发明领域
本发明涉及包含乳铁蛋白或其片段的药用组合物，以及它们在创伤， 特别是角膜创伤的治疗中的用途。
发明背景
角膜是眼睛的透明前部，覆盖瞳孔、虹膜以及前房。角膜的重要功能 之一是通过将光线折射到晶状体以及视网膜上来维持正常视力。人类的角 膜由五层组成，其中角膜上皮是最前面一层并且形成了角膜的表面。
上皮层主要是细胞的，由称作角质化细胞的细胞组成。该层充当防止， 例如，微生物侵入更深的、更易受伤害的结构的物理屏障。基质在上皮下 面并且主要由胶原组成。它还包含称作角膜细胞的其他细胞，这些细胞会 在基质创伤愈合中有作用。
角膜通过将光线折射到晶状体以及视网膜上来维持正常视力的能力部 分取决于角膜上皮经受连续更新的能力。上皮更新是必需的，因为它使得 这该组织能够充当保护角膜内部不被有害环境因素感染的屏障。更新过程 也维持了角膜的光滑光学表面。更新率通过角膜上皮的增殖、分化以及细 胞死亡过程之间的综合平衡严密维持。
角膜上皮的损害可能由佩戴接触镜期间的异物（例如，沙子和砂砾）、 微生物刺激或化学刺激或由外科手术引起。大多数角膜上皮创伤迅速愈 合。然而，在一些病例中，例如化学伤害，角膜上皮的愈合被延迟，使得 下面的基质易受感染和溃疡伤害。此外，眼睛不能维持正常的水合作用， 导致降低视力的浑浊。
碱损伤特别受关注，并导致特征为嗜中性细胞快速渗入角膜内的急性 炎症，随后是慢性炎症，慢性炎症涉及炎症细胞经延长期的迁移与聚集， 并进一步损伤角膜表面。在严重的病例中，这导致角膜溃疡、穿孔、瘢痕 形成以及永久性失明。迅速的角膜愈合对维持角膜上皮完整性以及保护视 力很重要。
天然的上皮的创伤愈合似乎取决于不同细胞组分的一种复杂的相互作 用，这些细胞组分通过相互作用的信号分子网协作。这些分子中的许多， 被称作生长因子，在角膜创伤愈合中起重要作用。表皮生长因子（EGF）， 角质化细胞生长因子以及血小板源生长因子（PDGF）是已知的刺激角膜创 伤愈合的一些生长因子。还已经发现在角膜碱烧伤之后的早期，上皮再生 强烈地诱导白细胞介素(IL)-1α以及IL-6，表明它们可能在角膜上皮的再生 中起作用。
乳铁蛋白是一种80-kDa的糖蛋白，其立体结构已经通过X射线结晶学 分析确定。该蛋白由一条单个多肽链组成，该多肽链折叠为两个球状域。 这些域被定义为N-小叶(N-lobe)和C-小叶(C-lobe)，对应于该蛋白的氨基 （N-lobe）端半段和羧基（C-lobe）端半段。每个小叶包含一个铁-结合位 点。乳铁蛋白具有多个功能，包括炎症减少、免疫应答调制以及抗细菌活 性。它是在许多物种中发现的一种蛋白，并且因此反映了一些种间序列变 异。
高山（Takayama）等人（负责促进人成纤维细胞的胶原凝胶收缩活性 的牛乳铁蛋白区域，《生物化学和生物物理研究通讯》（The bovine lactoferrin region responsible for promoting the collagen gel contractile activity of human fibroblasts,Biochem Biophys Res Commun2002;299:813-817））通过人成纤 维细胞检验了牛乳铁蛋白的N-小叶和C-小叶促进胶原凝胶收缩的能力。
美国专利号7,524,814涉及一种包括整个乳铁蛋白或N-端乳铁蛋白变 体的组合物，其中至少该N-端甘胺酸残基被截短或被取代，用作一种用于 创伤愈合的治疗。
仍存在对可以借助实用剂量（即，每单位质量足够有效的一个剂量） 来刺激角膜上皮创伤修复的无刺激组合物的需要。
本说明书中对任何现有技术的提及不是并且不应当视为承认或以任何 形式暗示这种现有技术形成在澳大利亚或任何其他管辖权的公知常识的部 分或者可以合理地预期这项现有技术由本领域技术人员确认、理解和视为 相关的。
发明概述
本发明涉及一种治疗角膜创伤的方法，它包括将包括有效量的多肽或 肽模拟物（包括乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段或变体）的药用组合 物给予对其有需要的受试者。
本发明还涉及一种药用组合物，包括一个有效量的主要由乳铁蛋白的 C-小叶或其功能活性片段或变体组成的多肽或肽模拟物。在一个实施方案 中，该乳铁蛋白是牛乳铁蛋白。
在一个实施方案中，该肽或肽模拟物由或主要由乳铁蛋白的C-小叶组 成。在本说明书中，“主要由…组成”意思是，对肽或肽模拟物而言，如 通过下文描述的方法测定，基本上具有与牛乳铁蛋白的C-小叶相同活性的 任何长度的氨基酸序列，并且其与C-小叶序列具有至少60%的同一性。如 在下文说明的，N-小叶以及整个乳铁蛋白具有与C-小叶不同的活性并且因 此“主要由”乳铁蛋白的C-小叶“组成”的肽或肽模拟物不包括整个乳铁 蛋白。合宜地，可以通过下文描述的细胞增殖和/或迁移测定来常规地测 定，确定一条氨基酸序列是否基本上具有与牛乳铁蛋白的C-小叶相同的活 性。
在一个实施方案中，通过整个乳铁蛋白的蛋白水解作用获得C-小叶。 优选地，该蛋白酶是胰蛋白酶。在一个实施方案中，该乳铁蛋白是牛乳铁 蛋白。任选地，其获得自牛奶。
在另一个实施方案中，该受试者是人类患者。在一个实施方案中，该 受试者具有，或者疑似具有角膜上皮创伤或损伤。这可以从另一种损伤或 多种损伤中分离出或除另一种损伤或多种损伤外。在一个另外的实施方案 中，该角膜创伤是一种上皮的角膜创伤。在仍一个另外的实施方案中，该 上皮的角膜创伤是一种碱诱导的创伤。
