技术领域
本发明涉及包含源自红果山胡椒(Lindera erythrocarpa)的提取物、部分或化合物的皮肤增白组合物。更具体地，本发明涉及包含作为活性成分的来自红果山胡椒的乙醇提取物、来自所述乙醇提取物的溶剂部分或从所述乙醇提取物分离并纯化的化合物的皮肤增白组合物。
背景技术
大量的研究关注来自天然产物的生理活性化合物。植物资源被广泛地用于疾病的治疗及预防或作为健康辅助。例如，α-生育酚、维生素C、类胡萝卜素和类黄酮已作为天然的抗氧化剂。在宽范围的动物和植物中发现了具有抗氧化活性的化合物，特别是大量的研究来自植物。体内实验表明来自植物的次级代谢产物抑制或清除自由基和活性氧的产生，由此防止氧化诱导的细胞损伤。
迄今为止报道的大部分天然存在的抗氧化剂来自植物并且主要为多酚化合物。特别是，类黄酮具有阻止脂质氧化和氧化应激和清除活性氧的功能，由此阻止或延缓衰老、阻断癌症以及心脏病的发生或进展。由此，类黄酮已被用于各种领域，包括食品工业、制药工业和美容产品工业。此外，黑色素是在自然界普遍存在的聚合酚类色素，其见于包括动物、植物以及甚至微生物的大多数生物，并且作为保护机体对抗UV辐射的重要的防光物(photoprotectant)。
黑色素增强对抗UV辐射、干燥以及极端温度的生存能力，并且增强了咖啡、茶以及雪茄的质量。另一方面，过量黑色素的合成已知能导致机体雀斑和斑点的产生、促进皮肤衰老并且参与皮肤癌的发生。包括酪氨酸酶在内的多种酶调节黑色素的生物合成。在这些酶之中，酪氨酸酶负责生物合成早期之后二羟基吲哚的氧化，其中酪氨酸转化为L-多巴奎宁。在这一点上，寻找酪氨酸酶抑制剂的研究在皮肤增白剂的开发中占据重要的部分。目前开发的酪氨酸酶抑制剂包括氢醌、4-羟基苯甲醚、抗坏血酸衍生物、曲酸、壬二酸、皮质类固醇、类维生素A、熊果苷、儿茶素和3，4，5-三甲氧基肉桂酸麝香草酚酯。然而，因为它们的安全性以及经济效益的问题，难以使用它们。
红果山胡椒是属于樟科(Lauraceae family)的植物。全世界已知存在樟树的45个属和1500个种，并且在韩国存在6个属和12个种。在韩国，不论是雄性还是雌性的红果山胡椒，大多数在四月至五月开出浅黄色的花并且在九月结出大小约为8mm的红色果实。红果山胡椒为约5m高的落叶树并且原产于韩国南部、日本和中国的温暖地区。树的干燥果实具有特有的香味并且味苦，在日本已经将它们用作健胃药品和神经痛的镇痛药。据报道，红果山胡椒的叶以及果实的乙醇提取物和赤芝酮(lucidone)(一种环戊二酮)具有潜在的抗炎活性(Wang et al.，2008)。已知从红果山胡椒分离的环戊二酮化合物具有抗癌活性(Oh et al.，2005；第10-0658519号韩国专利)。
在全面考虑背景技术后，本发明人获得了原产于韩国济州岛的红果山胡椒的乙醇提取物及其后续溶剂部分和来自所述溶剂部分的环戊二酮化合物和环戊二酮衍生物，在B16F10小鼠黑色素瘤细胞和RAW264.7细胞中检测以上物质的抗氧化活性和对黑色素生物合成的抑制活性，并且最终发现以上物质可用作皮肤增白美容产品、食品以及药物组合物的功能活性物质，从而完成本发明。
公开内容
技术问题
因此，本发明的目的是提供包含作为活性成分的红果山胡椒的提取物、所述提取物的溶剂部分或从所述溶剂部分分离的环戊二酮化合物或衍生物的皮肤增白组合物。
技术方案
根据本发明的一方面，本发明提供了包含作为活性成分的红果山胡椒的提取物或所述提取物的溶剂部分的皮肤增白组合物。
在本发明中，用于从红果山胡椒中获得提取物的溶剂选自水、诸如甲醇或乙醇的低级醇及以上的组合，并且优选乙醇。根据本发明，从提取得到的提取物溶液、提取物溶液的稀释液或浓缩液、通过干燥提取物溶液获得的残余物、来自提取物溶液的粗纯化的物质和来自提取物溶液的纯化的物质全都落入提取物的范围内。
在本发明的实施方案中，可以如下制备来自红果山胡椒的提取物：用热风将红果山胡椒干燥、将干燥的红果山胡椒粉碎、于室温下将粉碎的红果山胡椒浸入70％的乙醇中三天并伴随搅拌以提供渗出物、将渗出物过滤并减压浓缩滤出液。
在本发明的实施方案中，可以如下制备来自红果山胡椒的提取物的溶剂部分：将来自红果山胡椒的提取物悬浮于蒸馏水中，并用来自于非极性溶剂的正己烷(n-Hex)、二氯甲烷(CH2Cl2)、乙酸乙酯(EtOAc)和正丁醇(n-BuOH)将悬浮液分成部分。
在本发明的一个实施方案中，如下制备来自红果山胡椒的提取物的每一溶剂部分：将红果山胡椒的乙醇提取物悬浮在蒸馏水中，使用分液漏斗、利用来自非极性溶剂的正己烷(n-Hex)、二氯甲烷(CH2Cl2)、乙酸乙酯(EtOAc)和正丁醇(n-BuOH)将提取物分成部分，过滤并将所得部分减压浓缩。
根据本发明的另一方面，本发明提供了包含作为活性成分的至少一种选自以下化学式1至10所表示的化合物中的化合物的皮肤增白组合物：
化学式1
化学式2
化学式3
化学式4
化学式5
化学式6
化学式7
化学式8
化学式9
化学式10
为了在本发明中使用，可以从红果山胡椒中分离并纯化以上化合物。或者，可以由市售产品获得除化合物10之外的所有上述化合物，或者可以通过公知的合成方法来合成它们。
根据本发明优选的实施方案，本发明的组合物为美容产品制剂。
除了来自红果山胡椒的提取物之外，提取物的溶剂部分或从提取物分离的化合物也用作活性成分，本发明的美容产品组合物可以包含常规的美容产品成分，例如常规的辅助物和载体，例如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、着色剂和芳香剂。以上美容产品组合物还可以包含用于增强活性成分的美容效果的皮肤吸收促进剂。
