相关申请的交叉引用
本申请要求2014年8月8日提交的美国临时专利申请第62/035,191号的权益，该公开的全部内容明确引入本文以供参考。
联合研究协议声明
联合研究协议的各方——加州大学评议会(The Regents of the University of California)和日本Zoki药物有限公司(Nippon Zoki Pharmaceutical Co.,Ltd.)开发了本文公开的主题并做出了要求保护的发明，或者代表其利益，该协议在要求保护的发明的有效申请日或其之前有效；并且作为联合研究协议范围内进行的活动的结果做出要求保护的发明。
技术领域
本发明涉及来自以牛痘病毒接种的炎性组织的提取物(以下也称为“本发明提取物”)的新药物用途，或者本发明提取物的新治疗方法。更具体地，本发明涉及使用本发明提取物通过在肝脏中抑制核因子-κB(NF-κB)活化、通过抑制NF-κB靶基因的表达、通过抑制c-jun N末端激酶(JNK)活化、通过抑制肝细胞凋亡、通过抑制半胱天冬酶活化和/或通过抑制脂肪蓄积的肝脏的保护方法，或者涉及其中本发明提取物作为活性成分的肝脏保护剂。
背景技术
慢性肝病在世界上是常见的死因。慢性肝病包括慢性乙型和丙型肝炎、药物性肝炎、酒精性肝病和自身免疫性肝炎。
在肝脏炎症中，观察到炎症细胞因子比如白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的过度产生。IL-1β与IL-1受体的结合诱导c-Jun-NH2-末端激酶(JNK)的活化。作为JNK活化的结果，转录因子AP-1被活化，其诱导炎症应答。平行地，作为转录因子NF-κB抑制剂的κB抑制剂(IκB)被降解，并且包含亚基p65和p50的NF-κB被活化。结果，在肝细胞中诱导炎症基因如白细胞介素-6(IL-6)和氮氧化物合成酶2(NOS2)的转录。另一方面，TNF-α结合三聚的TNF受体，从而活化JNK和NF-κB。半胱天冬酶是一组半胱氨酸蛋白酶，其将引起细胞凋亡的信号活化。已知肝细胞凋亡是由JNK活化通过TNF-α以及半胱天冬酶依赖性细胞凋亡通路介导的。
脂肪肝是后续肝炎的初步疾病。在脂肪肝中，主要包含中性脂肪的过量脂质在肝细胞中蓄积。脂肪肝的原因是多样的，包括营养过剩、肥胖、过度酒精摄入、糖尿病、静脉输入营养液、一些药物制剂、营养不良和怀孕。即使在不饮酒的人中，也可能从单纯性脂肪肝发展成肝炎，称为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。据报道，美国30％至40％的人口、甚至在日本也有14％的人口患有非酒精性脂肪性肝病，他们中10％至20％发展成NASH。NASH是一种进行性肝脏疾病，具有肝硬化、肝功能不全和肝癌的风险。目前，超过15％的接受肝移植的患者具有与NASH相关的肝硬化。在美国，预期在2020年左右，NASH将成为肝脏转染的第一个适应症。最近，提出了IL-1β和TNF-α参与肝脏中脂肪的蓄积。
目前，干扰素是用于治疗肝病、主要是用于病毒性肝炎的药物。尽管干扰素可以减少肝炎病毒的负担，但并不是对所有患有病毒性肝炎的患者总是有效的，并且治疗的成本极高。此外，已经报道了许多不良反应，比如精神障碍、血小板减少和白细胞减少、在给药中止后反弹以及间质性肺炎。为了改善肝功能，也使用甘草甜素(glycyrrhizin)和中草药，但在许多情况下没有明显的疗效。因此，需要开发副作用更小的肝脏保护方法或药剂以治疗肝脏疾病或预防从脂肪肝进展为肝病。
