技术领域
本公开内容涉及石榴提取物、包含所述石榴提取物的健康功能食品或药物组合物，以及所述石榴提取物缓解妇女的绝经期症状的作用。
背景技术
雌激素是内分泌激素之一，其在体内由胆固醇合成并主要由卵泡和黄体分泌。当由垂体前叶分泌的促性腺激素传送信号给生殖器官时，调节月经周期和使能够妊娠的卵泡刺激激素(follicle stimulating hormone，FSH)和黄体化激素(luteinizing hormone，LH)被分泌并作用于卵巢，后者分泌雌激素和黄体酮。雌激素是一组激素的总称，包括雌二醇，雌酮和雌三醇。
绝经前妇女的卵巢是雌激素的主要来源。当妇女达到绝经期，其衰老的卵巢不太会对垂体促性腺激素(卵泡刺激激素和黄体化激素)响应，导致早期卵泡期的进一步缩短。结果，月经周期和排卵期更短，黄体酮的产生降低，而且周期更加不规律。结果，卵泡对垂体促性腺激素不响应，因此不能进一步产生雌激素。雌激素的分泌降低可能对妇女的身体(包括泌尿生殖系统)产生重大影响。此外，当停止排卵时，这将导致绝经，这表示月经结束，或绝经前激素降低导致绝经期症状的发生。
绝经后妇女迅速降低的雌激素导致显著提高的心理和情绪症状(例如，疲劳、兴奋、失眠、注意力不集中、抑郁、记忆力减退、头痛、焦虑、以及紧张或心过小(microcardia))的危险。其他可能的危险包括由睡眠障碍(由反复发作的面部潮红所致)引起的疲劳和兴奋、间歇性头晕、感觉异常、心动过速和心搏过速、恶心、便秘、腹泻、关节痛、肌肉痛、手脚冰凉和体重增加。另外，绝经后的妇女易患骨质疏松症和心血管疾病，包括心脏病、高血压和卒中，这些都与死亡率升高有关(Kalin MF&Zumoff B.Steroids 55：330-352，1990)。此外，引起了外皮和泌尿生殖系统的改变，发生自身免疫病、白内障和结肠直肠癌的可能性升高。
用于缓解绝经期症状(例如面部潮红)的最有效的已知方法是给需要 补充雌激素的妇女施用雌激素。
然而，长期施用合成的雌激素可能会导致引起严重的问题，例如乳腺癌和子宫癌的发生(参见Tamini RT等.Arch intern med 166：1483-1489，2006，Gertig DM.Menopause 13：178-184，2006，Strom BL等.Am J Epidemiol 164：775-586，2006，AraJr NL&Athanazio DA.Cad Saude Publica 23：2613-2622，2007)。最近许多可靠的报告宣称，长期施用作为激素替代治疗的合成雌激素提高了诱发乳腺癌的可能性。这一结论在社会的各个领域以及在研究组中仍然极具争议。尽管尚未清楚地说明乳腺癌发生的确切原因，但是已经经历合成雌激素替代治疗的妇女的乳腺癌的发生风险被认为与随时间的雌激素暴露剂量相关。
因此，相当多的研究工作已经指向寻找植物雌激素(一类来源于植物的雌激素)作为用于激素替代治疗中合成雌激素的更安全的替代物。植物雌激素是指在动物体内发挥雌激素作用的非甾体植物化合物，并且大多数的谷物、水果以及已知具有抗癌活性并可有效对抗心脏疾病的蔬菜含有少量植物雌激素。
也就是说，对能有效缓解妇女的绝经期症状而不引起疾病(例如乳腺癌和子宫癌)的安全药物或健康功能食品的需求日益提高。
在这些情况下，本公开内容的发明人开发了一种健康功能食品，其包含以含有0.8至1.8mg/g鞣花酸为特征的石榴提取物，并且其专利申请在2013年5月29日被授予韩国专利No.10-1272602的专利权。但是，由于在所开发的石榴提取物中包含的鞣花酸的最大浓度仅为1.8mg/g，所以常常施用大量的石榴提取物以期望对妇女的绝经期症状显著缓解的作用，但在这种情况下，包含在石榴提取物中的多酚类物质的大量摄取引起继发性症状(例如，心跳(heart bits)加快)。因此，需要研究开发具有更高鞣花酸含量的优异的石榴提取物，以提供即使在少量时对妇女的绝经期症状的优异缓解作用，从而提高对妇女的绝经期症状的缓解作用，并且这可以解决由于在天然产物中的独特物质(尤其是多酚类物质)而对某些人限制使用的问题。
