一种淡菜甾体活性组分提取物及其制备方法和应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410630741.8 (22)申请日 2014.11.11 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104398524 A (43)申请公布日 2015.03.11 (73)专利权人 浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路 38号 (72)发明人 戚建华 孙玉娟 向兰 (74)专利代理机构 杭州天勤知识产权代理有限 公司 33224 代理人 胡红娟 (51)Int.Cl. A61K 31/575(2006.01) A61P 39/00(2006.0。

2、1) C07J 9/00(2006.01) (56)对比文件 CN 102070695 A,2011.05.25, CN 1923843 A,2007.03.07, Yufang Weng.Ganodermasides A and B, two novel anti-aging ergosterols from spores of a medicinal mushroom Ganoderma lucidum on yeast via UTH1 gene. Bioorganic & Medicinal Chemistry .2010, 第18卷9991002. Karen J. Murphy.L。

3、ipid, FA, and Sterol Composition of New Zealand Green Lipped Mussel (Perna canaliculus)and Tasmanian Blue Mussel (Mytilus edulis). lipids .2002,第37卷(第6期),587-595. Matthew R. Miller.Detailed Distribution of Lipids in Greenshell Mussel. Nutrients .2014,第6卷1454-1474. Matthew R. Miller.Detailed Distribu。

4、tion of Lipids in Greenshell Mussel. Nutrients .2014,第6卷1454-1474. Duo Li.Seasonal Variations of Lipid Content and Composition. lipids .2007,第 42卷739-747. 审查员 陈振中 (54)发明名称 一种淡菜甾体活性组分提取物及其制备方 法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种淡菜甾体活性组分提取 物及其制备方法和应用。 以重量百分数计， 所述 淡菜甾体活性组分提取物包括： 2539的胆固 醇， 1927的菜子固醇， 1225的(22E , 24S)-。

5、麦角甾-5,22-二烯-3 -醇， 1225的24- 亚甲基胆固醇。 在酵母衰老模型K6001啤酒酵母 细胞中， 本发明的淡菜甾体活性组分提取物能够 显著延长酵母细胞的复制性寿命， 该组合物的抗 衰老活性均高于胆固醇、 菜子固醇、 crinosterol 和24-亚甲基胆固醇这四种甾醇化合物单独的抗 衰老活性； 本发明对延缓衰老及治疗衰老性疾病 方面的新药研发进行基础性研究， 具有重要的现 实意义。 权利要求书1页 说明书9页 附图3页 CN 104398524 B 2017.01.11 CN 104398524 B 1.一种淡菜甾体活性组分提取物， 其特征在于， 以重量百分数计， 包括： 2。

6、7的胆固醇， 19的菜子固醇， 12的(22E,24S)-麦角甾-5,22-二烯-3 -醇， 12的24-亚甲基胆固醇。 2.如权利要求1所述淡菜甾体活性组分提取物的制备方法， 其特征在于， 包括： (1)将淡菜置于甲醇中， 室温下浸提23天， 得浸提物； (2)用80的甲醇水溶液和正己烷对浸提物进行萃取， 取正己烷层， 得粗提物； (3)对粗提物进行分离纯化， 获得所述淡菜甾体活性组分提取物； 步骤(3)中， 所述分离纯化包括以下步骤： (a)以正己烷： 乙酸乙酯溶剂系统作洗脱剂， 采用硅胶开口柱对粗提物进行第一次分 离， 获得目标馏分； (b)以甲醇： 水溶剂系统作洗脱剂， 采用十八烷基键。

7、合硅胶开口柱对所述目标馏分进行 第二次分离， 获得所述淡菜甾体活性组分提取物； 第一次分离时， 将正己烷： 乙酸乙酯溶剂系统按体积比99:1、 98:2、 97:3、 96:4、 90:10、 0:100依次洗脱， 体积比90:10洗脱的馏分为目标馏分； 第二次分离时， 将甲醇： 水溶剂系统按照体积比90:10， 93:7， 95:5， 100:0依次洗脱， 取 体积比95:5洗脱的馏分， 获得所述淡菜甾体活性组分提取物。 3.如权利要求1所述淡菜甾体活性组分提取物在制备抗衰老药物中的应用。 4.一种抗衰老药物或保健品， 其特征在于， 由如权利要求1所述淡菜甾体活性组分提取 物和药学上可接受的。