本发明人已经发现，本发明提取物通过抑制NF-κB活化、通过抑制NF-κB靶基因的表达、通过抑制JNK活化、通过抑制肝细胞凋亡、通过抑制半胱天冬酶活化和/或抑制脂肪蓄积等对肝脏具有保护作用。关于本发明提取物对肝脏的作用，对于由四氯化碳诱导产生肝硬化的保护作用和由3’-甲基-二乙基氨基偶氮苯诱导产生恶性肝脏肿瘤的保护作用，在专利文献1和非专利文献1中公开。然而，其中没有公开的事实是，本发明提取物表现出NF-κB活化等的抑制或凋亡的抑制以及脂肪在肝脏中蓄积的抑制作用。
[现有技术文献]
[专利文献]
[专利文献1]第55/87724号日本专利公开(5和6页)
[非专利文献]
[非专利文献1]Kanzo，24(10)，55-60页(1983)
发明内容
发明解决的问题
本发明提供一种肝脏的保护方法，其包括将本发明提取物施用于需要治疗的患者，并且还提供包含本发明提取物作为活性成分的肝脏保护剂等。
附图说明
图1是通过GFP报告子检测本发明提取物对肝细胞中NF-κB活化的抑制活性的试验结果。
图2是通过NF-κB荧光素酶试验检测本发明提取物对肝细胞中NF-κB活化的抑制活性的试验结果。
图3a、3b和3c是通过NF-κB荧光素酶试验检测本发明提取物对肝星状细胞中NF-κB活化的抑制活性的试验结果。
图4a、4b、4c和4d是通过蛋白质印迹检测本发明提取物对肝细胞中IκBα降解和p65活化的抑制活性的试验结果。
图5a、5b、5c、5d、5e、5f、5g、5h、5i、5j、5k和5l是检测本发明提取物对肝细胞中NF-κB靶基因的mRNA表达和蛋白表达的抑制活性的试验结果。
图6a和6b是检测本发明提取物对肝细胞中JNK活化的抑制活性的试验结果。
图7是检测本发明提取物对肝细胞凋亡的抑制活性的试验结果。
图8是检测本发明提取物对肝细胞中半胱天冬酶活化的抑制活性的试验结果。
图9a、9b、9c和9d是检测本发明提取物对肝细胞中脂肪蓄积的抑制活性的试验结果。
具体实施方式
本发明提取物是包含从接种痘苗病毒的兔的发炎皮肤中提取和分离的非蛋白质活性物质的提取物。尽管本发明提取物在提取状态下是液体，但是也可能通过干燥制成固体。包含本发明提取物作为活性成分的制剂作为药物是非常有用的。在这种情况下，由于本发明提取物是本发明制剂的有效成分，因此本发明提取物是本发明制剂的原料药。在申请人制造和分装的本发明制剂的特定产品中，存在“包含接种痘苗病毒的兔的发炎皮肤的提取物的制剂”(商品名：NEUROTROPIN(神经妥乐平)[注册商标])。在这种制剂中，有注射剂和片剂，都属于处方药。
NEUROTROPIN注射剂的适应症是“下背痛、颈臂综合症、症状性神经痛、伴随皮肤疾病(湿疹、皮炎、荨麻疹)的瘙痒、过敏性鼻炎和亚急性脊髓视神经病(SMON)的后遗症比如感冒、感觉异常和疼痛”。NEUROTROPIN片剂的适应症是“带状疱疹后遗神经痛、下背痛、颈臂综合症、肩周炎和骨关节炎”。申请人已经创制并开发NTP制剂作为药物。NTP制剂已由于其在功效和安全性上的优异优势受到赞赏，已经销售多年，并已经在日本制药市场中确立了稳固的地位。
本发明来自接种痘苗病毒的炎性组织的提取物可以通过如下方法获得：将通过痘苗病毒接种而发炎的炎症组织粉碎；加入提取溶剂；从中去除组织碎片；然后进行除蛋白除蛋白；将除蛋白除蛋白的溶液吸附到吸附剂上；然后洗脱活性成分。例如，本发明提取物可以通过以下方式制备：将接种痘苗病毒的兔的发炎的皮肤收集、粉碎，并通过向其中加入提取溶剂进行处理，从中除去组织碎片，进行去除蛋白质的处理(除蛋白除蛋白作用)，将所得物在酸性条件下用吸附剂吸附，然后在碱性条件下从中洗脱活性成分。
