技术领域
本发明涉及一种生物制剂及其生产工艺，具体地说，涉及一种采用黄芪多糖制备的抗新城疫病毒的生物制剂及其生产工艺，属于生物发酵技术领域。
背景技术
新城疫是由新城疫病毒感染所得。不同品种和各种年龄的家禽都可感染，发病率高，死亡率可达90%以上，是严重危害养禽业主要病原之一。目前国内外应用于禽类病毒病的化学药物主要是金刚烷胺和利巴韦林制剂，临床疗效不确切，而且存在如残留、影响蛋禽产蛋率恢复等毒副作用。业界近年来一直关注生物制品对禽类抗病毒作用的研究；黄芪多糖是目前研究较多的抗病毒成分。
黄芪多糖是从黄芪中提取的有效活性成分之一，具有免疫调节、抗肿瘤、抗菌、抗衰老、抗氧化等多方面的药理活性。值得注意的是，黄芪多糖的抗病毒作用已被越来越多的研究证实；研究发现，黄芪多糖通过诱导动物体产生干扰素，使细胞产生抗病毒蛋白而抑制病毒的繁殖，可用于新城疫病毒性传染病的治疗，但疗效却不稳定。
目前研究表明：黄芪多糖硫酸化或磷酸化分子修饰后，能提高抵抗新城疫病毒感染的能力。硫酸化修饰常用三种方法：浓硫酸法、氯磺酸-吡啶法和三氧化硫二甲基甲酰胺法。磷酸化修饰常用三聚磷酸钠一三偏磷酸钠法。以上方法是先将一定量的多糖，与硫酸化试剂和磷酸化试剂混合，再按照一定的条件进行反应，然后加入终止试剂进行终止反应，最后通过透析、浓缩、醇沉、冷冻干燥后获得产物；但这种修饰物的改善作用并不显著。
现有技术存在以下缺陷：黄芪多糖以及黄芪多糖的修饰物抵抗新城疫病毒的效果均不理想。
发明内容
本发明针对以上不足，本发明提供一种采用黄芪多糖制备的抗新城疫病毒的生物制剂及其生产工艺，实现以下发明目的：
1、采用本发明工艺，通过发酵提高黄芪多糖制剂的抗病毒活性；
2、提高本发明生物制剂抗病毒活性的稳定性。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：
一种采用黄芪多糖制备的抗新城疫病毒的生物制剂，所述的生物制剂抗病毒活性达2.89×105～1.05×106 IU/ml。
以下是对上述技术方案的进一步改进：
一种采用黄芪多糖制备的抗新城疫病毒的生物制剂的生产工艺：
包括菌株活化、种子液的培养、发酵液的培养、制得生物制剂步骤。
所述的发酵液的培养步骤，采用的发酵培养基的组分包括黄芪多糖。
所述的发酵液的培养步骤，采用的发酵培养基包括以下组分：以去离子水为介质，黄芪多糖2～8g/L、麦芽糖1～3 g/L、蚕蛹粉5～15g/L和无水氯化钙1～3g/L。
所述的发酵液的培养步骤，采用的发酵培养基包括以下组分：以去离子水为介质，黄芪多糖5 g/L，麦芽糖3 g/L，蚕蛹粉10 g/L，无水氯化钙1 g/L。
所述的发酵液的培养步骤，发酵温度为28～34℃，发酵液PH为6～7.5，发酵转速为120～240 r/min，发酵时间为16～28 h。
所述的菌株活化：采用的菌种为地衣芽孢杆菌。
所述的种子液的培养：培养温度为35～38℃，培养时间为16～20h，振荡转速为200～220rpm。
所述的制得生物制剂步骤：发酵液在10000～12000r/min条件下离心分离8～10min，得到的上清液经0.22μm滤器过滤，制得生物制剂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明制备的生物制剂，抗病毒活性较黄芪多糖提高了948～3541倍，抗病毒活性达2.89×105～1.05×106 IU/ml；
2、本发明制备的生物制剂，抗病毒活性稳定性高，存放12个月后产品抗病毒活性依然没有减弱；
3、本发明制备的生物制剂，对预防鸡新城疫病毒性疾病的有效保护率达到100%；
4、本发明制备的生物制剂，对治疗鸡初期新城疫的有效率为95%；
5、本发明工艺操作简单，环保无毒；
6、本发明工艺采用的原材料成本低廉，而且全发酵过程条件可控，不受外部环境条件限制，适合工业化生产及推广应用。
具体实施方式
