技术领域
本发明属于生物医药技术领域 具体涉及一种环二核苷酸cGAMP-脂质体偶联单克隆抗体靶向缓释药物在抗肿瘤中以及在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
肿瘤是一类严重危害人类生命健康的重大疾病之一，表现为细胞过度增殖和分化异常。WHO专家预测，2020年全球人口肿瘤发病将达到2 000万人，死亡人数将达到1 200万人，肿瘤将成为本世纪人类第一杀手，对人类生存构成最严重的威胁。肺癌、结/直肠癌、胃癌、肝癌等的发病率和死亡率均居各类恶性肿瘤的前列。据全国肿瘤登记中心发布的(2012中国肿瘤登记年报》统计，每年新发生肿瘤病例约为312万例，平均每天8 550人，全国每分钟有6人被诊断为癌症。从病种来看，肺癌、胃癌、结/直肠癌、肝癌和食管癌，居全国恶性肿瘤发病的前五位。随着恶性肿瘤发病率和死亡率的逐年增加，恶性肿瘤治疗需求越来越大。
化疗是治疗肿瘤的有效方法之一。传统化疗药物的作用机制主要是阻止脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或蛋白质的合成，或直接对这些大分子发生作用，从而抑制肿瘤细胞的分裂增殖，使之死亡。有些药物也可以通过改变体内激素平衡而抑制肿瘤生长。目前抗肿瘤药物已发展到6大类：①抗代谢药；② 烷化剂；③ 细胞毒素类抗生素；④ 植物生物碱和其他天然药；⑤抗肿瘤激素类；⑥ 铂类及其他抗肿瘤药。随着临床治疗模式的转变和一些新的抗肿瘤药物靶点的发现，抗肿瘤药物领域的研发发生了巨大变化：就药物的作用机制而言，从传统的非特异性的细胞毒类药物转向了非细胞毒类的靶向药物开发。2012年FDA批准的抗肿瘤药物中，小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)成为研发最热门的一类抗肿瘤药物，尤其是作用于多个靶点的TKI(约占3／4)，截至2013年6月美国FDA批准的TKI已达18种。此外，其他热点作用机制药物包括免疫刺激剂、血管生成抑制剂、细胞周期抑制剂、免疫抑制剂和刺激剂、蛋白激酶抑制剂等。
在感染的哺乳动物细胞中微生物和病毒DNA能通过刺激干扰素分泌诱导內源强有力的免疫应答。内质网（ER）受体蛋白（STING）对胞质DNA的免疫应答是必需的因素。最近的研究表明，环化cGMP-AMP二核苷酸合成酶（cGAS）在结合DNA后的活化条件下，内源性地催化cGAMP的合成。cGAMP是一种胞质DNA传感器，它作为第二信使通过STING刺激INF-β的感应，介导TBK1和IRF-3的活化，进而启动INF-β基因的转录。最近报道，重组cGAS在DNA结合条件下催化环化cGMP-AMP二核苷酸GAMP。cGAS结合18bp dsDNA的复合物的晶体结构也已被报道，cGAMP在抗病毒免疫方面的研究已被证实。cGAMP结合STING，使转录因子IRF3激活并产生β干扰素。
脂质体缓释药物递送已经发展历经几十年时间，在抗肿瘤领域取得了长足的进步。制备脂质体的膜材料主要是磷脂和胆固醇等，目前已有多个脂质体制剂上市，并在临床上取得了广泛的应用。作为一种缓释药物载体，脂质体在延长药物半衰期，增强药效，靶向定点给药等方面具有广阔的应用前景。
单克隆抗体靶向治疗肿瘤已成为现代治疗肿瘤的革命性进步。贝伐珠单抗（Bevacizumab，商品名Avastin）是一种VEGF单克隆抗体，可抑制血管内皮生长因子，用于治疗各类转移性癌症，是罗氏公司的癌症治疗畅销药物。阿瓦斯汀其2009年的销售额达59亿美元。贝伐珠单抗,是一种阻碍血管生成的药物，通过抑制血管内皮生长因子的作用阻断对肿瘤的血液供应，抑制肿瘤在体内扩散，增强化疗效果。这种药物被美国药管局批准用于治疗肺癌、结肠癌和直肠癌，并在欧洲获准用于治疗乳腺癌。
PD-1，又称为程序性死亡受体1，为CD28超家族成员, 由日本京都大学本庶佑教授于1992年发现。PD-1的受体PD-L1，又叫细胞程式死亡-配体1或表面抗原分化簇274（cluster of differentiation 274，CD274）或 B7同源体（B7 homolog 1，B7-H1），是人类体内的一种蛋白质，由CD274基因编码。正常情形下，免疫系统会对聚集在淋巴结或脾脏的外来抗原产生反应，促发具抗原特异性的细胞毒杀性CD8+T细胞的增生。细胞程序化死亡受体-1（PD-1）与细胞程式死亡-配体1（PD-L1）结合，可以传导抑制性的信号，减低淋巴结CD8+ T细胞的增生，而通过阻断PD-1与PD-L1结合，可以有效阻止T淋巴细胞抑制信号，激活杀伤性T细胞或者效应T细胞。使用单克隆抗体阻断PD-L1与PD-1结合，可以活化效应T细胞，进而利用激活的效应T细胞杀伤肿瘤细胞，从而成为癌症免疫疗法的重要治疗手段。
发明内容
本发明的目的在于提供单克隆抗体偶联的脂质体包裹的环二核苷酸cGAMP在抗肿瘤中的应用。