发明内容
技术问题
本公开内容涉及提供有效地缓解妇女的绝经期症状并且可以施用于 对多酚类物质敏感之个体的石榴提取物及其制备方法。
技术方案
为了达到上述目的，本公开内容提供了每克石榴提取物总重量含有1.8mg至3.2mg鞣花酸的石榴提取物及其制备方法。
优选地，本公开内容提供了对妇女的绝经期症状具有提高的缓解作用的石榴提取物，其中每克石榴提取物总重量含有2.4mg至3.2mg鞣花酸(更优选2.7mg至3.2mg的鞣花酸)。
当鞣花酸的浓度小于1.8mg时，对妇女的绝经期症状的缓解作用低，当鞣花酸的浓度高于3.2mg时，担心存在副作用，例如，肝功能谷草转氨酶(glutamic oxaloacetic transminase，GOT)和谷丙转氨酶(glutamate pyruvate transaminase，GPT)的指数超出正常范围。
在一个方面，本公开内容提供了用于缓解妇女的绝经期症状的健康功能食品，其包含作为有效成分的石榴提取物，所述石榴提取物中每克石榴提取物总重量含有1.8mg至3.2mg鞣花酸，其中该石榴提取物的最大总日剂量小于或等于15ml(优选地，小于或等于10ml)。
当石榴提取物中鞣花酸的含量提高时，可以提高对妇女的绝经期症状的缓解作用，然而在试图提高石榴提取物中鞣花酸的含量时，当将石榴提取物简单地浓缩时，鞣花酸的含量提高到很高，但是同时，天然产物中的独特物质(尤其是多酚类物质)的含量提高，限制了对多酚类物质敏感之个体的施用。基于这一发现，本公开内容提供具有每克石榴提取物总重量含有1.8mg至3.2mg之高含量鞣花酸的，其中该石榴提取物的最大总日剂量小于或等于15ml(优选地，小于或等于10ml)，因此，即使在低剂量下摄取，石榴提取物也能对妇女的绝经期症状显示出充分的缓解作用，并且最小化了多酚含量，因此可以提高对多酚类物质敏感之个体的耐受性，并提供了用于缓解妇女的绝经期症状的健康功能食品，其包含具有作为有效成分的每克石榴提取物总重量含有1.8mg至3.2mg之高含量鞣花酸的石榴提取物。
在本公开内容中，绝经期症状包括但不限于：面部潮红、发汗、失眠、神经质、抑郁、头晕、注意力不集中、关节痛、头痛、心动过速、阴道干燥、疲劳、兴奋、失眠、记忆力减退、焦虑和动脉粥样硬化性血管疾病。
在本公开内容中，应注意，苯酚被定义为用一个羟基(-OH)取代苯 环(C6H6)中的一个氢原子的物质，且多酚是具有两个或多个羟基的物质，并且已经报道过多酚具有积极的作用，例如抗氧化剂功能，但过多的多酚摄取导致副作用，例如，肝损伤或肾损害的风险。
在本公开内容中，对多酚敏感是指摄取多酚后与正常个体相比具有更高的副作用风险，并且适于具有潜在或持续的绝经期症状风险的个体。
根据本公开内容的石榴提取物对妇女的绝经期症状具有充分的缓解作用，同时将每石榴提取物克总重量中的多酚含量最小化至优选10mg至14mg，更优选10mg至13mg，以及最优选10mg至12.5mg。
石榴(Punica granatum L.)是一种天然生长于亚洲西南部、印度的西北地区和美国加利福尼亚州的植物。石榴在热带和亚热带地区广泛栽培。从古至今，石榴(特别是红石榴)被认为是滋补药材。特别地，已知石榴能非常有效地预防高血压和动脉硬化。石榴包含多达38％至47％量的水溶性碳水化合物以及多种类型的维生素和矿物质。
虽然所使用的石榴在生产地区和收获时间上存在差异，但是根据本公开内容的用于石榴提取物的石榴包括每克最终石榴提取物总重量含有1.8mg至3.2mg鞣花酸、优选2.4mg至3.2mg、并且更优选2.7mg至3.2mg鞣花酸的石榴。优选地，在本公开内容中可使用来自土耳其或美国的石榴或其混合物，并且例如，土耳其石榴品种包括但不限于：Hicaznar石榴品种、Cekirdeksiz VI石榴品种、Silifke Asisi石榴品种、Katirbasi石榴品种和Lefan石榴品种。优选地，可用的石榴包括每克最终石榴提取物总重量含有10mg至14mg多酚、更优选10mg至13mg、最优选10mg至12.5mg多酚的石榴。