本发明所述的地衣芽孢杆菌菌种，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号CICC21886。
本发明所述的黄芪多糖，购自四川恒瑞通达公司。
实施例1 一种采用黄芪多糖制备抗新城疫病毒的生物制剂的工艺
步骤1、菌株活化
取1支地衣芽孢杆菌冻干粉加入1ml LB液体培养基中，摇匀后，取菌液进行LB培养基平板划线，活化培养，置于37℃温箱中培养24h；
所述LB液体培养基的组分如下：以去离子水为介质，胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L和氯化钠10 g/L；
所述LB固体培养基的组分如下：以去离子水为介质，胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化钠10 g/L和琼脂18 g/L。
步骤2、种子液的培养
将活化后的地衣芽孢杆菌，使用无菌的接种环挑取单菌落，接入装有50ml种子培养基的三角瓶中，
所述三角瓶的规格为250ml中；即装液量为三角瓶容量的1/5；
所述种子培养基组成如下：以去离子水为介质，胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L和氯化钠10 g/L；
将三角瓶放入培养箱中，37℃恒温振荡培养18h，转速为200rpm，得到种子液。
步骤3、发酵液的培养
（1）制备发酵培养基
所述发酵培养基的组成如下：以去离子水为介质，黄芪多糖3 g/L、葡萄糖2 g/L、蛋白胨10 g/L、磷酸氢二钾1 g/L和氯化钠1 g/L。
（2）发酵
调节发酵液pH为7；
将步骤2得到的种子液接种于装有发酵培养基的三角瓶中，种子液接种比为1：10；三角瓶装液量为70ml；
所述三角瓶的规格为250ml；
在发酵温度30℃、发酵转速200rpm条件下培养24h，得到发酵液。
步骤4、制得生物制剂
将制得的发酵液，10000 r/min条件下离心分离10min，得到菌体和上清液。上清液经0.22μm滤器过滤后，得到生物制剂。
对照组1 未经发酵的黄芪多糖溶液；
对照组2生物制剂的制备方法与实施例1相同，只改变发酵液的培养步骤中的发酵培养基为：
以去离子水为介质，葡萄糖5 g/L、蛋白胨10 g/L、磷酸氢二钾1 g/L和氯化钠1 g/L。
经试验，制备的生物制剂的抗病毒活性检测结果见表1；
表1 生物制剂的抗病毒活性
由表1可知，采用本实施例工艺制备生物制剂的抗病毒活性为2.89×105IU/ml，生物制剂的抗病毒活性较黄芪多糖提高948倍。
本发明采用细胞病变抑制法的CEF/VSV系统检测生物制剂的抗病毒活性，进而计算出样品的效价，参照《中华人民共和国药典》2005年版。
实施例2 发酵培养基采用的碳源种类单因素分析实验
采用实施例1的工艺制备生物制剂，只改变发酵液的培养步骤中：发酵培养基采用的碳源种类，进行实施例2-5；
实施例1采用的发酵培养基碳源为3g/L黄芪多糖+2 g/L葡萄糖；
实施例2-5采用的发酵培养基碳源见表2；
表2 实施例2-5采用的发酵培养基碳源
经检测，实施例2-5制备的生物制剂的抗病毒活性见表3；
表3 实施例2-5制备的生物制剂的抗病毒活性
由表2、3可知，发酵培养基的碳源种类优选为黄芪多糖和麦芽糖。
实施例6发酵培养基采用的氮源种类单因素分析实验
采用实施例1的工艺制备生物制剂，只改变发酵液的培养步骤中：发酵培养基采用的氮源种类，进行实施例6-9；
实施例1采用的发酵培养基氮源为蛋白胨；
实施例6-9采用的发酵培养基氮源见表4；
表4 实施例6-9采用的发酵培养基氮源
经检测，实施例6-9制备的生物制剂的抗病毒活性见表5；
表5 实施例6-9制备的生物制剂的抗病毒活性
由表4、5可知，发酵培养基的氮源种类优选为蚕蛹粉。
实施例10发酵培养基采用的无机盐种类单因素分析实验
采用实施例1的工艺制备生物制剂，只改变发酵液的培养步骤中：发酵培养基采用的无机盐种类，进行实施例10-16；