对于通过接种痘苗病毒获得炎性组织的动物，可以使用感染痘苗病毒的各种动物，比如兔、牛、马、绵羊、山羊、猴、大鼠或小鼠，优选的炎性组织是兔的发炎皮肤。
关于兔子，可以使用任何兔子，只要它属于兔类(Lagomorpha)。其实例包括穴兔(Oryctolagus cuniculus)、家兔(驯养的穴兔)、野兔(日本野兔)、鼠兔(mouse hare)和雪鞋兔(snowshoe hare)。其中，适合使用家兔。在日本，有一种被称为“加藤(Kato)”的家兔，它自从很久以前就已经被养殖，并且经常用作家畜或实验动物，它是家兔的另一个名字。家兔中有许多品种，并且有利地使用称为日本白和新西兰白的品种。
本文使用的痘苗病毒可以在任何菌株中。其实例包括Lister菌株、Dairen菌株、Ikeda菌株、EM-63菌株和纽约市卫生局(New York City Board of Health)菌株。
对于本发明提取物的基本提取步骤，例如使用以下步骤。
关于(A)：
收集通过皮内接种痘苗病毒的兔的发炎皮肤。收集的皮肤用苯酚溶液等洗涤和消毒。将发炎的皮肤粉碎，并向其中加入1至5倍体积的提取溶剂。这里，术语“粉碎”是指使用绞碎机等精细地分解成碎肉。对于提取溶剂，可以使用蒸馏水、生理盐水、弱酸性至弱碱性缓冲液等，并且可以向其中适当加入杀菌/防腐剂比如苯酚，稳定剂比如甘油，盐比如氯化钠、氯化钾或氯化镁，等等。此时，还可能通过比如冷冻/熔化、超声波，细胞膜溶解酶或表面活性剂的处理来破坏细胞组织，以使提取更容易。将所得悬浮液静置5至12天。在该期间，可以在具有或不具有适当的搅拌下将悬浮液加热至30至45℃。将所得液体过滤或离心以除去组织碎片，随之获得粗提取物(滤液或上清液)。
关于(B)
对(A)中得到的粗提取物进行除蛋白除蛋白处理。除蛋白除蛋白作用可以通过通常进行的已知方法来实施，并且可以应用比如热处理、蛋白质变性剂(比如酸、碱、脲、胍或包含丙酮的有机溶剂)处理、等电沉淀或盐析的方法。然后，进行除去不溶物质的常用方法，比如使用滤纸(比如纤维素或硝化纤维素)、玻璃过滤器、Celite或Seitz过滤器的过滤、超滤或离心，以得到从中除去不溶物蛋白质的滤液或上清液。
关于(C)
将(B)中获得的滤液或上清液调节至酸性，或优选调节至pH 3.5至5.5，以进行用吸附剂吸附的操作。可用的吸附剂的实例包括活性炭和高岭土。将吸附剂加入到提取物中，然后搅拌，或者使提取物通过填充有吸附剂的柱，使得活性成分可以被吸附剂吸附。当向提取物中加入吸附剂时，可以通过过滤、离心等手段获得吸附有活性成分的吸附剂，以除去溶液。
关于(D)
为了从(C)中获得的吸附剂中洗脱(解吸)活性成分，向所述吸附剂中加入洗脱溶剂并调节至碱性或者优选pH为9至12，在室温或适当加热或搅拌下进行洗脱，然后通过常用方法比如过滤或离心来除去吸附剂。因此对于使用的提取溶剂，可以使用调节至碱性pH的碱性溶剂如水、甲醇、乙醇、异丙醇等或其适当的混合溶剂，并且优选使用调节至pH为9至12的水。提取溶剂的量可以适当设定。为了使用如此得到的洗脱液作为原料药，将其pH适当调节至接近中性等，由此可以最终获得接种痘苗病毒的兔的发炎皮肤提取物(本发明提取物)。