8、载体组成。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104398524 B 2 一种淡菜甾体活性组分提取物及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明属于医药技术领域， 具体涉及一种淡菜甾体活性组分提取物及其制备方法 和应用。 背景技术 0002 据最新统计数据显示， 全世界60岁及以上老龄人口在2013年已达8.14亿， 预计到 2050年这个数字将超过20亿。 世界已进入老龄化社会， 随之而来的与衰老相关的疾病成为 日益凸显的问题。 包括阿尔茨海默病在内的神经退行性疾病是世界性的最严峻的公共卫生 难题之一。 仅在中国， 阿尔茨海默病的患者数量在1990年已有193万， 到2010年已增。

9、加至569 万。 在医药学领域， 寻找抗衰老及治疗神经退行性疾病的药物已成为急需解决的问题。 0003 如公开号为CN 102070695 A的中国专利文献公开了一种麦角甾醇衍生物， 该麦角 甾醇衍生物提取自中药灵芝孢子粉； 研究发现， 在抗衰老化合物的体外筛选模型中， 该麦角 甾醇衍生物可以显著延长酵母细胞的复制性寿命。 0004 经过对衰老机制的长期研究， 本领域内已形成多种衰老学说， 包括程序衰老说、 体 细胞突变说、 错误成灾说， 自由基说、 神经内分泌说、 免疫衰老说、 细胞之学说， 等等。 由此可 见， 衰老是一个十分复杂的过程， 即便是同一类抗衰老药物， 其发挥药效的方式也不尽相。

10、 同， 彼此之间无必然联系。 0005 海洋生物由于生活在特殊的环境中， 与陆地生物相比， 结构成分也具有特殊性， 近 年来成为新药研究者的主要研究对象。 并且我国的海洋资源丰富， 继中药之后， 海产品是另 一个药物资源宝库。 许多已上市的化妆品、 保健品的功能性成分就来自于海产品， 如胶原蛋 白， 二十二碳六烯酸(DHA)等。 因此海产品为我们寻找抗衰老药物提供了一个极具希望的新 领域。 0006 淡菜是贻贝(Mytilidae)肉的干制品。 贻贝是驰名中外的海产食品之一， 是贝类养 殖事业中的重要种类， 世界许多地区都有养殖。 它的药用价值也已有研究： 一种治疗耳鸣的 中药处方中就含有淡菜。

11、； 淡菜中的寡肽对于老年性脑功能失调具有治疗作用； 淡菜所含的 多级不饱和脂肪酸可预防心血管疾病； 脂质类提取物具有抗关节炎的作用。 而目前关于淡 菜的抗衰老活性还未见报道。 发明内容 0007 本发明提供了一种淡菜甾体活性组分提取物， 该提取物具有较强的抗衰老效果。 0008 一种淡菜甾体活性组分提取物， 以重量百分数计， 包括： 2539的胆固醇， 19 27的菜子固醇， 1225的(22E,24S)-麦角甾-5,22-二烯-3 -醇， 1225的24-亚甲基 胆固醇。 0009 上述四种甾醇化合物的结构式分别为： 说 明 书 1/9 页 3 CN 104398524 B 3 0010 0。

12、011其中， 胆固醇(cholesterol)的理化性质为： 白色固体； 分子式为C27H46O； 高分辨率质谱ESI-TOF-MS m/z 409.345,理论值： C27H46ONa(M+Na)+ 409.344.； 1H NMR(500MHz,CDCl3)： 0.68(s,3H),0.86(d,3H,J2.0Hz),0.87(d,3H,J 2.0Hz),0.92(d,3H,J6.5Hz),1.01(s,3H),3.52(m,1H),5.36(m,1H)。 13C NMR(125MHz, CDCl3): 12.0,18.9,19.5,21.2,22.7,23.0,24.0,24.5,28.。

13、1,28.4,31.8,32.1,32.1, 35.9,36.3,36.7,37.4,39.7,39.9,42.5,42.5,50.3,56.3,56.9,72.0,122.2,141.1. 0012 菜子固醇(brassicasterol)， 系统命名为(22E,24R)-麦角甾-5,22-二烯-3 -醇， 其理化性质为： 白色固体；分子式为C28H46O； 高分辨率质谱 ESI-TOF-MS m/z 421.345,理论值： C28H46ONa(M+Na)+421.344. 1H NMR(500MHz,CDCl3)： 0.69(s,3H),0.82(d,3H,J6.5Hz),0.83(d,。