实施例1采用的发酵培养基无机盐为1 g/L磷酸氢二钾+1 g/L氯化钠；
实施例10-16采用的发酵培养基无机盐见表6；
表6 实施例10-16采用的发酵培养基无机盐
经检测，实施例10-16制备的生物制剂的抗病毒活性见表7；
表7 实施例10-16制备的生物制剂的抗病毒活性
由表6、7可知，发酵培养基的无机盐种类优选为无水氯化钙。
实施例17 一种采用黄芪多糖制备抗新城疫病毒的生物制剂的工艺
步骤1、菌株活化
步骤2、种子液的培养
步骤1、2与实施例1的操作方法相同。
步骤3、发酵液的培养
（1）制备发酵培养基
所述发酵培养基的组成如下：以去离子水为介质，黄芪多糖3 g/L、麦芽糖2 g/L、蚕蛹粉10 g/L和无水氯化钙2 g/L。
（2）发酵
调节发酵液pH为7；
将步骤2得到的种子液接种于装有发酵培养基的三角瓶中，种子液接种比为1：10；三角瓶装液量为70ml；
所述三角瓶的规格为250ml；
在发酵温度30℃、发酵转速200rpm条件下培养24h，得到发酵液。
步骤4、制得生物制剂
将制得的发酵液，10000 r/min条件下离心分离10min，得到菌体和上清液。上清液经0.22μm滤器过滤后，得到生物制剂。
经检测，生物制剂产品的抗病毒活性为5.78×105 IU/ml。
实施例18发酵培养基各组分含量的正交试验
采用实施例17的工艺制备抗病毒生物制剂，只改变发酵液的培养步骤中发酵培养基各组分的含量，进行正交试验，正交试验因素水平见表8，正交试验结果见表9；
表8 正交试验因素水平表
表9正交试验结果与分析
从表8和表9可以看出，影响因素A-D中，对生物制剂活性影响程度由大到小为黄芪多糖＞麦芽糖＞蚕蛹粉＞无水氯化钙；
经试验，发酵培养基各组分含量优选为：黄芪多糖5 g/L，麦芽糖3 g/L，蚕蛹粉10 g/L，无水氯化钙1 g/L。
在此条件下制备的生物制剂，抗病毒活性为8.16×106 IU/ml。
实施例19发酵液的培养步骤中的发酵条件正交试验
采用实施例17的工艺制备抗病毒生物制剂，只改变发酵液的培养步骤中的发酵条件，进行正交试验，正交试验因素水平见表10，正交试验结果见表11；
表10 正交试验因素水平表
表11 正交试验结果与分析
从表10和表11可以看出，影响因素A-E中，对生物制剂活性影响程度由大到小为装液量＞发酵温度＞发酵液PH＞发酵转速＞发酵时间；
经试验，发酵条件优选为发酵温度30 ℃，发酵液PH 6，转速160 r/min，发酵时间28 h，装液量70 ml；
在此条件下制备生物制剂的效果为：活性为9.78×105IU/ml
实施例20 一种采用黄芪多糖制备抗新城疫病毒的生物制剂的工艺
步骤1、菌株活化
步骤2、种子液的培养
步骤1、2与实施例1的操作方法相同。
步骤3、发酵液的培养
（1）制备发酵培养基
所述发酵培养基的组成如下：以去离子水为介质，黄芪多糖5 g/L，麦芽糖3 g/L，蚕蛹粉10 g/L，无水氯化钙1 g/L。
（2）发酵
调节发酵液pH为6；
将步骤2得到的种子液接种于装有发酵培养基的三角瓶中，所述三角瓶的规格为250ml；
种子液接种比为1：10；三角瓶装液量为70ml，即三角瓶容量的7/25；
在发酵温度30℃、发酵转速160rpm条件下培养28h，得到发酵液。
步骤4、制得生物制剂
将制得的发酵液，10000 r/min条件下离心分离10min，得到菌体和上清液。上清液经0.22μm滤器过滤后，得到生物制剂。
在此条件下制备生物制剂的效果为：活性为1.08×106IU/ml，生物制剂的抗病毒活性较未发酵的黄芪多糖提高3541倍。
对生物制剂抗病毒稳定性进行检测，取生物制剂样品分别存放3、6、9、12个月，并检测其抗病毒活性，检测结果见表12；
表12 存放一定时间后生物制剂的抗病毒活性
从表12可见，本发明方法制备的生物制剂不但具备较强的抗病毒活性，而且稳定性好，存放12个月后生物制剂效价仍能达到为1.05×106 IU/ml。