根据本公开内容用于制备石榴提取物的优选的石榴部分是石榴果肉。
在根据本公开内容的石榴提取物中，根据本公开内容的石榴提取物与市售产品两者之间的鞣花酸含量有很大的差别，并且特别是当与韩国专利No.10-1272602中公开的石榴提取物相比，不仅石榴提取物的上述代表性成分的含量而且物质(例如多酚类物质)的含量几乎相同，而且在鞣花酸的含量上有很大的差别。据推测，当即使以有限的低日剂量施用石榴提取物时，这种差别导致了对妇女的绝经期症状的优异的缓解作用。此外，根据本公开内容的石榴提取物中的多酚含量与韩国专利No.10-1272602中公开的石榴提取物中的多酚含量稍有不同，并取得了对绝经期症状同等水平的缓解作用，与韩国专利No.10-1272602中公开的石榴提取物相比，根据 本公开内容的石榴提取物可以由更低剂量的施用取得同等的作用，并且进而减少了包括在石榴提取物中的多酚的摄取，所以可以推测石榴提取物可以施用于对多酚敏感的个体。
因此，本公开内容还提供了用于缓解妇女的绝经期症状的组合物，其包含根据本公开内容的石榴提取物，所述石榴提取物中每克石榴提取物总重量含有1.8mg至3.2mg鞣花酸，优选地，用于缓解妇女的绝经期症状的组合物，其包含每克石榴提取物总重量含有10mg至14mg多酚的石榴提取物，其使得能够对多酚类物质敏感的个体施用。
据推测，根据本公开内容的石榴提取物中高含量的鞣花酸是由原料石榴的生产地区差异、仅使用果肉以及下述的特殊制备方法(例如，石榴萃取的浓缩方法和加热温度和压力)引起的，但是本公开内容不限于此。
根据本公开内容的石榴提取物可以通过以下方法制备。例如，首先，清洗石榴后，将果皮和种子从石榴中完全除去，随后在高温下短时间灭菌，并且添加淀粉降解酶以降解存在于石榴中的多糖，例如淀粉。接着，任选地，加入添加剂(例如，明胶、二氧化硅、膨润土、硅溶胶、丹宁、纤维素或酪蛋白酸钾)以控制石榴提取物的浊度、颜色和粘度，然后通过加热浓缩，生成具有特定含量鞣花酸的石榴提取物。另外，此方法可能还包括个别步骤之间的过滤步骤，例如，在去皮和去籽步骤后但在高温灭菌步骤前、在用淀粉降解酶处理的步骤后但在浓缩步骤前、以及在浓缩步骤后存在至少一个这种步骤。
更具体地，可以通过包括以下步骤的方法制备每克石榴提取物总重量含有1.8mg至3.2mg鞣花酸的石榴提取物：
S1)将来自土耳其的石榴、来自美国的石榴或其混合物去皮和去籽以只得到石榴果肉；
S2)将石榴果肉在100℃至105℃下灭菌50秒至80秒，并冷却到48℃至55℃；
S3)用淀粉降解酶在48℃至55℃下处理经冷却的石榴果肉；以及
S4)将经压碎的石榴果肉按先后顺序在70℃至100℃和400毫巴至850毫巴的高温和高压下加热浓缩至少两次，以及在40℃至80℃和100毫巴至350毫巴的低温和低压下加热浓缩至少一次。
任选地，所述制备方法还可以包括在S1之后但在S2之前、S3之后但在S4之前、以及在S4之后的至少一项时的过滤步骤。
以下提供了每一个步骤更详细的描述。
S1)将来自土耳其的石榴、来自美国的石榴或其混合物去皮和去籽以只得到石榴果肉；
本公开内容提供了仅使用石榴果肉而不含石榴果皮和种子的提取物；石榴果皮和种子可能会引起副作用，例如，包含在石榴果皮中的特殊的生物碱会使人的身体机能降低并负面地影响呼吸系统和肌肉，以及对生物碱成瘾引起癫痫发作(seizure)、惊厥和麻醉。此外，来自石榴种子的提取物具有副作用，例如，某些人摄取后可出现变态反应(例如，舌肿胀)。
S2)将石榴果肉在100℃至105℃下灭菌50秒至80秒，并冷却到48℃至55℃；
使石榴果肉按先后顺序经过灭菌和冷却步骤。灭菌优选地在100℃至105℃下进行50秒至80秒，并且更优选地，灭菌在55秒至70秒内快速地进行，冷却优选地进行到48℃至55℃。
S3)用淀粉降解酶在48℃至55℃处理经冷却的石榴果肉。