14、3H,J6.5Hz),0.91(d,3H,J6.8Hz),1.01 (s,3H),1.01(d,3H,J6.5Hz),3.52(m,1H),5.18(m,2H),5.34(m,1H)。 13C NMR(125MHz, CDCl3): 12.2,17.8,19.6,19.8,20.1,21.1,21.2,24.4,28.7,29.9,31.8,32.1,33.3, 36.7,37.4,39.8,40.3,42.4,42.5,43.0,50.3,56.2,57.0,72.0,121.9,131.9,136.0, 140.9. 0013 (22E,24S)-麦角甾-5,22-二烯-3 -醇(crin。

15、osterol)的理化性质为： 白色固体； 分子式为C2 8H4 6O ； 高分辨率质谱ESI-TOF-MS m/z 421.345,理论值： C28H46ONa(M+Na)+421.344. 1H NMR(500MHz,CDCl3): 0.69(s,3H),0.82 (d,3H,J6.8Hz),0.84(d,3H,J6.8Hz),0.91(d,3H,J6.8Hz),1.00(d,3H,J6.9Hz), 1.01(s,3H),3.52(m,1H),5.16(m,2H),5.35(m,1H).13C NMR(125MHz,CDCl3): 12.2, 18.2,19.6,19.8,20.3,21.。

16、2,21.2,24.5,29.0,29.9,31.9,32.1,33.4,36.7,37.4,39.9, 40.4,42.4,42.5,43.2,50.3,56.1,57.1,72.0,121.9,132.0,136.2,141.0. 0014 24-亚甲基胆固醇(24-methylenecholesterol)， 系统命名为麦角甾-5， 24-(28)- 二烯-3 -醇， 其理化性质为： 白色固体；分子式为C28H46O； 高分辨 率质谱ESI-TOF-MS m/z 421.344,理论值： C28H46ONa(M+Na)+421.344.1H NMR(500MHz, CDCl3)： 0.6。

17、8(s,3H),0.95(d,3H,J6.6Hz),1.01(s,3H),1.02(d,3H,J6.9Hz),1.03 (d,3H,J6.9Hz),3.53(m,1H),4.66(s,1H),4.71(s,1H),5.35(m,1H)。 13C NMR(125MHz, CDCl3): 12.0,18.9,19.6,21.3,22.0,22.2,24.5,28.4,29.9,31.2,31.9,32.1,34.0, 说 明 书 2/9 页 4 CN 104398524 B 4 34.9,35.9,36.7,37.4,40.0,42.5,42.5,50.3,56.2,56.9,72.0,106.1。

18、,121.9,140.9, 157.1。 0015 作为优选， 以重量百分数计， 所述淡菜甾体活性组分提取物包括： 27的胆固醇， 19的菜子固醇， 12的(22E,24S)-麦角甾-5,22-二烯-3 -醇， 12的24-亚甲基胆固醇。 0016 本发明还提供了所述淡菜甾体活性组分提取物的制备方法， 包括： 0017 (1)将淡菜置于甲醇中浸提， 得浸提物； 0018 作为优选， 将淡菜置于甲醇中， 室温下浸提23天。 甲醇的破壁效果较好， 提取效 率较高。 0019 (2)用80的甲醇水溶液和正己烷对浸提物进行萃取， 取正己烷层， 得粗提物； 0020 (3)对粗提物进行分离纯化， 获得所。

19、述淡菜甾体活性组分提取物。 0021 所述分离纯化包括以下步骤： 0022 (a)以正己烷： 乙酸乙酯溶剂系统作洗脱剂， 采用硅胶开口柱对粗提物进行第一次 分离， 获得目标馏分； 0023 对粗提物进行TLC分析， 确定溶剂系统， 优选地， 将正己烷： 乙酸乙酯溶剂系统按体 积比99:1、 98:2、 97:3、 96:4、 90:10、 0:100依次洗脱， 体积比90:10洗脱的馏分为目标馏分。 0024 (b)以甲醇： 水溶剂系统作洗脱剂， 采用十八烷基键合硅胶开口柱对所述目标馏分 进行第二次分离， 获得所述淡菜甾体活性组分提取物。 0025 对所述目标馏分进行TLC分析， 确定溶剂系统。