由于本发明提取物在制备阶段是液体，所以也可能将所述提取物适当浓缩或稀释以制成所需浓度。当从本发明提取物制造制剂时，优选通过加热进行灭菌处理。为了制成注射制剂，可能加入氯化钠等，以便制备与生理盐水等渗的溶液。也可能将液体状态的本发明提取物进行适当的操作，比如浓缩至干燥，由此制造用于口服给药的固体制剂比如片剂。从本发明提取物制造口服给药的固体制剂的具体方法公开在日本专利第3,818,657号和第4,883,798号的说明书中。本发明制剂包括如此制备的注射剂、口服给药的固体制剂等。
将药物有效量的来自接种痘苗病毒的炎性组织的提取物对需要治疗的患者的给药方法的实例包括口服和其它给药方式，比如皮下、肌肉内和静脉内给药。剂量可以根据接种痘苗病毒的炎性组织的提取物的种类适当确定。根据“Drugs in Japan，Ethical Drugs”(第2978页)，市售制剂中批准的剂量主要是通过口服给药每天16NU和通过注射每天3.6-7.2NU。然而，根据疾病的类型、严重程度、患者的个体差异、给药方法、给药周期等可以适当地增加或减少剂量(NU：NEUROTROPIN单位。NEUROTROPIN单位由通过改进的Randall-Selitto方法使用SART应激小鼠所测量的镇痛作用的ED50值所定义，所述SART应激小鼠是慢性应激动物，其显示出比正常动物更低的疼痛阈值。一个NU表示当ED50值为100mg/kg制剂时，在NEUROTROPIN制剂中1mg镇痛成分的活性)。
以下，将显示本发明提取物的制造方法的实施例，以及关于通过本发明提取物的新药理作用比如抑制NF-κB活化、抑制NF-κB靶基因的表达、抑制JNK活化、抑制肝细胞凋亡、抑制半胱天冬酶活化和抑制脂肪蓄积，对肝脏保护作用的药理试验结果，尽管本发明决不受这些实施例的描述的限制。
实施例
实施例1(本发明提取物的制造)
将健康成年兔的皮肤经皮内接种痘苗病毒，切割并收集发炎的皮肤。将收集的皮肤通过苯酚溶液洗涤和消毒，除去过量的苯酚溶液，并将残余物粉碎。向其中加入苯酚溶液并与之混合，将混合物放置3至7天，在搅拌的同时在35～40℃进一步加热3至4天。之后，将通过固液分离得到的提取液用盐酸调节至pH为4.5至5.2，在90～100℃加热30分钟，过滤除去蛋白质。将滤液用氢氧化钠调节至pH为9.0至9.5，在90～100℃加热15分钟并进行固液分离。
将所得的除蛋白除蛋白溶液用盐酸调节至pH为4.0～4.3，向其中加入相对于除蛋白质溶液的质量为2％的活性炭，将混合物搅拌2小时并进行固液分离。向收集的活性炭中加入水，用氢氧化钠调节至pH为9.5～10，将混合物在60℃搅拌90至100分钟，离心，得到上清液。再次向离心后沉淀的活性炭中加水，用氢氧化钠调节至pH为10.5～11，将混合物在60℃搅拌90至100分钟，离心，得到上清液。将两种上清液合并，并用盐酸中和，得到本发明提取物。
实施例2(试验方法)
现在，将示出药理学试验的实施例，其显示使用上述实施例1中制备的本发明提取物作为试验药物，在肝细胞中抑制NF-κB活化、抑制JNK活化、抑制NF-κB靶基因的表达、抑制半胱天冬酶活化、抑制NF-κB活化、抑制细胞凋亡和抑制脂肪蓄积的作用活性。
1)小鼠、试剂和细胞
野生型C57BL/6小鼠购自Jackson Laboratory(Bar Harbor)。本研究中使用的NF-κB报告子转基因小鼠在NF-κB启动子的控制下表达绿色荧光蛋白(GFP)。通过原位胶原酶灌注法从野生型C57BL/6小鼠和NF-κB报告子GFP转基因小鼠中分离原代培养肝细胞。将具有90％或更高存活率的细胞用于实验。在肝细胞孵育2小时后，将含有10％FBS的M199培养基更换为无血清M199培养基或1％FBS M199培养基，过夜培养。之后进行以下处理。在整个实验中，M199培养基用于培养肝细胞。