可以将本发明的美容产品组合物配制成本领域常用的任何制剂。例如，可以将其配制成溶液、悬浮液、乳液、糊剂、凝胶、乳膏、洗剂、粉、肥皂、含表面活性剂的清洁剂、油、粉底、粉底乳液、粉底蜡和喷雾剂，但不限于此。制剂的具体实例包括收敛洗液、营养洗液、营养霜、按摩霜、精华液、眼霜、清洁霜、清洁泡沫、清洁水、面膜、喷雾剂或粉。
当将本组合物被配制成糊剂、乳膏或凝胶时，可以将动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌用作载体。
当制剂为粉或喷雾剂的形式时，可以将乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末用作载体。特别地，在喷雾剂的情况下，还可以包含诸如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚的推进剂。
对于溶液或乳液形式的制剂，可以将溶剂、增溶剂或乳化剂用作载体。载体的实例包括：水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁基二醇油、甘油脂肪酯、聚乙二醇或山梨聚糖的脂肪酸酯。
对于悬浮液形式的制剂，载体可以包括诸如水、乙醇或丙二醇的液体稀释剂，诸如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯和聚氧乙烯山梨聚糖酯、微晶纤维素、氢氧化铝氧化物(aluminum methahydroxide)、膨润土、琼脂或黄蓍胶等的悬浮剂。
对于含表面活性剂的清洁剂形式的制剂，载体可以包括脂肪醇硫酸酯、脂肪醇醚硫酸酯、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑鎓衍生物、甲基牛磺酸盐、肌氨酸盐、脂肪酰胺醚硫酸酯、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等。
根据本发明的优选实施方案，本发明的组合物为药物制剂。
当配制为药物制剂时，本发明的组合物可以包含药学可接受的载体。本领域通常使用的药学可接受的载体可以包含在药物组合物中。组合物中使用的药学可接受的载体的实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，但不限于此。除了这些以外，本发明的药物组合物还可以包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂和/或防腐剂。
可以通过各种口服或肠胃外途径给予本发明的药物组合物，例如，口服给药或经皮给药。然而，优选通过由肠胃外途径给予药物组合物，特别是经皮给药，并且更优选通过局部施用。
根据包括剂型、给药方式、年龄、体重、性别、所治疗患者的疾病状况和饮食、给药时间、给药途径、排泄率和反应敏感性在内的多种因素，当将本发明药物组合物进行施用、喷雾或给药时，其合适的剂量会不同。当制成口服制剂时，可以将红果山胡椒的提取物、该提取物的溶剂部分或从该溶剂部分分离的化合物以5mg/kg至30mg/kg的成人每日剂量并且优选为10mg/kg的成人每日剂量进行每日单一剂量给药或分为多个剂量进行给药。对于成人的局部施用，可以以1.0ml至3.0ml的每日剂量进行单一剂量施用或可以分为多至五个剂量进行施用，持续施用至少一个月。
根据本领域技术人员公知的方法，本发明的药物组合物可以与药学可接受的载体和/或赋形剂一起配制为单位剂型或可以包含在多剂量包装中。在该背景下，药物组合物可以配制为诸如粉末、颗粒剂、片剂、胶囊、悬浮液、乳液、糖浆、气雾剂等的口服剂型，诸如软膏剂、乳膏等的局部剂型或任何药学适用的形式，并且还可以包含分散剂或稳定剂。
在本发明优选的实施方案中，本发明的组合物为食品制剂。
当制成食品制剂时，除作为活性成分的来自红果山胡椒的提取物、该提取物的部分或从该提取物分离的化合物之外，本发明的组合物包含制备食品通常添加的成分，例如蛋白质、碳水化合物、脂类、营养物、调味剂和食用香料。碳水化合物的实例包括诸如葡萄糖和果糖的单糖，诸如麦芽糖、蔗糖的二糖，寡糖，诸如糊精、环糊精等的多糖，和诸如木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等的糖醇。食用香料可以为天然的[奇异果甜蛋白(thaurmatin)、甜叶菊提取物(例如，甜叶菊甙A、甘草素等)]和合成的(糖精、阿斯巴甜等)。
根据本发明的其它方面，本发明提供以下化学式10所表示的化合物：
[化学式10]
在本发明中，能够从红果山胡椒中并且优选从红果山胡椒的树皮中分离化学式10的化合物。
根据本发明的其它方面，本发明提供从红果山胡椒中分离化学式10的化合物的方法。
[化学式10]
在优选的实施方案中，分离化学式10的化合物的方法可以包括以下步骤：
将红果山胡椒浸入溶剂中以提供来自红果山胡椒的提取物，所述溶剂选自水、C1至C4低级醇或其组合；
用己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和丁醇将所述红果山胡椒提取物分成部分，以提供分别的溶剂部分；
使用己烷和乙酸乙酯梯度作为洗脱液，将所述红果山胡椒溶剂部分进行初级硅胶柱层析，以提供层析部分；以及
使用己烷和乙酸乙酯的混合物作为洗脱液，将初级硅胶柱层析的部分通过次级硅胶柱层析进行纯化，以提供新的化学式10的聚甲氧基酚化合物。
在本发明的方法中，“红果山胡椒”是指红果山胡椒的树皮。