20、， 优选地， 将甲醇： 水溶剂系统按照体 积比90:10， 93:7， 95:5， 100:0依次洗脱， 取体积比95： 5洗脱的馏分， 获得所述淡菜甾体活性 组分提取物。 0026 以90甲醇水溶液作流动相， 利用反相HPLC对所述淡菜甾体活性组分提取物作进 一步纯化， 从中分离到胆固醇、 菜子固醇、 (22E,24S)-麦角甾-5,22-二烯-3 -醇和24-亚甲 基胆固醇这四种甾醇化合物， 在淡菜甾体活性组分提取物中， 这四种甾醇化合物的总含量 大于50。 0027 本发明还提供了所述淡菜甾体活性组分提取物在制备抗衰老药物中的应用。 研究 发现， 该淡菜甾体活性组分提取物在抗衰老化合物的。

21、体外筛选模型中， 可以显著延长酵母 细胞的复制性寿命。 为了研究作用机制， 我们通过占重量比最大的胆固醇进行了抗衰老机 理研究， 发现胆固醇是通过调节UTH1基因、 SOD基因的表达， 减少活性氧自由基(ROS)和丙二 醛(MDA)的产生， 提高抗氧化能力， 从而实现酵母细胞复制性寿命的延长的。 0028 根据氧化自由基学说， 氧化压力是导致衰老的主要原因。 即使在正常条件下线粒 体也会产生有害的代谢产物活性氧(ROS)， 这些物质会破坏细胞膜和生物大分子， 例如蛋 白和核酸， 进而破坏细胞的功能， 引起衰老和死亡。 除此之外， 活性氧还可通过氧化不饱和 脂肪酸产生有害物来破坏细胞破， 比如丙。

22、二醛。 0029 UTH1是一个与氧化应激相关的基因。 UTH1敲除后的酵母不仅能显著延长其在营养 缺乏时的寿命， 还能增强其对过氧化物的耐受性。 转录因子Skn7能够感受氧化压力， 进而激 活下游的与氧化应激相关的基因。 本发明发现， 胆固醇的抗衰老活性与基因UTH1， Skn7相 关。 0030 SOD也是与氧化应激相关的基因， 表达的超氧化物歧化酶能够清除氧自由基， 缓解 氧化压力。 本发明发现， 胆固醇的抗衰老活性也与基因SOD相关。 说 明 书 3/9 页 5 CN 104398524 B 5 0031 本发明还提供了一种抗衰老药物或保健品， 由所述淡菜甾体活性组分提取物和药 学上可。

23、接受的载体组成。 0032 所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体， 如填充剂、 粘合剂、 湿润 剂、 吸收促进剂、 表面活性剂等。 所述填充剂可采用淀粉、 蔗糖或微晶纤维素； 所述粘合剂可 采用淀粉浆、 羟丙纤维素、 明胶或聚乙二醇； 所述湿润剂可采用硬脂酸镁、 微粉硅胶或聚乙 二醇类； 所述吸收促进剂可采用聚山梨脂或卵磷脂； 所述表面活性剂可采用伯洛沙姆、 脂肪 酸山梨坦或聚山梨脂。 另外还可以加入其它辅剂如香味剂、 甜味剂等。 0033 所述抗衰老药物或保健品的剂型可以是片剂， 丸剂， 粉剂， 分散片， 小药囊剂， 酏 剂， 混悬剂， 乳剂， 溶液剂， 糖浆剂， 气雾剂， 软胶。

24、囊， 硬胶囊， 无菌注射液， 搽剂或栓剂； 可制 成常规、 速释、 缓释或延迟释放制剂。 0034 本发明的抗衰老药物或保健品可通过各种途径给予， 包括口服、 鼻腔、 肌肉注射、 皮下注射、 静脉注射等。 0035 与现有技术相比， 本发明的有益效果为： 0036 在酵母衰老模型K6001啤酒酵母细胞中， 本发明的淡菜甾体活性组分提取物能够 显著延长酵母细胞的复制性寿命， 该组合物的抗衰老活性均高于胆固醇、 菜子固醇、 (22E, 24S)-麦角甾-5,22-二烯-3 -醇和24-亚甲基胆固醇这四种甾醇化合物单独的抗衰老活性； 本发明对延缓衰老及治疗衰老性疾病方面的新药研发进行基础性研究， 具。