2)通过GFP报告子测量NF-κB活性
在过夜血清饥饿后，分离自NF-κB报告子GFP转基因小鼠的原代培养肝细胞首先用NTP(0、0.01、0.1、0.2或0.4NU/mL)处理1小时、6小时或24小时。然后将细胞在存在或不存在10ng/mL重组IL-1β(R&D Systems)的情况下处理6小时。然后在荧光显微镜下测量肝细胞的GFP的荧光信号强度。至于数据，对每个进行3个复孔测量，并测定平均值和标准误差。
3)通过NF-κB荧光素酶试验测量NF-κB的活性
在将培养基更换为1％FBS M199后，将野生型原代培养肝细胞或肝星状细胞在moi(感染重数)为10下以腺病毒NF-κB-荧光素酶报告子感染16小时。在用2ng/mL IL-1β、2ng/mL TNF-α(R&D Systems)或10ng/mL脂多糖(LPS)刺激执行，用本发明提取物(0.2NU/mL)处理细胞1小时。在用IL-1β、TNF-α或LPS处理8小时后进行荧光素酶试验。将荧光素酶活性归一化至每个孔中的肝细胞的蛋白质浓度。至于数据，对每个进行3个复孔测量，并测定平均值和标准误差。
4)实时定量PCR
在用IL-1β或TNF-α刺激之前，首先用本发明提取物(0.2NU/mL)处理原代培养肝细胞1小时。在用IL-1β或TNF-α刺激后2或6小时之后，随后通过经过总RNA逆转录为cDNA使用TRIZOL(Life Technologies)提取总RNA，随后将。随后使用CFX96实时PCR系统(Bio-Rad)对cDNA进行实时定量PCR。至于数据，对每个进行3个复孔测量，并测定平均值和标准误差。
5)蛋白质印迹
将蛋白质提取物进行电泳，印迹，然后使其与针对IκBα、磷酸化的p65、p65、磷酸化的JNK(Cell Signaling)、JNK(Santa Cruz Biotechnology)或β-肌动蛋白(Sigma-Aldrich)的抗体反应，并用辣根过氧化物酶(HRP)结合的次级抗体处理以产生颜色。至于数据，对每个进行3个复孔测量，并测定平均值和标准误差。
6)凋亡的测量
细胞贴壁后，将肝细胞无血清孵育16小时。首先，将本发明提取物(0.2NU/mL)预处理1小时。然后将细胞用放线菌素D(200ng/mL，Sigma-Aldrich)和IL-1β(2ng/mL)或放线菌素D和TNF-α(2ng/mL)处理16小时以上。使用TUNEL染色试剂盒(Roche)检查凋亡。在10倍视野(×100)中对TUNEL阳性细胞进行计数。至于数据，对每个进行3个复孔测量，并测定平均值和标准误差。
7)脂肪蓄积的测定
将IL-1β(10ng/mL)或棕榈酸(200μM)加入用本发明提取物(0.01、0.1或0.2NU/mL)处理的原代培养肝细胞中，24小时后肝细胞中的脂肪蓄积通过用Oil Red O染色的手段评价。
8)统计学分析
使用双尾不成对Student氏t检验比较两组之间的差异。使用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较多个组之间的差异。使用GraphPad Prism 4.02(GraphPad Software)进行分析。当p值小于0.05时，认为是显著的。实验进行至少三次，并且由于获得相似的结果，提供代表性数据。