在本发明中，能够使用选自以下的溶剂获得红果山胡椒提取物：水、诸如甲醇或乙醇的C1至C4的低级醇、或以上的组合，或优选使用乙醇。在本发明中，提取物包括选自以下的任何一种：通过提取获得的提取物溶液、提取物溶液的稀释液或浓缩液、通过干燥提取物溶液获得的残余物、来自提取物溶液的粗纯化的物质或来自提取物溶液的纯化的物质。
根据本发明的实施方案，可以如下获得红果山胡椒提取物：用热风将红果山胡椒干燥、将干燥的红果山胡椒粉碎、于室温下将粉碎的红果山胡椒浸入70％的乙醇中三天并伴随搅拌以提供渗出物、将渗出物过滤并减压浓缩滤出液。
在本发明的实施方案中，可以如下制备红果山胡椒提取物的溶剂部分：将红果山胡椒提取物悬浮在蒸馏水中，用来自非极性溶剂的正己烷(n-Hex)、二氯甲烷(CH2Cl2)、乙酸乙酯(EtOAc)和正丁醇(n-BuOH)将悬浮液分成部分。
在本发明的实施方案中，可以如下制备红果山胡椒提取物的每一溶剂部分：将红果山胡椒的乙醇提取物悬浮在蒸馏水中，使用分液漏斗、利用来自非极性溶剂的正己烷(n-Hex)、二氯甲烷(CH2Cl2)、乙酸乙酯(EtOAc)和正丁醇(n-BuOH)将提取物分成部分，进行过滤和减压浓缩以提供分别的溶剂部分。
有益的效果
基于来自红果山胡椒的提取物、部分或化合物的皮肤增白组合物包含作为活性成分的环戊二酮或其衍生物，其表现出的对黑色素合成的抑制活性高于常规皮肤增白剂熊果苷。
附图说明
图1为示意性说明从红果山胡椒获得乙醇提取物及其溶剂部分的过程的流程图。
图2显示本发明的红果山胡椒乙醇提取物的HPLC分析数据。
图3显示源自红果山胡椒乙醇提取物的正己烷部分的HPLC分析数据。
图4显示源自红果山胡椒乙醇提取物的二氯甲烷部分的HPLC分析数据。
图5显示源自红果山胡椒乙醇提取物的乙酸乙酯部分的HPLC分析数据。
图6显示源自红果山胡椒乙醇提取物的正丁醇部分的HPLC分析数据。
图7显示源自红果山胡椒乙醇提取物的水部分的HPLC分析数据。
图8显示用于化合物1定量分析的HPLC数据。
图9显示化合物1的1H和13C-NMR谱。
图10显示用于化合物2定量分析的HPLC数据。
图11显示化合物2的1H和13C-NMR谱。
图12显示用于化合物3定量分析的HPLC数据。
图13显示化合物3的1H和13C-NMR谱。
图14显示用于化合物4定量分析的HPLC数据。
图15显示化合物4的1H和13C-NMR谱。
图16显示用于化合物5定量分析的HPLC数据。
图17显示化合物5的1H和13C-NMR谱。
图18显示用于化合物6定量分析的HPLC数据。
图19显示化合物6的1H和13C-NMR谱。
图20显示用于化合物7定量分析的HPLC数据。
图21显示化合物7的1H和13C-NMR谱。
图22显示用于化合物8定量分析的HPLC数据。
图23显示化合物8的1H和13C-NMR谱。
图24显示用于化合物9定量分析的HPLC数据。
图25显示化合物9的1H和13C-NMR谱。
图26为显示用红果山胡椒乙醇提取物及其溶剂部分处理的B16F10细胞的活力的图。数据为三次测量的平均值±标准差。
图27为显示红果山胡椒乙醇提取物及其溶剂部分对B16F10细胞中黑色素生成的抑制活性的图。数据为三次测量的平均值±标准差。
图28为显示红果山胡椒乙醇提取物及其溶剂部分对B16F10细胞中酪氨酸酶的抑制活性的图。数据为三次测量的平均值±标准差。
图29为显示用赤芝酮处理的B16F10细胞的活力的图。数据为三次测量的平均值±标准差。
图30为显示用乌药环戊烯二酮甲醚(methyllinderone)处理的B16F10细胞的活力的图。数据为三次测量的平均值±标准差。
图31为显示用红果山胡椒查耳酮(kanakugiol)处理的B16F10细胞的活力的图。数据为三次测量的平均值±标准差。
图32为显示赤芝酮对B16F10细胞中黑色素生成的抑制活性的图。数据为三次测量的平均值±标准差。
图33为显示乌药环戊烯二酮甲醚对B16F10细胞中黑色素生成的抑制活性的图。数据为三次测量的平均值±标准差。
图34为显示红果山胡椒查耳酮对B16F10细胞中黑色素生成的抑制活性的图。数据为三次测量的平均值±标准差。
图35为显示赤芝酮对B16F10细胞中酪氨酸酶的抑制活性的图。数据为三次测量的平均值±标准差。
图36为显示用从红果山胡椒分离的化学式10的化合物处理的B16F10细胞的活力的图。
图37为显示从红果山胡椒分离的化学式10的化合物对B16F10细胞中黑色素生成的抑制活性的图。
图38显示从红果山胡椒分离的化学式10的化合物对B16F10细胞中酪氨酸酶、TRP-1和TRP-2基因表达的抑制活性。C和Arb表示对照和熊果苷。
发明的方式
可以通过以下实施例来更好地理解本发明，以下实施例是为了举例说明，而不应解释为限制本发明。
实施例1：红果山胡椒提取物的制备
对于使用的植物材料，由济州生物资源提取物库(Jeju Bio-Resource Extract Bank)获得红果山胡椒。
首先，用流水洗涤树材料(红果山胡椒)，用热风于40℃下干燥三天并使用粉碎机粉碎。于室温下，将200g干燥的材料浸入70％乙醇中三天并伴随搅拌以提供渗出物。将该渗出物进行过滤。将渗出和过滤过程重复三次。将所得滤出液进行减压浓缩，从而获得60g的乙醇提取物。
实施例2：从红果山胡椒提取物分离溶剂部分
在该实施例中用于部分分离的溶剂购自Merk Co.、Junsei Co.和Hyman Co.。
将红果山胡椒的乙醇提取物进行以下溶剂部分分离：