25、有重要的现实意 义。 附图说明 0037 图1A为从淡菜中分离获得的四种甾醇化合物的结构式； 0038 其中， cholesterol表示胆固醇， brassicasterol表示菜子固醇， crinosterol表示 (22E,24S)-麦角甾-5,22-二烯-3 -醇， 24-methylenecholesterol表示24-亚甲基胆固醇， 下同； 0039 图1B为本发明淡菜甾体活性组分提取物(SF)对酵母k6001的复制性寿命的影响结 果； 0040 其中， Control为阴性对照， Resveratrol为白藜芦醇， SF是由淡菜分离得到的活性 组分 ， 经HPLC纯化得到Chol。

26、esterol ,Brassicasterol ,Crinosterol和24- Methylenecholesterol四个甾醇类化合物， 其中的Cholesterol,Brassicasterol, Crinosterol和24-Methylenecholesterol的重量百分数分别是27， 19， 12， 12(四 个化合物重量比例为23:16:10:10)， 还含有30的其他成分,下同； 0041 图1C为四种甾醇化合物对酵母细胞的复制性寿命的影响结果； 0042 图2为不同比例的甾醇成分所组成的混合物对酵母复制性寿命的影响。 混合物1和 混合物2完全由Cholesterol,Bra。

27、ssicasterol,Crinosterol和24-Methylenecholesterol 搭配组成， 重量比例分别为23:16:10:10和1:1:1:1； 0043 图3A为胆固醇对酵母突变菌株uth1复制性寿命的影响结果； 0044 其中， CHOL表示胆固醇， 下同； 0045 图3B为胆固醇对酵母突变菌株skn7复制性寿命的影响结果； 0046 图3C为胆固醇对酵母突变菌株sod1复制性寿命的影响结果； 说 明 书 4/9 页 6 CN 104398524 B 6 0047 图3D为胆固醇对酵母突变菌株sod2复制性寿命的影响结果； 0048 图4A为胆固醇对酵母细胞抗氧化性能的。

28、影响结果； 0049 图4B为在氧压下胆固醇对酵母细胞生存率的影响结果； 0050 图5A为胆固醇对酵母细胞内ROS含量的影响结果； 0051 其中， Fluorescent/107cell表示每107个细胞的荧光值； 0052 图5B为胆固醇对酵母细胞内MDA含量的影响结果； 0053 其中， MDA(nmol/mg protein)表示丙二醛(Malondialdehyde)的含量， 单位为纳摩 尔/毫克蛋白。 具体实施方式 0054 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。 0055 实施例1 淡菜甾体活性组分提取物的制备 0056 本实施例淡菜甾体活性组分提取物的制备方法，。

29、 包括以下步骤： 0057 (1)将179g淡菜干货置于1L甲醇(工业级)中， 室温下浸提3天(震荡)； 经抽滤浓缩 后， 得到甲醇浸提物。 0058 (2)用80的甲醇水溶液和正己烷萃取分离， 静置过夜， 将正己烷层减压浓缩旋干 后， 得到正己烷层粗样4g。 0059 (3)将正己烷层粗样用硅胶开口柱进行分离(200-300目)， 以正己烷 乙酸乙酯溶 剂系统作洗脱剂， 按正己烷 乙酸乙酯的体积比99:1， 98:2， 97:3， 96:4， 90:10， 0:100依次 洗脱， 取体积比90:10洗脱的馏分。 0060 (4)将步骤(3)所取馏分用ODS开口柱进行纯化， 以甲醇 水溶剂系统。

30、作洗脱剂， 按 甲醇 水的体积比90 10， 93 7， 95 5， 100 0依次洗脱， 取体积比95:5洗脱的馏分， 得到淡 菜甾体活性组分提取物147mg。 0061 (5)取淡菜甾体活性组分提取物16.7mg用反向HPLC纯化， 色谱条件： 色谱柱ODS- HG-5(10/250mm)， 流速3ml/min， 检测波长210nm， 流动相为为甲醇 水90 10， 得到化合物 cholesterol(胆固醇， 4.5mg， 保留时间为160.9min)， brassicasterol(菜子固醇， 3.2mg， 保 留时间为146.7min)， crinosterol(22E,24S)-麦。