本发明的目的还在于提出单克隆抗体偶联的脂质体包裹的环二核苷酸cGAMP靶向缓释药物在制备抗肿瘤药物中的应用，以制备高效、低毒、效果好的抗肿瘤药物。
本发明实验研究表明，单克隆抗体偶联的脂质体包裹的环二核苷酸cGAMP可以高效地抑制多种肿瘤细胞的生长，具有明显的抗肿瘤药效，可用于制备靶向缓释抗肿瘤药物。
本发明还涉及利用单克隆抗体偶联的脂质体包裹的环二核苷酸cGAMP所制备的抗肿瘤药。
具体地，所述肿瘤选自肺癌、胃癌、肝癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、肾瘤、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、食管癌、大肠癌、鼻咽癌、脑肿瘤、宫颈癌、血癌、骨癌、淋巴癌、胰脏癌等。
本发明所述的脂质体包括但不限于磷脂等。
本发明所述的环二核苷酸cGAMP，如不加说明，指的是2’3’-cGAMP或 Cyclic [G(2’,5’)pA(3’,5’)p]。
本发明获得的有益效果如下：
本发明所用的单克隆抗体偶联的脂质体包裹的环二核苷酸cGAMP靶向缓释抗肿瘤药物能够延长cGAMP代谢周期，增强抗肿瘤治疗效果，优于阳性药物5-FU，且优于单独使用cGAMP抗肿瘤治疗效果和脂质体包裹的环二核苷酸cGAMP。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容。在本发明中，以下所述的实施例是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。
实施例1：单克隆抗体偶联的脂质体包裹的cGAMP靶向缓释抗肿瘤药物的制备
cGAMP （环化-GMP-AMP）按文献方法在结合DNA后的活化条件下，由环化cGMP-AMP二核苷酸合成酶（cGAS）催化合成。纯度在98％以上。（Li P.W，et al., Immunity, 2013, 39(6), 1019-1031.）脂质体按照已经公开的文献方法制备并包裹cGAMP，制备成脂质体包裹的cGAMP药物，脂质体制备主要分为以下步骤:将磷脂等溶于有机溶剂，形成脂质溶液，去除有机溶剂，形成脂质薄膜，接着将薄膜分散在cGAMP水溶液中经超声处理成均一的脂质体。（Chen X., et al.,Int J Nanomedicine,2012,7:1139-1148; Waldrep J.C.,et al., Int J Pharm, 1998, 160(2):239-249）。单克隆抗体（VEGF、PD-1、PD-L1的单抗）购自美国Sigma公司。 单克隆抗体偶联脂质体的制备方法采用公开的文献方法（汪冰，杨翰仪， 单克隆抗体偶联脂质体的制备及其与胃癌细胞特异结合研究，沈阳药学院学报， 1994， 11（1）17-20.），采用戊二醛法，制备成单克隆抗体偶联的脂质体包裹的cGAMP药物。
实施例2：采用荷瘤鼠模型进行检测单克隆抗体偶联的脂质体包裹的cGAMP靶向缓释药物的抗肿瘤作用即对动物皮下移植瘤生长的抑制作用。
动物
种属、品系、性别、体重、来源、合格证
BALB/c 裸鼠、BALB/c普通小鼠、C57/BL6普通小鼠，雄性，体重16-18g， 6-8周龄， SPF 级，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物质量合格证号：SCXK （沪）2007-0005 ] 。
饲养条件
所有小鼠均自由觅食和饮水，在室温（23±2）℃下饲养于中国人民解放军某军医大学实验动物中心。饲料及水均经高压灭菌处理，全部实验饲养过程为SPF级。
剂量设置
静脉注射小鼠，设置1个剂量组：10 mg/kg
试验对照
阴性对照：生理盐水溶液
阳性对照1：5-氟尿嘧啶（5-FU），剂量10 mg/kg
阳性对照2：cGAMP，剂量10 mg/kg
给药方法
给药途径：尾静脉注射给药
给药体积：100 微升/只
给药次数：每天1次，连续21天
每组动物数：10只
肿瘤细胞株
人胃癌细胞株MNK-45，人肺腺癌细胞株A549，人结肠癌细胞株Lovo，人肝癌细胞株SMMC-7721，人前列腺癌细胞株PC-3，人胰腺癌细胞SW1990，小鼠结直肠癌细胞株CT26，小鼠肺癌Lewis瘤株 LL/2，均购自中国科学院细胞库。
试验主要步骤
1．肿瘤模型鼠的建立与干预
细胞培养，传代，在细胞对数期收集细胞，做成浓度为(1.0×107)每毫升的细胞悬液，小鼠右前肢腋下注射0.2 ml细胞悬液 (细胞数目为2.0×106个/只)，10 d左右肿瘤长至直径约5 mm，致瘤成功，随机均分为6组。六组分别为A：阴性对照组（静脉注射生理盐水组）、B：阳性对照5-FU组(静脉注射5-FU 10mg/kg组)、C：cGAMP组(静脉注射cGAMP)10mg/kg、D：cGAMP-脂质体偶联VEGF单抗组(静脉注射cGAMP 组)10 mg/kg，E：cGAMP-脂质体偶联PD-1单抗组(静脉注射cGAMP 组)10 mg/kg，F：cGAMP-脂质体偶联PD-L1单抗组(静脉注射cGAMP 组)10 mg/kg。每天给药1次，连续给药21天。21天后，处死小鼠并称瘤体重量，抑瘤率=[1-实验组平均瘤重(B、C、D、E、F组为实验组) ／A组平均瘤重)]×100％。