首先，将实施例1中制备的60g红果山胡椒乙醇提取物(70％乙醇提取物)中的42g悬浮于蒸馏水中，并使用分液漏斗、利用正己烷(n-Hex)、二氯甲烷(CH2Cl2)、乙酸乙酯(EtOAc)和正丁醇(n-BuOH)进行部分分离。随后进行过滤和减压浓缩，得到每一溶剂部分的量如下：用n-Hex为8.56g、用CH2Cl2为1.47g、用EtOAc为4.14g、用n-BuOH为10.2g和用H2O为14.58g(参见图1)。
对每一提取物和部分进行HPLC分析，并在图2至7中给出结果。
在后续实验中，将粉末形式的己烷部分、二氯甲烷部分或乙酸乙酯部分溶解在100％乙醇中，同时将丁醇部分或水部分溶解在100％乙醇∶1×磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)为1∶1的混合物中，随后在使用之前过滤。
实施例3：从红果山胡椒乙醇提取物的溶剂部分中分离和鉴定化合物
使用硅藻土、利用二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯和丙酮将乙酸乙酯部分层(4.0g)再进行部分分离。使用氯仿和甲醇作为展开溶剂将所得部分中的乙醚部分在正相硅胶上分为子部分。使用正相硅胶、利用氯仿和甲醇将其中的部分-5进一步纯化。分别从部分-1和部分-3中分离化合物1和2。使用制备型HPLC、利用30％甲醇溶液将部分-2进一步纯化，以分离化合物3和4。
使用正相硅胶、利用己烷和乙酸乙酯的溶剂梯度将二氯甲烷部分层(2.53g)再分为10个子部分。使用正相硅胶、利用己烷和乙酸乙酯作为展开剂将部分-2纯化以分离化合物5。使用正相硅胶、利用氯仿和甲醇作为展开溶剂从部分-5中分离化合物6。分别将部分-6和部分-7重结晶以提供化合物7和8。使用氯仿和甲醇作为展开溶剂将部分-8进行正相硅胶层析以提供两个部分。将其中的部分-8-2用于分离化合物9。当通过HPLC和NMR进行分析时，按以上获得的九种化合物被证实为是纯的。
简言之，用70％乙醇提取200g的红果山胡椒的叶，得到了60g提取物，从60g提取物中分离出九种化合物。
在下表1中总结了分离的部分和化合物的收率。
表1.红果山胡椒的提取物及其部分的收率
物质 收率(％) 正己烷部分 20.400 二氯甲烷部分 6.000 乙酸乙酯部分 9.800 正丁醇部分 24.200
水部分 34.700 化合物1 0.600 化合物2 0.060 化合物3 0.002 化合物4 0.720 化合物5 0.020 化合物6 0.030 化合物7 0.240 化合物8 0.090 化合物9 0.110
使用NMR仪器(Bruker Co.500MHz，NMR)获得化合物的1H、13C、COSY、HMQC、HMBC谱，并进行分析以确定化合物的结构。进行高效液相色谱法(HPLC)用于定量分析。
在图8至25中给出了化合物的HPLC结果和1H、13C-NMR谱。
因此，化合物1被鉴定为具有以下化学式1的槲皮素：
[化学式1]
化合物2被鉴定为具有以下化学式2的槲皮苷：
[化学式2]
化合物3被鉴定为具有以下化学式3的山萘酚-3-O-鼠李吡喃糖苷：
[化学式3]
化合物4被鉴定为具有以下化学式4的槲皮素-3-O-阿拉伯呋喃糖苷：
[化学式4]
化合物5被鉴定为具有以下化学式5的咖啡酸乙酯：
[化学式5]
化合物6被鉴定为具有以下化学式6的肉桂酸甲酯：
[化学式6]
化合物7被鉴定为具有以下化学式7的赤芝酮：
[化学式7]
化合物8被鉴定为具有以下化学式8的乌药环戊烯二酮甲醚：
[化学式8]
化合物9被鉴定为具有以下化学式9的红果山胡椒查耳酮：
[化学式9]
实验实施例1：红果山胡椒提取物和部分的抗氧化活性测定
1)1，1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)自由基清除测定
根据Blosis方法通过DPPH自由基清除测定来测定给电子能力。将乙醇中不同浓度的样品等分为每孔100μL，并将相同体积的0.4mM DPPH溶液也加入96孔板中，于室温下静置10分钟，然后在517nm下测量吸光度。将丁基化羟基茴香醚(BHA)用作阳性对照。根据以下公式1来计算DPPH自由基清除活性并将活性表示为DPPH的吸光度降低50％时样品的浓度(IC50)。
公式1
DPPH自由基清除活性(％)＝(A对照-A样品)/A对照×100
其中
A样品＝包含样品的溶液的吸光度，
A对照＝包含乙醇而不包含样品的溶液的吸光度。
下表2中显示了红果山胡椒乙醇提取物及其后续部分的抗氧化活性的测量结果。对于乙醇提取物及其后续部分，DPPH的自由基清除活性以剂量依赖的方式增加。在后续部分中，乙酸乙酯部分使DPPH表现出高于对照BHA的自由基清除活性。除了二氯甲烷部分和己烷部分以外，观察到其它部分表现出显著高活性，IC50值为7.43(乙酸乙酯)、16.88(乙醇)、18.54(丁醇)和66.77μg/mL(水)(表2)。
2)黄嘌呤氧化酶抑制活性和超氧化物清除活性的测定
以别嘌呤醇(Sigma)作为对照，通过290nm下增加的吸光度来测定通过黄嘌呤氧化酶的尿酸产生。使用四氮唑蓝(NBT)还原法在560nm下测量超氧化物的量。通过在100μL 200mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)中溶解每个浓度的样品、0.5mM黄嘌呤和1mM EDTA来制备反应溶液。为了诱导尿酸的产生，将50mU/ml黄嘌呤氧化酶添加至反应溶液中。为了测量超氧化物清除活性，将0.5mM NBT添加至反应溶液中。将黄嘌呤氧化酶抑制活性和超氧化物清除活性分别表示为形成的尿酸和超氧化物降低50％时样品的浓度(IC50)。将每一样品一式三份进行测定并且计算三次测量的平均值。