31、角甾-5,22-二烯-3 -醇， 2.0mg， 保留时间 为136 .9min)， 24-methylenecholesterol(24-亚甲基胆固醇， 2 .0mg， 保留时间为 124.0min)。 0062 本实施例淡菜甾体活性组分提取物中含有27的胆固醇， 19的菜子固醇， 12 的(22E,24S)-麦角甾-5,22-二烯-3 -醇， 12的24-亚甲基胆固醇。 0063 (6)对所得四种化合物的理化特征及化学结构经13C NMR、 1HNMR、 HRMS、 D进行分 析结果如下： 0064胆固醇的理化性质： 白色固体；分子式为C27H46O； 高 分辨率质谱ESI-TOF-MS m。

32、/z 409.345,理论值： C27H46ONa(M+Na)+409.344.； 1H NMR(500MHz, CDCl3)： 0.68(s,3H),0.86(d,3H,J2.0Hz),0.87(d,3H,J2.0Hz),0.92(d,3H,J 6.5Hz),1.01(s,3H),3.52(m,1H),5.36(m,1H)。 13C NMR(125MHz,CDCl3): 12.0,18.9, 19.5,21.2,22.7,23.0,24.0,24.5,28.1,28.4,31.8,32.1,32.1,35.9,36.3,36.7,37.4, 39.7,39.9,42.5,42.5,50.3,。

33、56.3,56.9,72.0,122.2,141.1。 说 明 书 5/9 页 7 CN 104398524 B 7 0065菜子固醇的理化性质： 白色固体；分子式为C28H46O； 高 分辨率质谱ESI-TOF-MS m/z 421.345,理论值： C28H46ONa(M+Na)+421.344. 1H NMR(500MHz, CDCl3)： 0.69(s,3H),0.82(d,3H,J6.5Hz),0.83(d,3H,J6.5Hz),0.91(d,3H,J 6.8Hz),1.01(s,3H),1.01(d,3H,J6.5Hz),3.52(m,1H),5.18(m,2H),5.34(m,1。

34、H)。 13C NMR (125MHz,CDCl3): 12.2,17.8,19.6,19.8,20.1,21.1,21.2,24.4,28.7,29.9,31.8, 32.1,33.3,36.7,37.4,39.8,40.3,42.4,42.5,43.0,50.3,56.2,57.0,72.0,121.9,131.9, 136.0,140.9。 0066(22E ,24S)-麦角甾-5 ,22-二烯-3-醇的理化性质： 白色固体； 分子式为C28H46O； 高分辨率质谱ESI-TOF-MS m/z 421.345,理论值： C28H46ONa (M+Na)+421.344. 1H NMR(5。

35、00MHz,CDCl3): 0.69(s,3H),0.82(d,3H,J6.8Hz),0.84(d, 3H,J6.8Hz),0.91(d,3H,J6.8Hz),1.00(d,3H,J6.9Hz),1.01(s,3H),3.52(m,1H), 5.16(m,2H),5.35(m,1H). 13C NMR(125MHz,CDCl3): 12.2,18.2,19.6,19.8,20.3,21.2, 21.2,24.5,29.0,29.9,31.9,32.1,33.4,36.7,37.4,39.9,40.4,42.4,42.5,43.2,50.3, 56.1,57.1,72.0,121.9,132.0。

36、,136.2,141.0。 006724-亚甲基胆固醇的理化性质： 白色固体；分子式为 C28H46O； 高分辨率质谱ESI-TOF-MS m/z 421.344,理论值： C28H46ONa(M+Na)+421.344. 1H NMR (500MHz,CDCl3)： 0.68(s,3H),0.95(d,3H,J6.6Hz),1.01(s,3H),1.02(d,3H,J 6.9Hz),1.03(d,3H,J6.9Hz),3.53(m,1H),4.66(s,1H),4.71(s,1H),5.35(m,1H)。 13C NMR (125MHz,CDCl3): 12.0,18.9,19.6,21.3。

37、,22.0,22.2,24.5,28.4,29.9,31.2,31.9, 32.1,34.0,34.9,35.9,36.7,37.4,40.0,42.5,42.5,50.3,56.2,56.9,72.0,106.1,121.9, 140.9,157.1。 0068 四种化合物的结构式如图1A所示。 0069 实施例2 淡菜甾体活性组分提取物的抗衰老活性分析 0070 目前用于抗衰老研究的生物模型主要有老鼠， 线虫， 果蝇和酵母。 本实施例选择酿 酒酵母作为抗衰老研究的活性系统， 因为酵母是单细胞的真核生物， 生命周期短， 已获其完 整的基因组数据， 是目前常用的衰老模型生物。 同时以白藜芦醇作。