分别制备8种皮下移植瘤模型：人胃癌细胞株MNK-45，人肺腺癌细胞株A549，人结肠癌细胞株Lovo，人肝癌细胞株SMMC-7721，人前列腺癌细胞株PC-3，人胰腺癌细胞SW1990，移植到裸鼠，小鼠结直肠癌细胞株CT26，移植到BalB/C普通小鼠，小鼠肺癌Lewis瘤株 LL/2，移植到C57/BL6小鼠，观察cGAMP-脂质体偶联单抗药物抗肿瘤效果。
2．统计分析
数据用x±s表示，利用SPSS10.0软件进行处理，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验比较各组瘤重差异的显著性，显著性水平a=0.05。
结果
小鼠皮下接种肿瘤细胞后制备成功皮下移植瘤模型，单克隆抗体偶联的脂质体包裹的cGAMP、5-FU和cGAMP均可明显抑制肿瘤生长，给药21天后的瘤重均显著低于阴性对照组（P<0.05 ，P<0.01），单克隆抗体偶联的脂质体包裹的cGAMP均优于5-FU和cGAMP单独用药，表明单克隆抗体偶联的脂质体包裹的cGAMP具有更优的抗肿瘤作用。具体结果见表1-表8。
表1cGAMP-脂质偶联单抗对裸鼠人胃癌细胞株MNK-45皮下移植瘤的作用
（n=10，mean±SD）
组别 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）
阴性对照组 2.528±0.247 （g） -
5-FU组 0.746±0.299 （g）** 70.5
cGAMP组 0.743±0.121 （g）** 70.6
cGAMP-脂质体-VEGF单抗组 0.389±0.102 （g）** 84.6
cGAMP-脂质体-PD-1单抗组 0.368±0.100 （g）** 85.4
cGAMP-脂质体-PD-L1单抗组0.362±0.103 （g）** 85.7
注：*P<0.05 vs 阴性对照组；**P<0.01 vs 阴性对照组。
表2 cGAMP-脂质偶联单抗对裸鼠人肺腺癌细胞株A549皮下移植瘤的作用
（n=10，mean±SD）
组别 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）
阴性对照组 2.439±0.372 （g） -
5-FU组 0.843±0.217 （g）** 65.4
cGAMP组 0.729±0.132 （g）** 70.1
cGAMP-脂质体-VEGF单抗组 0.394±0.162 （g）** 83.8
cGAMP-脂质体-PD-1单抗组 0.362±0.103 （g）** 85.1
cGAMP-脂质体-PD-L1单抗组 0.370±0.152 （g）** 84.8
注：*P<0.05 vs 阴性对照组；**P<0.01 vs 阴性对照组。
表3 cGAMP-脂质偶联单抗对裸鼠人结肠癌细胞株Lovo皮下移植瘤的作用
（n=10，mean±SD）
组别 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）
阴性对照组 2.124±0.243 （g） -
5-FU组 0.781±0.243 （g）** 63.2
cGAMP组 0.714±0.159 （g）** 66.4
cGAMP-脂质体-VEGF单抗组 0.359±0.102 （g）** 83.1
cGAMP-脂质体-PD-1单抗组 0.366±0.100 （g）** 82.8
cGAMP-脂质体-PD-L1单抗组 0.352±0.103 （g）** 83.4
注：*P<0.05 vs 阴性对照组；**P<0.01 vs 阴性对照组。
表4 cGAMP-脂质偶联单抗对裸鼠人肝癌细胞株SMMC-7721皮下移植瘤的作用
（n=10，mean±SD）
组别 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）
阴性对照组 2.765±0.234 （g） -
5-FU组 0.879±0.236 （g）** 68.2
cGAMP组 0.788±0.285 （g）** 71.5
cGAMP-脂质体-VEGF单抗组 0.476±0.143 （g）** 82.8
cGAMP-脂质体-PD-1单抗组 0.459±0.125 （g）** 83.4
cGAMP-脂质体-PD-L1单抗组 0.468±0.113 （g）** 83.1
注：*P<0.05 vs 阴性对照组；**P<0.01 vs 阴性对照组.