表2中显示了红果山胡椒的乙醇提取物及其后续部分的黄嘌呤氧化酶抑制活性和超氧自由基清除活性的测量结果。所有的红果山胡椒乙醇提取物及其后续部分表现出浓度依赖方式的黄嘌呤氧化酶抑制活性。尽管在己烷部分(＞1000μg/mL)和二氯甲烷部分(IC50 86.21μg/mL)中检测到低活性，但是其它部分表现出高抑制活性，IC50值为5.55μg/mL至9.79μg/mL(表2)。对于超氧化物清除活性，检测到IC50值为16.86μg/mL(乙酸乙酯部分)，这比对照别嘌呤醇(IC50＝3.82μg/mL)稍低(表2)。
如先前所报道地，与阻止脂质氧化和氧化应激以及清除活性氧相关，抗氧化活性导致阻止或延缓衰老、或阻断癌症和心脏病的发生或进展，并且在包括食品工业、药品工业以及美容产品工业的多个领域具有应用前景。因此，考虑到红果山胡椒的抗氧化活性，其能够用于防止体内发生的各种氧化应激和疾病。
表2
实验实施例2：红果山胡椒提取物和部分的细胞毒性MTT测定
在本实施例中使用从美国典型培养物保藏中心(ATCC)购入的B16F10小鼠黑色素瘤细胞。在5％CO2培养箱中于37℃下在含10％的胎牛血清(FBS，Gibco)、1％抗生素-抗真菌素(Gibco)、L-谷氨酰胺和碳酸氢钠的DMEM(Gibco)中培养B16F10细胞。另外，从KCLB(韩国细胞系库)购入小鼠巨噬细胞系的RAW 264.7细胞，并在5％CO2培养箱中于37℃下在含10％FBS、100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM(Gibco)中进行培养。
在24孔板中以2×104细胞/孔的密度接种B16F10细胞并在5％CO2培养箱中于37℃下培养24小时，然后与每孔12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL浓度的样品孵育72小时。将200μL的2mg/mL MTT添加至细胞。在相同条件下孵育4小时后，将培养基除去并用PBS将细胞洗涤两次。向每孔中添加200μL的DMSO，然后通过ELISA测定仪(μQuant，USA)测定570nm下的吸光度。
为了检测红果山胡椒乙醇提取物及其后续部分对B16F10细胞系活力的影响，使细胞与12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL不同浓度的提取物和部分孵育三天。然后，通过MTT测定来测定细胞活力。如图2中所示，在提取物和部分的12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL的浓度下，观察到细胞活力为对照细胞活力的81％-103％，并因此稍高或稍低于对照。由于当使用12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL的浓度时它们未引起细胞活力的显著改变，则本发明的红果山胡椒乙醇提取物及其后续部分为低细胞毒性并且因此能够用作皮肤增白剂的成分。
实验实施例3：红果山胡椒提取物和部分对于黑色素生物合成的抑制活性的测定
在24孔板中以2×104细胞/孔的密度接种B16F10细胞并在5％CO2培养箱中于37℃下培养24小时，随后与每孔12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL浓度的样品孵育三天。将培养基除去并用PBS将细胞洗涤两次。向每孔中添加500μL的1N NaOH，随后于56℃下孵育30分钟以溶解细胞。使用ELISA测定仪(μQuant，USA)读取405nm下的吸光度。
将红果山胡椒乙醇提取物及其后续部分以12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL的不同浓度应用于细胞三天后，测量其对黑色素生物合成的抑制活性，上述浓度的红果山胡椒乙醇提取物及其后续部分在实验实施例2中均观察到对细胞是无毒性的。如图3所示，当使用12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL的浓度时，红果山胡椒乙醇提取物分别表现出0.6％、7.9％、31.6％和45.8％的黑色素抑制，而当使用100μg/mL的浓度的已知作为皮肤增白剂的对照熊果苷时，熊果苷对黑色素产生的抑制为31％。同时，浓度为100μg/mL的后续部分分别表现出33％、49％、24％、31％和28％的对黑色素生物合成的抑制，这优于或相似于对照的抑制活性。由于红果山胡椒乙醇提取物或其后续部分具有对黑色素生物合成的良好的抑制活性和低细胞毒性，所以它们可用作天然皮肤增白剂。
实验实施例4：红果山胡椒提取物和部分对酪氨酸酶的抑制活性的测定
在24孔板中以2×104细胞/孔的密度接种B16F10细胞并在5％CO2培养箱中于37℃下培养24小时，随后与12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL浓度的样品孵育三天。将培养基除去后，用PBS将细胞洗涤两次并离心以提供细胞沉淀团，然后向细胞沉淀团添加裂解缓冲液(0.1M磷酸钠缓冲液、0.2mM PMSF、1％曲拉通X-100)。将裂解缓冲液中的细胞置于冰上进行细胞裂解。离心后，将上清液用于测量酶活性。将每个样品添加至反应缓冲液中(12.5mM L-多巴、1.5mM L-酪氨酸、67mM磷酸钠缓冲液(pH6.8))并在37℃下孵育1小时，然后，使用ELISA测定仪(μQuant，USA)于405nm下测定吸光度。