实施例3(试验结果)
1)通过GFP报告子测量NF-κB的活性
在用IL-1β处理前1小时，用0.01、0.1或0.2NU/mL的本发明提取物进行处理，由此显著抑制由IL-1β诱导的NF-κB活化。结果的一个例子示于图1中。
2)通过NF-κB荧光素酶试验测量肝细胞中NF-κB的活性
在用IL-1β处理前1小时，用0.2NU/mL的本发明提取物进行处理，由此显著抑制由IL-1β诱导的NF-κB活化。结果的一个例子示于图2中。
3)通过NF-κB荧光素酶试验测定肝星状细胞中NF-κB的活性
在用IL-1β、TNF-α或LPS处理之前1小时，用0.4NU/mL的本发明提取物进行处理，由此显著抑制肝星状细胞中由IL-1β、TNF-α或LPS诱导的NF-κB活化。结果的一个例子示于图3a、3b和3c中。
NF-κB活化的抑制，特别是在肝星状细胞中的抑制是预防、治疗和抑制肝纤维化进展的效果。
4)通过蛋白质印迹测量IκBα的降解和p65的活性
作为用IL-1β或TNF-α处理的结果，快速诱导了抑制NF-κB的核易位的IκBα的降解。作为用本发明提取物处理的结果，通过用IL-1β或TNF-α处理延迟了IκBα的降解。此外，作为用提取物处理的结果，减弱了NF-κB亚基p65的磷酸化。结果的一个例子示于图4a、4b、4c和4d中。
5)通过实时定量PCR和ELISA测量NF-κB靶基因的表达
IL-1β处理诱导IL-6、NOS2、CCL5、CXCL1和CXCL2的mRNA表达和CXCL1蛋白产生的增加。用本发明提取物的处理显著降低了IL-1β处理的肝细胞中的IL-6、NOS2、CCL5、CXCL1和CXCL2的mRNA表达和CXCL1蛋白产生的增加。此外，TNF-α处理诱导IL-6、NOS2、CCL-5、CXCA1和CXCL2的mRNA表达和CXCL1蛋白产生的增加。用本发明提取物预处理显著抑制这些增加。结果的一个例子示于图5a、5b、5c、5d、5e、5f、5g、5h、5i、5j、5k和5l中。
6)通过蛋白质印迹测量JNK活性
当用IL-1β处理时，JNK在肝细胞中快速磷酸化。通过用本发明提取物处理，IL-1β诱导的JNK活化减少。此外，显著抑制IL-1β诱导的JNK的靶基因Junb的表达增加。类似地，TNF-α诱导肝细胞中JNK的快速活化，并且用本发明提取物的预处理抑制由TNF-α诱导的JNK的磷酸化。结果的一个例子示于图6a和6b中。
7)凋亡的测量
在用IL-1β和放线菌素D共同处理16小时后，显著诱导肝细胞凋亡。用本发明提取物的预处理减少了用IL-1β和放线菌素D共同处理诱导的凋亡。此外，用本发明提取物处理抑制了与IL-1β和放线菌素D诱导的凋亡相关的JNK活化。
类似地，在用TNF-α和放线菌素D共同处理16小时后，显著诱导肝细胞凋亡。用本发明提取物的处理显著减少了用TNF-α和放线菌素D共同处理诱导的肝细胞凋亡。此外，用本发明提取物处理显著抑制了与通过用TNF-α和放线菌素D共同处理的凋亡有关的JNK活化。结果的一个例子示于图7中。
8)活性形式的半胱天冬酶-3的表达的测量
在用IL-1β和放线菌素D共同处理8小时后，观察到活性形式的半胱天冬酶-3的表达增加。用本发明提取物的预处理抑制了活性形式的半胱天冬酶-3的表达增加。