使经冷却的石榴果肉经过用淀粉降解酶处理。优选地，该步骤可以在48℃至55℃进行10分钟至60分钟，更优选地在48℃至55℃进行20分钟至40分钟。可用的淀粉降解酶不限于特定的类型，并包括本领域中已知的各种淀粉降解酶，例如，果胶酶、蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶，优选果胶酶。
S4)将经压碎的石榴果肉按先后顺序在70℃至100℃和400毫巴至850毫巴的高温和高压下加热浓缩至少两次，以及在40℃至80℃和100毫巴至350毫巴的低温和低压下加热浓缩至少一次。
经压碎的石榴果肉经受按先后顺序的高温和高压下加热浓缩，以及低温和低压下加热浓缩。
优选地，加热浓缩可以包括在高温和高压下加热浓缩至少两次，更优选至少三次，以及低温和低压下加热浓缩至少一次，更优选地至少两次，总计至少三次。
高温和高压下的加热浓缩在70℃至100℃的温度条件范围和400毫巴至850毫巴的压力条件范围内进行，每次浓缩时通过加热改变温度和压力，并且如果高温和高压落入上述温度和压力范围内，就对温度和压力没有限制，并且这种变化可以包括在本公开内容的范围内。优选地，第一次 加热浓缩可以在70℃至85℃和400毫巴至550毫巴下进行，第二次加热浓缩可以在85℃至92℃和550毫巴至750毫巴下进行，以及第三次加热浓缩可以在92℃至100℃和750毫巴至850毫巴下进行。更优选地，第一次加热浓缩可以在78℃至82℃和450毫巴至500毫巴下进行，第二次加热浓缩可以在85℃至90℃和600毫巴至650毫巴下进行，以及第三次加热浓缩可以在92℃至98℃和800毫巴至850毫巴下进行。
低温和低压下的加热浓缩在40℃至80℃的温度条件范围和100毫巴至350毫巴的压力条件范围内进行，每次浓缩时通过加热改变温度和压力，并且如果低温和低压落入上述温度和压力范围内，就对温度和压力没有限制，并且这种变化可以包括在本公开内容的范围内。优选地，第四次加热浓缩可以在60℃至80℃和250毫巴至350毫巴下进行，以及第五次加热浓缩可以在40℃至60℃和100毫巴至250毫巴下进行。更优选地，第四次加热浓缩可以在65℃至72℃和300毫巴至330毫巴下进行，以及第五次加热浓缩可以在45℃至55℃和100毫巴至150毫巴下进行。
本公开内容还提供了用于缓解妇女的绝经期症状的组合物，其包含作为有效成分的根据本公开内容的石榴提取物，所述石榴提取物中每克石榴提取物总重量含有1.8mg至3.2mg鞣花酸，其中石榴提取物的最大总日剂量小于或等于15ml(优选地，小于或等于10ml)。根据本公开内容的用于缓解妇女的绝经期症状的组合物具有广泛的应用范围，例如，药物组合物或健康功能食品。
因此，本公开内容提供了用于缓解妇女的绝经期症状的健康功能食品或药物组合物，其包含作为有效成分的石榴提取物，所述石榴提取物中每克石榴提取物总重量含有1.8mg至3.2mg鞣花酸，其中石榴提取物的最大总日剂量小于或等于15ml(优选地，小于或等于10ml)。
根据本公开内容的健康功能食品包含作为有效成分的石榴提取物，与传统石榴提取物相比，所述石榴提取物含有高浓度的鞣花酸和等量或更少量天然产物中的独特物质，尤其是多酚类物质。因此，当石榴提取物的最大总日剂量小于或等于15ml(优选地，小于或等于10ml)时，对妇女的绝经期症状提供了显著优异的缓解作用，并且因此其可以施用于对多酚类物质敏感的个体。
此外，在本公开内容的一个实施方案中，当将根据本公开内容的石榴果肉提取物以15ml的日剂量施用时，给药后的人体健康指数(例如，红细胞(RBC)计数、血尿素氮(BUN)水平、天冬氨酸转氨酶(AST) 水平、丙氨酸转氨酶(ALT)水平、肌酸酐水平、葡萄糖水平和S-G值)都在正常范围内，因此在人体中可以以无副作用的安全方式实现对绝经期症状的缓解作用。
根据本公开内容的健康功能食品可以以单剂量分装(fractionally packaged)在单个容器中，并且所述单剂量可以包含15ml至1ml的石榴提取物，优选15ml、14ml、13ml、12ml、11ml、10ml、5ml、4ml、3ml、2ml和1ml中的任一剂量。