38、为阳性对照， 白藜芦醇是 目前众所周知的、 在多种动物模型上显示抗衰老作用的小分子化合物。 0071 分析方法包括以下步骤： 0072 (1)从-30冰箱取出K6001酵母菌株， 用PBS洗涤三次， 每次5ml， 除去其中的甘油。 最后加入1ml PBS， 吹打， 使其悬浮后加入到5ml液体培养基(1的酵母粉， 2的蛋白胨， 3的半乳糖)中。 28振摇(160r/min)培养48小时。 0073 (2)培养结束后用5ml PBS洗涤三次， 除去其中的液体培养基， 用血球计数板计数， 计算酵母的浓度。 0074 (3)采用无水乙醇作溶剂， 分别配制0.1 g/mL、 0.3 g/mL、 1.0 。

39、g/mL的淡菜甾体活 性组分提取物， 1 M的胆固醇、 菜子固醇、 (22E,24S)-麦角甾-5,22-二烯-3 -醇、 24-亚甲基 胆固醇， 10 M的白藜芦醇， 备用。 0075 (4)在灭过菌的培养皿中加入5ml的固体培养基(1的酵母粉， 2的蛋白胨， 2 的葡萄糖， 2的琼脂粉)， 待培养基凝固后， 向其中分别加入步骤(3)中配制好的样品， 溶剂 说 明 书 6/9 页 8 CN 104398524 B 8 挥发后加入4000个酵母， 用涂布器涂抹均匀， 28恒温培养48小时。 0076 (5)显微镜下每皿随机数出40个母细胞分别产生的子细胞个数， 并记录、 作图分 析， 结果见图。

40、1B、 图1C。 0077 图1B中， 阴性对照的K6001的平均寿命为8.00.34， 阳性对照(10 M的白藜芦醇) 是9.70.53*； 0.1、 0.3、 1 g/mL浓度的淡菜甾体活性组分提取物(SF)分别是10.3 0.46*,10.20.56*,9.20.43*。 因此， SF能延长酵母的复制性寿命， 且在低浓度下活 性最好。 0078 在图1C中， 阴性对照的K6001的平均寿命为是8 .00 .43； 阳性对照是9 .7 0.44*； 在1 M的浓度下， 胆固醇、 菜子固醇、 (22E,24S)-麦角甾-5,22-二烯-3 -醇、 24-亚甲 基胆固醇分别是9.90.47*,。

41、9.90.47*， 10.00.46*， 9.80.43*。 (*p0.01， *p 0.01和*p0.001表明有显著性差异)。 0079 说明四个化合物在1 M均能显著延长酵母的复制性寿命， 且程度几乎相同。 对图 1B、 C的结果的比较， 发现SF在浓度为0.1 g/ml时比其中的任何一个单独化合物(最佳浓度1 M， 相当于约0.4 g/ml)的抗衰老活性强。 0080 实施例3 不同组成的淡菜甾体活性组分提取物的抗衰老活性分析 0081 测试表1中不同组成的淡菜甾体活性组分提取物对酵母复制性寿命的影响， 分析 方法同实施例2， 分析结果见图2。 0082 表1 三种淡菜甾体活性组分提取。

42、物的组成成分 0083 0084 由图2可见， 阴性对照组酵母的平均寿命是8 .10 .43； 阳性对照是10 .6 0.52*； SF(即实施例1获得的淡菜甾体活性组分提取物)(0.1 g/ml)是10.40.51*； 混 合物1(0.07 g/mL)是10.50.53*； 混合物2(0.07 g/mL)是10.00.54*(*p0.01 和*p0.001表明有显著性差异)。 0085 对图2的结果分析发现当四个甾醇化合物以与SF中相同比例混合时(混合物1)， 抗 衰老活性与SF几乎相同， 表明SF中起到抗衰老作用的成分主要是这四种甾醇化合物， 其他 物质的抗衰老活性较低； 当改变这四种甾醇。

43、化合物的比例时(混合物2)， 仍然有显著抗衰老 活性， 但与SF相比， 活性强度稍减。 说明四个甾醇化合物在SF的抗衰老活性中共同起着重要 的作用， 比例的改变影响较小。 0086 实施例4 胆固醇的抗衰老机制分析 说 明 书 7/9 页 9 CN 104398524 B 9 0087 (1)测试胆固醇在1 M的活性浓度下是否能够延长敲除了UTH1基因的K6001酵母突 变菌株(uth1)的复制性寿命， 分析方法同实施例2， 分析结果见图3A。 0088 (2)测试胆固醇在1 M的活性浓度下是否能够延长敲除了Skn7基因的K6001酵母突 变菌株(skn7)的复制性寿命， 分析方法同实施例2，。