用红果山胡椒乙醇提取物及后续部分处理后，黑色素最终水平的降低反映了参与黑色素合成的酶的活性的降低。如图4所示，当用12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL的不同浓度的样品处理B16F10细胞三天时，乙醇提取物分别表现出高达13.9％、15.9％、36.8％和42.5％的对酪氨酸酶的抑制，而对照熊果苷对酪氨酸酶的抑制为19％。在100μg/mL的浓度下，部分对酪氨酸酶的抑制分别为40％、21％、19％、41％和26％，这显示出优于对照的抗酪氨酸酶活性。数据证实B16F10中红果山胡椒乙醇提取物和后续部分造成的黑色素生物合成的降低主要归因于它们对酪氨酸酶的抑制活性。
实验实施例5：使用MTT测定测量红果山胡椒来源的环戊二酮化合物的细胞毒性
1)赤芝酮(化合物1)
为了检测分离为赤芝酮的单一物质对B16F10细胞系活力的影响，将细胞与1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL和10μg/mL不同浓度的该化合物孵育三天，随后通过MTT测定测定细胞活力。如图29所示，在1.25、2.5、5和10μg/mL的咖啡酸浓度下，观察到细胞活力为对照细胞活力的96％-106％，并且因此稍高或稍低与对照。由于当以1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL和10μg/mL的浓度使用本发明的分离为赤芝酮的单一物质时未引起细胞活力的显著改变，因此本发明的分离为赤芝酮的单一物质为低细胞毒性并因此能够用作皮肤增白剂的成分。
2)乌药环戊烯二酮甲醚(化合物2)
为了检测分离为乌药环戊烯二酮甲醚的单一物质对B16F10细胞系活力的影响，将细胞与1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL和10μg/mL不同浓度的该化合物孵育三天，随后通过MTT测定测定细胞活力。如图30所示，在1.25、2.5、5和10μg/mL的咖啡酸浓度下，观察到细胞活力为对照细胞活力的93％-99％，并因此稍低于对照。由于当以1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL和10μg/mL的浓度使用本发明的分离为乌药环戊烯二酮甲醚的单一物质时未引起细胞活力的显著改变，因此本发明的分离为乌药环戊烯二酮甲醚的单一物质为低细胞毒性并因此能够用作皮肤增白剂的成分。
3)红果山胡椒查耳酮(化合物3)
为了检测分离为红果山胡椒查耳酮的单一物质对B16F10细胞系活力的影响，将细胞与1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL和10μg/mL不同浓度的该化合物孵育三天，随后通过MTT测定测定细胞活力。如图31所示，在1.25、2.5、5和10μg/mL的咖啡酸浓度下，观察到细胞活力为对照细胞活力的91％-96％，并因此稍低于对照。由于当以1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL和10μg/mL的浓度使用本发明的分离为红果山胡椒查耳酮的单一物质时未引起细胞活力的显著改变，因此本发明的分离为红果山胡椒查耳酮的单一物质为低细胞毒性并因此能够用作皮肤增白剂的成分。
实验实施例6：红果山胡椒来源的环戊二酮化合物对黑色素生物合成的抑制活性的测定
1)赤芝酮(化合物1)
为了检测分离为赤芝酮的单一物质对B16F10细胞系中黑色素生物合成的抑制作用，将细胞与1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL和10μg/mL不同浓度的该化合物孵育三天并分析黑色素生物合成。
如图32所示，当以1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL和10μg/mL使用赤芝酮时，其分别表现出高达3％、19％、37％和53％的抑制，而当以50μg/mL的浓度使用已知为皮肤增白剂的对照熊果苷时，熊果苷对黑色素生物合成的抑制为23.5％。与对照熊果苷相比，该化合物具有更强的对黑色素生物合成的抑制活性并能够用作天然的皮肤增白剂。
2)乌药环戊烯二酮甲醚(化合物2)
为了检测分离为乌药环戊烯二酮甲醚的单一物质对B16F10细胞系中黑色素生物合成的抑制作用，将细胞与1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL和10μg/mL不同浓度的该化合物孵育三天并分析黑色素生物合成。
如图33所示，当以1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL和10μg/mL使用乌药环戊烯二酮甲醚时，其分别表现出高达1％、14％、38％和62％的抑制，而当以50μg/mL的浓度使用已知为皮肤增白剂的对照熊果苷时，熊果苷对黑色素生物合成的抑制为23.5％。与对照熊果苷相比，该化合物具有更强的对黑色素生物合成的抑制活性并能够用作天然的皮肤增白剂。
3)红果山胡椒查耳酮(化合物3)
为了检测分离为红果山胡椒查耳酮的单一物质对B16F10细胞系中黑色素生物合成的抑制作用，分别将细胞与1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL和10μg/mL不同浓度的该化合物孵育三天并分析黑色素生物合成。