除了石榴提取物，根据本公开内容的健康功能食品还可以包含单独或组合的山芍药(Paeonia japonica)、山茱萸(Cornus officinalis)、刺五加(Acanthopanax senticosus)、灵芝(Ganoderma lucidium)、花曲柳(Fraxinus rhynchophylla)的茎皮、杜仲(Eucommia ulmoides)、朝鲜当归(Angelica gigas)、栀子(Gardenia jasminoides)、黄芪(Astragalus membranaceus)、麦芽、枳(trifoliate orange)、维生素C、低聚果糖、甜菊苷、纯化水和麦芽糖糊精，而不脱离本公开内容的范围，但是还包含在本公开内容的健康功能食品中的其他药理学有效成分和/或添加剂不限于前述实例。
例如，根据本公开内容的健康功能食品可以包含水溶性维生素，例如硫胺素(维生素B1)、核黄素、抗坏血酸、烟酸和维生素B6；脂肪酸，例如肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸；弱酸，例如乙醇酸和乙酸；以及氨基酸，诸如八种必需氨基酸(即苏氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和赖氨酸)、天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸和精氨酸。
本公开内容提供用于改善石榴提取物缓解妇女的绝经期症状的作用的方法，并且优选地，该方法可以包括将鞣花酸含量调整为每克石榴提取物总重量1.8mg至3.2mg、更优选2.4mg至3.2mg、甚至更优选2.7mg至3.2mg。优选地，该方法可以包括将多酚含量调整为每克石榴提取物总重量10mg至14mg、更优选10mg至13mg、且最优选10mg至12.5mg。有益作用
根据本公开内容，即使在低的日剂量下摄取，也可以预期到对妇女的绝经期症状的优异的缓解作用，因此使得能够对多酚类物质敏感的个体施用。
具体实施方式
本发明的最佳实施方案
在下文中，将参照实施例详细说明本公开内容，以帮助理解本公开内容。然而，这些实施例可以以多种不同的形式呈现，而不应理解为限制本公开内容的范围。实施例向本公开内容所属领域的普通技术人员提供了对本公开内容更充分的解释。
<实施例1>具有高含量鞣花酸的石榴提取物的制备
首先，将1,000kg石榴中的所有异物除去，选择没有损伤的水果并清洗。将挑选的水果切开、去皮并且通过压榨去籽，产生450kg的石榴果肉。过滤后，将石榴果肉在1000至105℃下灭菌60秒，并再次冷却至48℃至55℃。以每1,000升石榴汁70ml至100ml的量加入果胶酶，允许淀粉降解在48℃至55℃下持续30分钟。随后，为了维持浊度和颜色以及达到适于施用的粘度，以每10,000升石榴汁900g的量加入膨润土，随后在48℃至55℃下搅拌下10分钟。接着，在1.5mm和1mm真空过滤后，通过加热进行浓缩(按先后顺序，在80℃和475毫巴下高达12白利糖度(brix)，在87℃和626毫巴下高达17白利糖度，在95℃和847毫巴下高达31白利糖度，在70℃和312毫巴下高达43白利糖度，在49℃和118毫巴下高达65白利糖度)，并且再次进行1.5mm过滤以制备含有1.8mg/g至3.2mg/g鞣花酸的石榴提取物。将该石榴提取物进行无菌填充并单独包装为10ml。将相同的过程重复进行六次。
<实施例2>评估石榴提取物中鞣花酸的含量
采用高效液相色谱法(HPLC)测量石榴提取物中的鞣花酸的含量。利用SP C18 UG120(4.6mm×50mm，5μm)柱，流动相为0.85％磷酸/水和甲醇(6∶4)和纯甲醇的混合物，以梯度洗脱方式，利用UV检测器在波长为370纳米处检测鞣花酸。结果，发现根据实施例1制备的石榴提取物中的鞣花酸的平均含量为1.8mg/g至3.2mg/g。