类似地，在用TNF-α和放线菌素D共同处理8小时后，活性形式的半胱天冬酶-3的表达增加。用本发明提取物的处理抑制了活性形式的半胱天冬酶-3的表达的增加。结果的一个例子示于图8中。
9)脂肪蓄积的测量
在用IL-1β或棕榈酸处理24小时后，证实在肝细胞中的明显的脂肪蓄积。作为用本发明提取物处理的结果，显著抑制由IL-1β或棕榈酸诱导的脂肪蓄积。结果的一个例子示于图9a、9b、9c和9d中。
还表明，作为用本发明提取物处理的结果，激活了与抑制脂肪蓄积相关的AMP活化激酶。
考虑到上述情况，以下内容可以引入作为本发明，但不限于以下这些。
(1)一种肝脏的保护方法，其包括将接种痘苗病毒的炎性组织的提取物施用于需要它的患者。
(2)根据(1)所述的方法，其中肝脏的保护是通过预防、治疗或抑制慢性肝病进展的手段。
(3)根据(1)所述的方法，其中肝脏的保护是通过预防、治疗或抑制肝纤维化进展的手段。
(4)根据(3)所述的方法，其中预防、治疗或抑制肝纤维化的进展是通过抑制肝星状细胞的活化的手段。
(5)根据(1)所述的方法，其中肝脏的保护是通过预防或治疗脂肪肝或抑制肝病进展的手段。
(6)根据(1)至(5)中任一项所述的方法，其中肝脏的保护是通过抑制NF-κB活化的手段。
(7)根据(1)至(5)中任一项所述的方法，其中肝脏的保护是通过抑制JNK活化的手段。
(8)根据(1)至(5)中任一项所述的方法，其中肝脏的保护是通过抑制肝细胞凋亡的手段。
(9)根据(8)所述的方法，其中抑制肝细胞凋亡是通过抑制半胱天冬酶活化的手段。
(10)根据(1)至(5)中任一项所述的方法，其中肝脏的保护是通过抑制肝脏中的脂肪蓄积的手段。
(11)根据(1)至(5)中任一项所述的方法，其中待施用的接种痘苗病毒的炎性组织的提取物是接种痘苗病毒的兔的发炎皮肤的提取物。
(12)根据(11)所述的方法，其中施用是通过注射的手段。
(13)根据(11)所述的方法，其中施用是通过口服途径的手段。
(14)一种肝脏保护剂，其包含接种痘苗病毒的炎性组织的提取物作为有效成分。
(15)根据(14)所述的肝脏保护剂，其是慢性肝病的预防剂、治疗剂或进展抑制剂。
(16)根据(14)所述的肝脏保护剂，其是肝纤维化的预防剂、治疗剂或进展抑制剂。
(17)根据(16)所述的肝脏保护剂，其中预防、治疗或抑制肝纤维化的进展是通过抑制肝星状细胞活化的手段。
(18)根据(14)所述的肝脏保护剂，其是脂肪肝的预防剂或治疗剂或者是肝病的进展抑制剂。
(19)根据(14)至(18)中任一项所述的肝脏保护剂，其中肝脏的保护是通过抑制NF-κB活化的手段。
(20)根据(14)至(18)中任一项所述的肝脏保护剂，其中肝脏的保护是通过抑制JNK活化的手段。
(21)根据(14)至(18)中任一项所述的肝脏保护剂，其中肝脏的保护是通过抑制细胞凋亡的手段。
(22)根据(21)所述的肝脏保护剂，其中细胞凋亡的抑制是通过抑制半胱天冬酶活化的手段。
(23)根据(14)至(18)中任一项所述的肝脏保护剂，其中肝脏的保护是通过抑制肝脏中脂肪蓄积的手段。
(24)根据(14)至(18)中任一项所述的肝脏保护剂，其中炎性组织是兔的发炎的皮肤。
(25)根据(24)所述的肝脏保护剂，其为可注射制剂。
(26)根据(24)所述的肝脏保护剂，其为口服制剂。
(27)一种用于保护肝脏的接种痘苗病毒的炎性组织提取物。
(28)根据(27)所述的接种痘苗病毒的炎性组织提取物，其中肝脏的保护是通过预防、治疗或抑制慢性肝病进展的手段。