生物制剂在预防新城疫中的应用：
选择13日龄、健康的不带病原体的鸡，随机分成三组，即对照组A、对照组B、试验组C；每组30只，每组设三个重复组；
对照组A：给予正常的饮用水，不加生物制剂，连续饮用7天；
对照组B：给予含黄芪多糖的饮用水，将浓度为0.5%的黄芪多糖与水按1：20的体积比混合；现配现用，在0.5h～1.5h内饮完，连续饮用7天；
试验组C：给予含生物制剂的饮用水，将本发明生物制剂与水按1：20的体积比混合，现配现用，最好控制在0.5h～1.5h内饮完，连续饮用7天；
三组鸡在同一条件下饲养，控制鸡舍温度28-31℃，鸡舍湿度58-62%。每
日向各个鸡舍提供等量的足量饲料和水；
饲养第3天开始，三组动物统一投喂等量含新城疫病毒的饲料，含病毒饲料的投喂量占饲料总量的1/2；三组动物的饮水方式如上述进行，每天记录每组鸡发病情况，具体见表13；
表13 每组鸡的发病情况
如表13所示，对照组A鸡的发病率为100%，累计死亡率为80%，对照组B鸡的发病率为53.3%，累计死亡率为33.3%；而实验组C鸡没有发病和死亡，说明本发明生物制剂对预防鸡新城疫病毒性疾病的有效保护率达到100%。
生物制剂在治疗新城疫中的应用：
选择5日龄、患有初期（感染1天内）新城疫的鸡，随机分成三组，分别为对照组1、对照组2、试验组3；每组20只，每组设三个重复组；
对照组1：给予正常的饮用水，不加生物制剂；
对照组2：给予含黄芪多糖的饮用水，将浓度为0.5%的黄芪多糖与水按1：20的体积比混合；现配现用，在0.5h～1.5h内饮完，连续饮用7天；
试验组3：给予含生物制剂的饮用水，将本发明生物制剂与水按1：20的体积比混合，现配现用，最好控制在0.5h～1.5h内饮完，连续饮用7天。
三组动物在同一条件下饲养，控制鸡舍温度28-31℃，鸡舍湿度58-62%。每日向各个鸡舍提供等量的足量饲料和水；
三组动物的饮水方式如上述进行，每天记录每组鸡发病情况，具体见表14；
表14 每组鸡的发病情况
如表14所示，对照组1和对照组2鸡的累计死亡率分别达到95%和45%，实验组3的累计死亡率约为5%，表明本发明生物制剂具有较强的抗病毒治疗作用，有效的降低死亡率，对治疗鸡初期新城疫的有效率为95%。
实施例21 一种采用黄芪多糖制备抗新城疫病毒的生物制剂的工艺
步骤1、菌株活化
步骤2、种子液的培养
步骤1、2与实施例1的操作方法相同。
步骤3、发酵液的培养
（1）制备发酵培养基
所述发酵培养基的组成如下：以去离子水为介质，黄芪多糖5 g/L，麦芽糖3 g/L，蚕蛹粉10 g/L，无水氯化钙1 g/L，维生素B7 0.5 g/L，赖氨酸 0.5 g/L。
（2）发酵
调节发酵液pH为6；
将步骤2得到的种子液接种于装有发酵培养基的三角瓶中，所述三角瓶的规格为250ml；
种子液接种比为1：10；三角瓶装液量为70ml，即三角瓶容量的7/25；
在发酵温度30℃、发酵转速160rpm条件下培养28h，得到发酵液。
步骤4、制得生物制剂
将制得的发酵液，10000 r/min条件下离心分离10min，得到菌体和上清液。上清液经0.22μm滤器过滤后，得到生物制剂。
在此条件下制备生物制剂的效果为：活性为1.08×106IU/ml，生物制剂的抗病毒活性较未发酵的黄芪多糖提高3541倍。
对生物制剂抗病毒稳定性进行检测，取生物制剂样品分别存放3、6、9、12个月，并检测其抗病毒活性，检测结果见表15；
表15 存放一定时间后生物制剂的抗病毒活性
从表15可见，本发明方法制备的生物制剂不但具备较强的抗病毒活性，而且稳定性好，存放12个月后生物制剂效价能达到为1.09×106 IU/ml。
经试验，本发明生物制剂对禽类无任何副作用。
除特殊说明的外，本发明所述的百分数均为质量百分数。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。