同时，采用上述方法评估三种市售产品、根据韩国专利No.10-1272602制备的石榴提取物以及根据实施例1制备的石榴提取物中的鞣花酸的含量，并且其结果示于表1中。对于每种产品，各自购买具有不同批号的六种样品并进行评估以确定鞣花酸的含量。
[表1]
在表1中，产品A是可以从Shadaab Co.得到的石榴提取物，产品B是可以从Pashapour Trading Co.得到的石榴提取物产品，以及产品C是可以从Noosh Iran Co.得到的石榴提取物产品。此外，No.10-1272602表示根据韩国专利No.10-1272602中描述的制备方法制备的石榴提取物。
如表1所示，可以看出，与其他市售产品以及根据韩国专利No.10-1272602的石榴提取物(含糖量：65白利糖度)相比，根据本公开内容的石榴提取物中的鞣花酸含量非常高。
特别地，当基于鞣花酸的含量比较时，以石榴提取物的形式施用相同量的鞣花酸，根据韩国专利No.10-1272602的石榴提取物的剂量约为本公开内容的石榴提取物剂量的两倍高。
<实施例3>评估石榴提取物中的总多酚
通过将样品溶解在蒸馏水中，进行超声提取，引起与显色剂反应，并用分光光度计测量来计算石榴提取物中的多酚含量。
精确计量10mg的鞣酸，并将其放入到100ml的容量瓶中，加入蒸馏水直至标线，并且用蒸馏水将该标准的未稀释溶液蒸馏至最佳浓度以制备标准溶液。受试溶液通过以下方法来制备：通过计量100mg的根据实施例1制备的石榴提取物，并将其放入到100ml的容量瓶中，引入蒸馏水至标线，接着进行超声处理以使其溶解。将7.5ml的蒸馏水倒入试管后，并将1ml的各标准溶液和受试溶液倒入相同的试管中，按先后顺序确定地加入0.5ml的Folin-denis试剂和1ml的35％的碳酸钠溶液并使其彼此 混合，且在黑暗中放置一小时后，使用紫外/可见分光光度计在760nm处测定吸光度。利用标准物质在每个浓度的吸光度与每个空白试验的吸光度之间的差来绘制标准物质的校正曲线，并通过应用校正曲线，根据实施例1制备的石榴提取物的吸光度与根据实施例1制备的石榴提取物的空白试验地吸光度之间的差，计算样品中的总多酚含量。
总多酚含量(mg/g)＝(A×B×C)/D
A：受试溶液的总量(ml)
B：稀释因子
C：受试溶液中的总多酚浓度(mg/ml)
D：试样量(g或ml)
以与上述的方法相同的方式评估根据韩国专利No.10-1272602制备的石榴提取物中的总多酚含量。
评估结果示于表2中。
[表2]
(单位：mg/g) No.10-1272602 本发明提取物 样品No.1 11.79 12.59 样品No.2 10.59 12.67 样品No.3 12.35 11.72 样品No.4 12.89 13.21 样品No.5 13.12 11.03 样品No.6 11.02 10.89 总多酚的平均值 11.96±1.01 12.01±0.94
如表2所示，发现本公开内容的石榴提取物中的总多酚含量与根据韩国专利No.10-1272602制备的石榴提取物中的总多酚含量相似。
通过这些结果与表1中的鞣花酸含量结果的结合，具有高含量鞣花酸(在本公开内容的石榴提取物中鞣花酸的含量高达1.80mg/g至3.20mg/g)的石榴提取物的作用不仅仅是由石榴提取物更大量的浓度造成的。
<实施例4>绝经期症状和更年期症状缓解程度的评估
通过以下方法评估根据本公开内容的具有高含量鞣花酸的石榴果肉提取物缓解妇女的绝经期症状的程度。
受试者
对于筛选试验，从40-60岁，有12个月或以上闭经并且FSH值小于或等于40mlU/ml以及Kupperman指数高于或等于20的妇女中公开地选择志愿者，将测试的细节进行了通知，并在被充分理解后，志愿者们确定参加测试并作出了书面同意以遵循指示，并且然后进行测试。
在施用测试提取物一周之前，记录志愿者的基本信息，例如人口统计资料和过去的病史，并在营养条件、外皮/粘膜系统、耳鼻喉科系统、心血管系统、泌尿生殖系统、呼吸系统后、代谢/内分泌系统、消化系统、肌肉骨骼系统、神经/精神系统以及其他身体条件被医学检查后，将正常和不正常的结果记录下来。