如图34所示，当以1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL和10μg/mL使用赤芝酮时，其分别表现出高达2％、16％、29％和61％的抑制，而当以50μg/mL的浓度使用已知为皮肤增白剂的对照熊果苷时，熊果苷对黑色素生物合成的抑制为23.5％。与对照熊果苷相比，该化合物具有更强的对黑色素生物合成的抑制活性并能够用作天然的皮肤增白剂。
实验实施例7：红果山胡椒来源的环戊二酮化合物对酪氨酸酶的抑制活性的测定
如图35所示，当用12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL不同浓度的样品处理B16F10细胞三天时，赤芝酮分别表现出10％、17％、26.4％和48.9％的对酪氨酸酶的抑制，而对照熊果苷对酪氨酸酶的抑制为19％。基于这些数据，认为从红果山胡椒分离的赤芝酮造成的B16F10中黑色素生物合成的降低主要归因于其对酪氨酸酶的抑制活性。
实施例4：来自红果山胡椒的叶和树皮的提取物及其溶剂部分的制备
将由济州生物资源提取物库获得的红果山胡椒用作植物材料。提取溶剂为Merk Co.的产品。
用流水洗涤红果山胡椒的新鲜叶，用热风在40℃下干燥三天，并使用粉碎机粉碎。于室温下将200g的干燥材料浸入70％乙醇中三天并伴随搅拌，以提供渗出物。将该渗出物过滤，并将渗出和过滤过程重复三次。将所得滤出液减压浓缩，以获得60g乙醇提取物。将60g红果山胡椒乙醇提取物(70％乙醇提取物)中的42g悬浮于蒸馏水中，并用正己烷(n-Hex)、二氯甲烷(CH2Cl2)、乙酸乙酯(EtOAc)和正丁醇(n-BuOH)进行部分分离。过滤并真空浓缩，获得的提取物的量如下：使用n-Hex为8.56g、使用CH2Cl2为1.47g、使用EtOAc为4.14g、使用n-BuOH为10.2g以及使用H2O为14.58g。
以与叶相同的方式，将红果山胡椒的树皮干燥并粉碎。在相同条件下，使用560g粉碎的样品获得68.2g的70％乙醇提取物并用溶剂进行部分分离。
实施例5：从红果山胡椒的溶剂部分中分离和鉴定化合物
在该实施例的分离中使用的填料为正相硅胶60(0.063-0.200mm，Merck Co.)。分析仪器为配备XTerraC18 3.5μm 4.6×100mm的HPLC(Alliance2695，Waters Co.)。将Waters的PDA Model 2998用作分析的检测器。使用HPLC级的溶剂和试剂。用于结构分析的NMR(核磁共振)装置为Burker的JNM-LA500(German Co.)。将甲醇-d4和氯仿-d1用作NMR分析的溶剂。
使用正相硅胶、利用己烷/乙酸乙酯(v/v)的溶剂梯度将实施例4中从红果山胡椒的叶获得的二氯甲烷部分层(2.5g)再分为10个子部分。将其中的部分-6通过重结晶进一步纯化以提供化合物10(21.8mg)。
另外，使用正相硅胶、利用己烷/乙酸乙酯(v/v)的溶剂梯度将实施例4中从红果山胡椒的树皮获得的二氯甲烷部分层(7g)再分为8个子部分。将其中的部分-2进一步置于正相硅胶(己烷/乙酸乙酯为3/2)以提供部分。将其中的部分-2-2用于分离化合物12(59.6mg)，同时从部分-2-3中分离化合物11。
通过HPLC、NMR(1D，2D NMR)和LR/HR FAB-MS分析化合物10至12的结构，并通过HPLC分析乙醇提取物中化合物10至12的纯度和含量。
结果，化合物10被鉴定为赤芝酮，为环戊二酮；化合物11被鉴定为乌药环戊烯二酮甲醚，也为环戊二酮；化合物12被鉴定为由以下化学式10表示的修饰的环戊二酮衍生物，其是以前未报道的新化合物(N2)。该新化合物的IUPAC名称为2，3，4，5-四甲氧基-6-(1-甲氧基-3-苯丙基)酚]，并且被称为济州-多甲氧基-酚。在下表3中提供化合物12的1D和2D NMR数据。
[化学式10]
性质：
1)IUPAC命名：2，3，4，5-四甲氧基-6-(1-甲氧基-3-苯丙基)酚；
2)颜色：深绿色；
3)气味：轻微腐败的气味；
4)溶解性：溶于诸如甲醇、丙酮、氯仿等的有机溶剂；
5)仅分布于红果山胡椒的树皮中；
6)通用名：济州-多甲氧基-酚。
表3.化合物12的1D和2D NMR数据
在下表4中总结了来自红果山胡椒的叶和树皮的乙醇提取物、溶剂部分和化学式10的化合物的收率。
表4
如表4所示，发现化学式10的化合物在树皮中的收率高达0.71％，而在叶中没有发现该化合物。
将从红果山胡椒分离的单一化合物完全溶解于DMSO中，并进行过滤以用于后续实验。
实验实施例8：化学式10的化合物的细胞毒性的MTT测定
按照以下，对迄今未报道的新化合物在B16F10细胞系中进行毒性检测。
在本实施例中使用从美国典型培养物保藏中心(ATCC)购入的B16F10小鼠黑色素瘤细胞。在5％CO2培养箱中，于37℃下，在含10％胎牛血清(FBS，Gibco)、1％抗生素-抗真菌素(Gibco)、L-谷氨酰胺和碳酸氢钠的DMEM(Gibco)中培养B16F10细胞。
在24孔板中以2×104细胞/孔的密度接种B16F10细胞，并在5％CO2培养箱中于37℃下培养24小时，然后与5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL和30μg/mL浓度的样品孵育72小时。将200μL的2mg/mL MTT添加至细胞。在相同条件下孵育4小时后，将培养基除去并用PBS将细胞洗涤两次。向每孔中添加200μL的DMSO，然后利用ELISA测定仪(μQuant，USA)测定570nm下的吸光度。
