 GGGTGTGGGG CAGTCTGGGT CCTCTCATCA TCCCCACTTC CCAGGCCCAG 1150 CCTTTCCAAC CCTGCCTGGG ATCTGGGCTT TAATGCAGAG GCCATGTCCT 1200 TGTCTGGTCC TGCTTCTGGC TACAGCCACC CTGGAACGGA GAAGGCAGCT 1250 GACGGGGATT GCCTCCTCAG CCGCAGCAGC ACCTGGGGCT CCAGCTGCTG 1300 GAATCCTACC ATCCCAGGAY GCAGGCACAG CCAGGGAGAG GGGAGGNGTG 1350 GGCAGTGAAG ATGAAGCCCC ATGCTCAGTC CCCTCCCATC CCCCACGCAG 1400 CTCCACCCCA GTCCCAAGCC ACCAGCTGTC TGCTCCTGGT GGGAGGTGGC 1450 CTCCTCAGCN CCTCCTCTCT GACCTTTAAC CTNACTCTCA CCTTGCACCG 1500 TGCACCAACC CTTCACCCCT CCTGGAAAGC AGGCCTGATG GCTTCCCACT 1550 GGCCTCCACC ACCTGACCAG AGTGTTCTCT TCAGAGGACT GGCTCCTTTC 1600 CCAGTGTCCT TAAAATAAAG AAATGAAAAT NCTTGTTGGC AAAAAAAAAA 1650 AAAAAAAAAC TCGAGGGGCN NCCCNGTACC CAATTCGCCC TA 1692
(2)SEQ ID NO：4的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：1240个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链性：双链
(D)拓扑结构：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4 ATCTGCAGAA TTCGGCTTCG ATCTAGAACT AGTGGATCCC CCGGGCTGCA 50 GGAATTCGGC ACGAGCGGTT CCAAGTGGAC TTATTTTGGT CCTGATGGGG 100 AGAATAGCTG GTCCAAGAAG TACCCGTCGT GTGGGGGCCT GCTGCAGTCC 150 CCCATAGACC TGCACAGTGA CATCCTCCAG TATGACGCCA GCCTCACGCC 200 CCTCGAGTTC CAAGGCTACA ATCTGTCTGC CAACAAGCAG TTTCTCCTGA 250 CCAACAATGG CCATTCAGTG AAGCTGAACC TGCCCTCGGA CATGCACATC 300 CAGGGCCTCC AGTCTCGCTA CAGTGCCACG CAGCTGCACC TGCACTGGGG 350 GACCCGAAT GACCCGCACG GCTCTGAGCA TACCGTCAGC GGACAGCACT 400 TCTCCGCCGA GCTGCACATT GTCCATTATA ACTCAGACCT TTATCCTGAC 450 GACAGNACTG CCAGCAACAA GTCAGAAGAC CTCGCTGTCC TGGGTGCTCT 500 CATTGAGATG GGCTCCTTCA ATCCGTCCTA TGACAAGATC TTCAGTCACC 550 TTCAACATGT AAAGTACAAA GGCCAGGAAG CATTCGTCCC GGGATTCAAC 600 ATTGAAGAGC TGCTTCCGGA GAGGACCGCT GAATATTACC GCTACCGGGG 650 GTCCCTGATC ACACCCCCTT GCAACCCCAC TGTGCTCTGG ACAGTTTTCC 700 GAAACCCCGT GCAAATTTCC CAGGAGCAGC TGCTGGCTTT GGAGACAGCC 750 CTGTACTGCA CACACATGGA CGACCCTTCC CCCAGAGAAA TGATCAACAA 800 CTNCCGGCAG GTCCAGAAGT TCGNTGAGAG GCTGGTATAC ACCTCCTTCT 850 CNCAAGTGCA AGTCTGTACT GCGGCAGGAC TGAGTCTGGG CATCATCCTC 900 TCACTGGCCC TGGCTGGCAT TCTTGGCATC TGTATTGTGG TGGTGGTGTC 1000 CATTTGGCTT TTCAGAAGGA AGAGTANCCC CNAAAGGTGA TAACAAGGGA 1050 GTCATTTACA AGCCANCCAC CAAGATGGAG ACTGAGGCCC ACGCTTGAGG 1100 TCCCCGGAGC TCCCGGGCAC ATCCAGGAAG GACCTTGCTT TTGGACCCTA 1150 CACACTTCGG CTCTCTGGAC ACTTGCGACA CCTCAAGGTG TTCTCTGTAG 1200 CTCAATCTGC AAACATGCCA GGCCTCAGGG ATCCTCTGCT 1240 (2) SEQ ID NO：5的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：27个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(xi)序列描述：SEQ IDNO：5 GCCAAATACT TCTCTAAGGA AGAGTGG 27
(2)SEQ ID NO：6的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：27个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6 TTCACTGTTG TGAACACTTG CTTTCAC 27 (2)SEQ ID NO：7的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：9个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(xi)序列描述：SEQ IDNO：7 Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
5
(2)SEQ ID NO：8的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：9个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8 Arg Leu Gln Gly Ile Ser Pro Lys Ile
5
(2)SEQ ID NO：9的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：9个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9 Arg Leu Arg Glu Arg Lys Gln Leu Val
5
(2)SEQ ID NO：10的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：9个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10 Lys Ile Gln Lys Ala Phe Asp Asp Ile
5
(2)SEQ ID NO：11的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：9个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：11 Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val
5
(2)SEQ ID NO：12的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：8个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：12 Ile Leu Lys Glu Pro Val Gly Val
5
(2)SEQ ID NO：13的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：9个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ix)特征：第六个氨基酸是Ser，Lys或Phe，第九个氨基酸是 Val或Ile
(xi)序列描述：SEQ ID NO：13 Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
5