根据Kupperman测试的一般排除标准，将排除下面的受试者：遭受心因性绝经期障碍的受试者；在测试前至少6个月经历激素替代治疗或在测试时正在接受激素替代治疗的受试者；在过去的12个月内经过双侧卵巢切除术或子宫切除术后闭经的受试者；遭受心脏疾病(例如，心力衰竭，心绞痛和心肌梗塞)的受试者；遭受无法控制的高血压的受试者；遭受恶性肿瘤、窄角型青光眼或肺部疾病的受试者；以及患有严重的肾或肝功能障碍的受试者。
测试方法
测试总共进行8周。总共60位受试者分为对照组(纯化水中含6.5g低聚果糖、1g果糖、0.4g紫甘蓝色素、0.5g柠檬酸以及0.1g的石榴香料)和根据本公开内容的石榴提取物的实验组(1.8mg/g至3.2mg/g的鞣花酸)(每组30名受试者)。
完成基线测试后，将总共60位受试者随机分为实验组和对照组。首先，向所有的受试者提供4周量的测试产品。实验组被要求按日剂量10ml/天服用石榴提取物。施用4周后，志愿者被教导存储和返还施用后的小袋，以确认它们是否准确地施用，并检查了志愿者的生命体征、不良事件以及伴随药物，以及进行了实验室检查(下表中示出“第二次访视”的测试结果)。其次，向所有的受试者提供4周量的受试产品。实验组被要求以日剂量10ml/天服用石榴提取物。同样，经过4周后进行检查(下表中示出“第三次访视”的测试结果)。
Kupperman指数、更年期评分量表(menopause rating scale，MRS)、FSH和雌二醇(E2)的结果与评估
对于第一次有效性评估，检查了通常用来评估绝经期症状和更年期症状的Kupperman指数。施用之前和之后，调查员立即直接检查受试者，共同地评估对于Kupperman指数参数症状的发生、强度和频率，并将得分记录在问卷上，并通过此，评估了根据本公开内容的具有高含量鞣花酸的石榴提取物的作用。
对于第二次有效性评估，对MRS、FSH和雌二醇(E2)的方差进行了检查。
在施用前/后以及每次访视进行了有效性评估，并通过独立的t检验分析了同质性测试，在显著性水平为5％或更低时通过独立的t检验分析了施用前/后的效应测试，并且作为同质性测试的结果，将不相等的方差调整为协变量，并使用协方差分析(ANCOVA)进行分析。此外，在显著性水平为5％或更低时利用重复测量方差分析(repeated measures ANOVA，RMANOVA)分析每次访视的效应测试，并作为同质性测试的结果，利用重复测量ANOVA(RM ANOVA)分析不相等的方差。
[表3]
值以平均±SD或数字显示
1)对于重复测量数据通过线性混合模型分析
[表4]
值以平均±SD或数字显示
1)通过成对t检验分析
2)通过独立样本t检验(independent t-test)分析
[表5]
值以平均±SD或数字显示
1)对于重复测量数据通过线性混合模型分析
2)通过重复测量ANOVA分析
[表6]
值以平均±SD或数显示
1)通过成对t检验分析
2)通过独立样本t检验分析
如表3-6的结果所示，根据本公开内容的具有高含量鞣花酸的石榴果肉提取物对绝经期症状的缓解作用远好于对照组。
更具体地，如表3-4所示，可以看出，经过8周后受试者的Kupperman指数减小了50％或更多。此外，如表5-6所示，可以看出，经过8周后， MRS也显著地降低，且FSH和雌二醇浓度也显著地降低。
<对比例1>与韩国专利No.10-1272602的石榴提取物的比较
根据韩国专利No.10-1272602中描述的方法制备了石榴提取物(糖含量：65白利糖度，鞣花酸：0.80～1.40mg/g)，将其用作实验组，按照如实施例3所描述的相同方法进行Kupperman指数评估，石榴提取物的摄取按照日剂量40ml/天。
经过8周后，评估摄取石榴提取物之前和之后的总Kupperman指数得分的变化，结果发现KI(总得分)为约15.08。