如图36所示，在提取物和部分的5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL和30μg/mL的浓度下，观察到细胞活力为对照细胞活力的97％-103％，并因此稍高或稍低于对照。由于当以5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL和30μg/mL的浓度使用本发明的化学式10的化合物时未引起细胞活力的显著改变，因此本发明的化学式10的化合物为低细胞毒性并且因此能够用作皮肤增白剂的成分。
实验实施例9：化学式10的化合物对黑色素生物合成的抑制活性的测定
在24孔板中以2×104细胞/孔的密度接种B16F10细胞，并在5％CO2培养箱中于37℃下培养24小时，随后与样品孵育三天。将培养基除去并用PBS将细胞洗涤两次。向每孔中添加500μL的1N NaOH，，于56℃下孵育30分钟以溶解细胞，然后在用ELISA测定仪(μQuant，USA)测定405nm下的吸光度。
因此，如图37所示，当以5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL和30μg/mL的浓度使用本发明的新化合物时，其分别表现出19％、32％、51％和59％的黑色素生物合成的抑制，而当以50μg/mL的浓度使用已知作为皮肤增白剂的对照熊果苷时，熊果苷对黑色素生物合成的抑制为33.6％。由于本发明的新化合物具有为对照熊果苷2倍的对黑色素生物合成的良好抑制活性，因此能够被用作天然皮肤增白剂。
实验实施例10：化学式10的化合物对负责黑色素生物合成的基因的mRNA表达的抑制活性的测定
在本实施例中使用从美国典型培养物保藏中心(ATCC)购入的B16F10小鼠黑色素瘤细胞。在5％CO2培养箱中，于37℃下，在含10％胎牛血清(FBS，Gibco)、1％抗生素-抗真菌素(Gibco)、L-谷氨酰胺和碳酸氢钠的DMEM(Gibco)中培养B16F10细胞。
培养后，将细胞用PBS洗涤两次或三次，并使用TRIzol试剂(Invitrogen，USA)对细胞进行总RNA分离。用TRIzol-试剂将细胞均质化并与氯仿混合，然后离心(12,000rpm，15分钟)。向上清中添加相同体积的异丙醇，然后离心(12,000rpm，10分钟)以沉淀RNA。用75％焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的乙醇洗涤RNA沉淀物，将其干燥并溶于DEPC处理的水中。通过测量260nm下的吸光度来确定RNA的量。将A260/A280nm比值为1.6至1.9的唯一RNA组分用于反转录。借助于Improm-IITM cDNA试剂盒(kit)(Promega，USA)进行cDNA合成。在该过程中，在1单位RNA酶抑制剂和Improm-IITM反转录酶(2U)的存在下，将1μg分离的总RNA、寡(dT)引物和dNTP(0.5μM)于25℃加热5分钟，然后在37℃下加热60分钟，然后通过在70℃下加热10分钟来终止反转录，从而合成cDNA。通过聚合酶链式反应(PCR)从合成的cDNA扩增酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和β-肌动蛋白。对于该过程，将1μL合成的cDNA、4μM 5’-和3’-引物、10×缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 8.3、50mM KCl，0.1％曲拉通X-100)、250μM dNTP、25mM MgCl2和1单位Taq聚合酶(Promega，USA)与去离子水混合以形成25μL的总体积，并将其在Perkin-Elmer热循环仪上进行PCR。PCR进行20至25个循环，每个循环为：94℃/30秒、50℃-55℃/45秒和72℃/45秒。将由此获得的PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳并用溴化乙锭染色以显示特定条带。
在黑色素细胞中，角质形成细胞响应于UV照射而产生的NO通过cGMP途径增加黑色素生成。此外，已知黑色素细胞能增加酪氨酸酶和TRP-1的表达水平，并诱导酪氨酸酶mRNA的表达。为了检测从红果山胡椒分离的单一化合物对B16F10小鼠黑色素瘤细胞中黑色素生成的抑制作用是否来自于对mRNA表达的抑制，因而进行RT-PCR。已知在黑色素生成中起重要作用的TRP-1和TRP-2以及酪氨酸酶基因的表达被抑制。
在该上下文中，如图38所示，酪氨酸酶和TRP-1 mRNA水平以浓度依赖的方式降低。在黑色素合成的过程中，据报道，TRP-2的功能是将多巴色素转化为羧酸化衍生物5，6-二羟基吲哚-2-羧酸(DHICA)。然而，观察到TRP-2 mRNA的表达保持在恒定的水平，与样品浓度无关。
因此，，发现从红果山胡椒分离的新的化合物通过降低酪氨酸酶和TRP-1的mRNA表达来抑制黑色素生成，该机制与TRP-2无关(图38)。总之，以上获得的数据证实从红果山胡椒分离的新的化合物具有对B16F10黑色素瘤细胞中黑色素生成和酪氨酸酶的强抑制活性，并因此能够用作皮肤增白的功能性成分。
工业实用性
如实施例和实验实施例所示，发现包含从红果山胡椒分离的提取物、部分或化合物的本发明的皮肤增白组合物具有作为活性成分的环戊二酮化合物或其衍生物，由此高度抑制黑色素生成和酪氨酸酶活性。因此，本发明可应用于包括美容产品工业、药品工业和食品工业的多个领域。