(29)根据(27)所述的接种痘苗病毒的炎性组织提取物，其中肝脏的保护是通过预防、治疗或抑制肝纤维化进展的手段。
(30)根据(29)所述的痘苗病毒接种炎性组织提取物，其中预防、治疗或抑制肝纤维化的进展是通过抑制肝星状细胞活化的手段。
(31)根据(27)所述的接种痘苗病毒的炎性组织提取物，其中肝脏的保护是通过预防、治疗脂肪肝或抑制肝脏疾病进展的手段。
(32)根据(27)至(31)中任一项所述的接种痘苗病毒的炎性组织的提取物，其中肝脏的保护是通过抑制NF-κB活化的手段。
(33)根据(27)至(31)中任一项所述的接种痘苗病毒的炎性组织提取物，其中肝脏的保护是通过抑制JNK活化的手段。
(34)根据(27)至(31)中任一项所述的接种痘苗病毒的炎性组织提取物，其中肝脏的保护是通过抑制肝细胞凋亡的手段。
(35)根据(34)所述的接种痘苗病毒的炎性组织提取物，其中肝细胞的抑制是通过抑制半胱天冬酶活化的手段。
(36)根据(27)至(31)中任一项所述的接种痘苗病毒的炎性组织提取物，其中肝脏的保护是通过抑制肝脏中脂肪蓄积的手段。
(37)根据(27)至(31)中任一项所述的接种痘苗病毒的炎性组织提取物，其中炎性组织是兔的发炎的皮肤。
(38)根据(37)所述的接种痘苗病毒的炎性组织提取物，其中施用是通过注射的手段。
(39)根据(37)所述的接种痘苗病毒的炎性组织提取物，其中施用是通过口服途径的手段。
(40)接种痘苗病毒的炎性组织的提取物在制造肝脏保护剂中的用途。
(41)根据(40)所述的用途，其中肝脏的保护是通过预防、治疗或抑制慢性肝脏疾病进展的手段。
(42)根据(40)所述的用途，其中肝脏的保护是通过预防、治疗或抑制肝纤维化的展的手段。
(43)根据(42)所述的用途，其中预防、治疗或抑制肝纤维化的进展是通过抑制肝星状细胞活化的手段。
(44)根据(40)所述的用途，其中肝脏的保护是通过预防或治疗脂肪肝或抑制肝脏疾病进展的手段。
(45)根据(40)至(44)中任一项所述的用途，其中肝脏的保护是通过抑制NF-κB活化的手段。
(46)根据(40)至(44)中任一项所述的用途，其中肝脏的保护是通过抑制JNK活化的手段。
(47)根据(40)至(44)中任一项所述的用途，其中肝脏的保护是通过抑制肝细胞凋亡的手段。
(48)根据(47)所述的用途，其中抑制肝细胞凋亡是通过抑制半胱天冬酶活化的手段。
(49)根据(40)至(44)中任一项所述的用途，其中肝脏的保护是通过抑制肝脏中脂肪蓄积的手段。
(50)根据(40)至(44)中任一项所述的用途，其中炎性组织是兔的发炎的皮肤。
(51)根据(50)所述的用途，其中施用是通过注射的手段。
(52)根据(50)所述的用途，其中施用是通过口服途径的手段。
工业实用性
如上所述，现在已经表明，本发明提取物对由IL-1β或TNF-α诱导的肝细胞中的NF-κB活化、NF-κB靶基因的表达、JNK活化、肝细胞凋亡等，表现出抑制或阻止作用，并且对脂肪蓄积表现出抑制作用。考虑到这些结果，现在认为本发明提取物的施用，对于认为其中NF-κB或JNK参与的慢性肝病、对于其中活化的肝星状细胞参与的肝纤维化、和/或对于脂肪肝向肝病的进展，能够是有效的预防或治疗方法。此外，包含本发明提取物的制剂已经使用多年，并被认为是一种具有很小的不良作用和高安全性的药物，因此它能够成为对慢性肝病和/或脂肪肝向肝病进展而言有用的预防剂或治疗剂。因此，本发明提供一种新型的肝脏的保护方法和一种新型的肝脏保护剂，由此本发明是非常有用的。