结果，发现在施用根据实施例1的石榴提取物和韩国专利No.10-1272602的石榴提取物之后相同的时间所评估的Kupperman指数显示相似的水平，但是当考虑到根据实施例1的石榴提取物的日剂量为10ml/天，而韩国专利No.10-1272602的石榴提取物的日剂量为40ml/天，则需要每日施用四倍量的石榴提取物以达到同等水平的绝经期症状缓解作用。
将实施例3和对比例1的结果与表2相结合显示了多酚含量的评估结果，由于本公开内容的石榴提取物和根据韩国专利No.10-1272602制备的石榴提取物包含相似重量的多酚，当根据韩国专利No.10-1272602制备的石榴提取物以40ml/天的剂量施用时，与本公开内容的石榴提取物以10ml/天的剂量施用相同的时间相比，为了达到同等水平的绝经期症状缓解作用而一起施用的多酚总量约为四倍。结果，与包括韩国专利No.10-1272602的石榴提取物在内的现有石榴提取物相比，为了达到同等水平的绝经期症状缓解作用，根据本公开内容的石榴提取物可从较低剂量的施用实现同等的作用，进而，包含在石榴提取物中的多酚的摄取降低，因此发现该石榴提取物可施用于对多酚敏感的个体。
本发明的实施方式
在下文中，应当理解的是，本公开内容的范围不应理解为仅限于以下的描述。
本公开内容涉及用于缓解妇女的绝经期症状的健康功能食品，其包含作为有效成分的石榴提取物，所述石榴提取物中每克石榴提取物总重量含 有1.8mg至3.2mg鞣花酸。
本公开内容涉及用于缓解妇女的绝经期症状的健康功能食品，其包含作为有效成分的石榴提取物，所述石榴提取物中每克石榴提取物总重量含有1.8mg至3.2mg鞣花酸，其中该石榴提取物的最大总日剂量小于或等于15ml。
更具体地，该健康功能食品可以按照以下任一石榴提取物单剂量分装在单个容器中：15ml、14ml、13ml、12ml、11ml、10ml、5ml、4ml、3ml、2ml和1ml。
石榴可以来自于土耳其、美国或者是其混合物。
该健康功能食品可以施用于对多酚类物质敏感的个体。
石榴提取物可以是石榴果肉的提取物。
该石榴提取物可每克石榴提取物总重量含有10mg至14mg多酚。
本公开内容提供了每克石榴提取物总重量含有1.8mg至3.2mg鞣花酸的石榴提取物的制备方法，该方法包括以下步骤：
S1)将来自于土耳其的石榴、来自美国的石榴，或其混合物去皮和去籽以仅得到石榴果肉；
S2)将该石榴果肉在100℃至105℃下灭菌50秒至80秒，并冷却到48℃至55℃；
S3)用淀粉降解酶在48℃至55℃下处理经冷却的石榴果肉；以及
S4)将该经压碎的石榴果肉按先后顺序在70℃至100℃和400毫巴至850毫巴的高温和高压下加热浓缩至少两次，以及在40℃至80℃和100毫巴至350毫巴的低温和低压下加热浓缩至少一次。
更具体地，所述制备方法还可以包括以下至少一项时进行过滤：在S1之后但在S2之前、在S3之后但在S4之前、以及在S4S1之后。
该石榴提取物可以施用于对多酚类物质敏感的个体。
S4可以包括在400毫巴至550毫巴和70℃至85℃下加热浓缩，在550毫巴至750毫巴和85℃至92℃下加热浓缩，在750毫巴至850毫巴和92℃至100℃下加热浓缩，在250毫巴至350毫巴和60℃至80℃下加热浓缩，以及在100毫巴至250毫巴在40℃至60℃下加热浓缩。
石榴提取物可每克石榴提取物总重量含有10mg至14mg多酚。
此外，本公开内容涉及用于缓解妇女的绝经期症状的健康功能食品，其包含作为有效成分的由上述制备方法制备的石榴提取物，其中该石榴提取物的最大总日剂量小于或等于15ml。
此外，本公开内容涉及用于缓解妇女绝经期症状的药物组合物，其包含作为有效成分的石榴提取物，所述石榴提取物中每克石榴提取物总重量含有1.8mg至3.2mg鞣花酸。
此外，本公开内容涉及用于缓解妇女的绝经期症状的药物组合物，其包含作为有效成分的石榴提取物，所述石榴提取物中每克石榴提取物总重量含有1.8mg至3.2mg鞣花酸，其中该石榴提取物的最大总日剂量小于或等于15ml。
工业实用性
根据本公开内容，预期在即使低日剂量的摄取时对缓解妇女的绝经期症状的优异作用，因此使得能够施用于对多酚类物质敏感的个体。