44、 分析结果见图3B。 0089 (3)测试胆固醇在1 M的活性浓度下是否能够延长敲除了SOD1基因的K6001酵母突 变菌株(sod1)的复制性寿命， 分析方法同实施例2， 分析结果见图3C。 0090 (4)测试胆固醇在1 M的活性浓度下是否能够延长敲除了SOD2基因的K6001酵母突 变菌株(sod2)的复制性寿命， 分析方法同实施例2， 分析结果见图3D。 0091 由图3A和3B可见， 1 M的胆固醇能延长K6001的复制性寿命， 但却不能延长uth1 和skn7的复制性寿命， 说明胆固醇通过调节基因UTH1， Skn7的表达延长酵母细胞的复制 性寿命。 由图3C和3D可见， 1 M的。

45、胆固醇能延长K6001的复制性寿命， 但却不能延长sod1和 sod2的复制性寿命， 说明胆固醇的抗衰老活性与SOD基因有关。 0092 实施例5 胆固醇提高酵母生存率的活性分析 0093 测试胆固醇能否提高酵母的生存率， 测试方法如下： 0094 (1)将-30保存的野生型酵母BY4741用5ml PBS洗涤三次， 除去其中的甘油； 加入 1ml无菌水， 吹打使其悬浮， 加入到5ml葡萄糖培养基(1的酵母粉， 2的蛋白胨， 2的葡 萄糖)中； 将其放入摇床， 28振摇(160r/min)培养48小时， 使其恢复生长能力。 0095 (2)将BY4741接种到25mL新的葡萄糖培养基， 调整O。

46、D600值为0.1， 然后分别与1 M、 3 M的胆固醇和阳性对照品(10 M的根皮苷， Phloridzin)孵育12小时。 0096 (3)取各组含有相同酵母细胞的培养液5 L滴在含有9mM H2O2的葡萄糖固体培养基 (1的酵母粉， 2的蛋白胨， 2的葡萄糖， 2琼脂)上； 28培养4天后观察酵母的生长状 况并照相， 观察结果见图4A； 0097 或者， BY4741与胆固醇孵育12小时后， 取每组约200个细胞分别涂在含有和不含有 4mM H2O2的葡萄糖固体培养基上； 28培养2天后计算酵母细胞生存率； 0098 酵母细胞生存率()(含4mM H2O2的葡萄糖固体培养基上的酵母菌落数。

47、/不含 H2O2的葡萄糖固体培养基上的酵母菌落数)100； 计算结果见图4B。 0099 由图4A可见， 与阴性对照相比， 在含有9mM H2O2的葡萄糖固体培养基上， 1 M、 3 M的 胆固醇明显增加了酵母的生存率。 0100 由图4B可见， 阴性对照的酵母细胞生存率为51.00.8， 1 M、 3 M的胆固醇孵 育下， 酵母细胞生存率分别提高到了60.62.1(p0.01)和68.41.9(p0.001)， 而10 M的根皮苷孵育下， 酵母细胞生存率提高到了61.52.9(p0.01)。 表明与根皮苷 相比， 胆固醇能够进一步提高酵母的生存率。 0101 实施例6胆固醇的抗氧化活性分析 。

48、0102 测试胆固醇能否提高酵母细胞的抗氧化能力， 测试方法如下： 0103 将-30保存的K6001酵母菌株用5ml PBS洗涤三次， 除去其中的甘油； 加入1ml无 菌水， 吹打使其悬浮， 加入到5ml液体培养基(1的酵母粉， 2的蛋白胨， 3的半乳糖)中； 将其放入摇床， 28振摇(160r/min)培养48小时， 使其恢复生长能力； 然后将K6001接种到 25mL新的葡萄糖培养基， 调整OD600值为0.1， 然后分别与1 M、 3 M的胆固醇孵育23小时， 测定 ROS或MDA含量。 说 明 书 8/9 页 10 CN 104398524 B 10 0104 其中， 使用ROS试剂盒(南京， 江苏， 碧云天)和酶标仪测定ROS含量： 取1mL酵母培养 液， 加入10 M DCFH-D。