表5 cGAMP-脂质体对裸鼠人前列腺癌细胞株PC-3皮下移植瘤的作用
（n=10，mean±SD）
组别 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）
阴性对照组 2.578±0.267 （g） -
5-FU组 0.823±0.212 （g）** 68.1
cGAMP组 0.855±0.146 （g）** 66.8
cGAMP-脂质体-VEGF单抗组 0.397±0.122 （g）** 84.6
cGAMP-脂质体-PD-1单抗组 0.386±0.134 （g）** 85.3
cGAMP-脂质体-PDL-1单抗组 0.392±0.143 （g）** 84.8
注：*P<0.05 vs 阴性对照组；**P<0.01 vs 阴性对照组。
表6 cGAMP-脂质偶联单抗对裸鼠人胰腺癌细胞SW1990皮下移植瘤的作用
（n=10，mean±SD）
组别 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）
阴性对照组 2.467±0.243 （g） -
5-FU组 0.724±0.232 （g）** 70.7
cGAMP组 0.741±0.147 （g）** 70.0
cGAMP-脂质体-VEGF单抗组 0.379±0.102 （g）** 84.6
cGAMP-脂质体-PD-1单抗组 0.371±0.100 （g）** 85.0
cGAMP-脂质体-PD-L1单抗组 0.368±0.103 （g）** 85.1
注：*P<0.05 vs 阴性对照组；**P<0.01 vs 阴性对照组.
表7 cGAMP-脂质偶联单抗对BalB/C鼠结直肠癌细胞CT26皮下移植瘤的作用
（n=10，mean±SD）
组别 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）
阴性对照组 2.244±0.266 （g） -
5-FU组 0.765±0.246 （g）** 65.9
cGAMP组 0.784±0.185 （g）** 65.0
cGAMP-脂质体-VEGF单抗组 0.369±0.112 （g）** 83.6
cGAMP-脂质体-PD-1单抗组 0.361±0.120 （g）** 83.9
cGAMP-脂质体-PD-L1单抗组 0.359±0.123 （g）** 84.0
注：*P<0.05 vs 阴性对照组；**P<0.01 vs 阴性对照组.
表8 cGAMP-脂质偶联单抗对C57鼠肺癌Lewis瘤株 LL-2皮下移植瘤的作用
（n=10，mean±SD）
组别 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）
阴性对照组 2.940±0.337 （g） -
5-FU组 0.846±0.298 （g）** 71.2
cGAMP组 0.828±0.237 （g）** 71.8
cGAMP-脂质体-VEGF单抗组 0.478±0.112 （g）** 83.7
cGAMP-脂质体-PD-1单抗组 0.467±0.107 （g）** 84.1
cGAMP-脂质体-PD-L1单抗组 0.462±0.104 （g）** 84.3
注：*P<0.05 vs 阴性对照组；**P<0.01 vs 阴性对照组.
实施例3 cGAMP-脂质偶联单抗的急性毒性研究
实验材料
ICR 小鼠30 只（购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物质量合格证号：SCXK （沪）2007-0005 ] ），雌雄各半，体重18～22g，动物以颗粒饲料喂养，自由摄食和饮水。
cGAMP-脂质体偶联单抗由实施例1制备，用生理盐水配制成浓度为200 mg/mL 的溶液。
实验方法
ICR小鼠按体重单次尾静脉注射2g/kg 的cGAMP-脂质体偶联单抗（分别为VEGF、PD-1、PDL-1的单抗）靶向缓释药物，观察给药后小鼠14天内的毒性反应及死亡情况。结果发现，小鼠单次尾静脉注射给药后，小鼠活动正常。给药后14天内，小鼠未出现死亡，第15天，全部小鼠处死，解剖，肉眼检查各脏器，均未见明显病变。
实验结果
上述急性毒性实验结果表明，静脉注射给药最大耐受量MTD 不低于2 g/Kg，说明三种cGAMP-脂质体偶联单抗药物的急性毒性均低。