本发明还涉及包含乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段或变体的药用 组合物。在一个实施方案中，该药用组合物处于一种适合向眼睛给药的形 式。优选地，该药用组合物是水溶液。将该药用组合物局部给药。
本发明还涉及一种治疗角膜创伤的方法，包括给药一个治疗有效量的 包括乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段或变体的多肽或肽模拟物。
本发明还涉及一个治疗有效量的包括乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性 片段或变体的多肽或肽模拟物用于治疗角膜创伤的用途。
本发明还涉及一个治疗有效量的包含乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性 片段或变体的多肽或肽模拟物用于制造用于治疗角膜创伤的药剂的用途。
在一个实施方案中，当在治疗角膜创伤的方法中使用时，本发明提供 了一种包括乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段或变体的肽或肽模拟物。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于治疗角膜创伤的药用组合 物，包括作为一种活性成分的、主要由乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片 段或变体组成的多肽或肽模拟物。在另一个实施方案中，本发明提供了一 种用于治疗角膜创伤的药用组合物，包括一种主要由乳铁蛋白的C-小叶或 其功能活性片段或变体组成的多肽或肽模拟物作为主要成分。
本发明还涉及一种治疗角膜创伤的方法，包括给药一个治疗有效量的 主要由乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段或变体组成的多肽或肽模拟 物。
本发明还涉及一个治疗有效量的主要由乳铁蛋白的C-小叶或其功能活 性片段或变体组成的多肽或肽模拟物用于治疗角膜创伤的用途。本发明还 包括这种多肽或肽模拟物用于制造用于治疗角膜创伤的药剂的用途。
本发明还涉及一种治疗角膜创伤的方法，包括以下步骤：
鉴别具有角膜创伤的受试者；并且
给药包括一个有效量的主要由乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片 段或变体组成的多肽或肽模拟物的一种药用组合物，或者
给药一个治疗有效量的、主要由乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性 片段或变体组成的多肽或肽模拟物。
本发明还涉及一种加速角膜创伤闭合的方法，包括向需要其的受试者 给药：
包括一个有效量的主要由乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段或 变体组成的多肽或肽模拟物的一种药用组合物，或者
一个治疗有效量的、主要由乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段 或变体组成的多肽或肽模拟物。
在其他实施方案中，提供了用于上述的本发明的方法中的试剂盒，该 试剂盒包括：
容纳本发明的肽、肽模拟物或药用组合物的容器；以及
一个带有书面使用说明的标签或包装插入物。优选地，该书面说 明描述了该试剂盒在本发明的方法或用途中的使用。
在其他实施方案中，当在上述的本发明的方法中使用时，提供了一个 试剂盒，该试剂盒包括：
容纳本发明的肽、肽模拟物或药用组合物的容器；以及
一个带有书面使用说明的标签或包装插入物。优选地，该书面说 明描述了该试剂盒在本发明的方法或用途中的使用。
在某些实施方案中，该试剂盒可以包含用于治疗角膜创伤的一种或多 种另外的活性要素或成分。
附图简要说明
图1.SEQ ID号1（在登录号P24627-1，序列版本2下，从Swiss-Prot 数据库可公开获得）。
图2.基本角膜解剖（用苏木精和伊红染色），示出上皮，上皮是最前 面的一层，形成了角膜的外表面。
图3.与BSA对照相比，用12.8μM牛乳铁蛋白：天然的（BLF）；不含 铁（a-BLF）；铁饱和的（h-BLF）；用TFMS去糖基化的（BLF TFMS）；暴 露于兼性离子去污剂2%CHAPS（BLF CHAPS）；暴露于离液剂6M Gdn-HCl（BLF Gdn-HCl）；还原的并烷基化的；以及LFcin B肽孵化24 小时后碱诱导的HCLE创伤的相对闭合。数据代表平均值+SD（n=8）。 *与天然的BLF相比，无统计学上的显著差异（p>0.1）。#与天然的BLF 相比，统计学上显著减少（p<0.001）。
图4.BLF的化学去糖基化是通过7.5%SDS-PAGE在非还原条件下确 认的，并且对其用考马斯R-250染色。（A）天然的BLF；（B）用TMSF 孵化30分钟的BLF。
图5.来自丝氨酸蛋白酶亲和层析柱的部分：（A）BLF注入到柱中；（B） 蛋白标准；（C）未结合部分；以及（D）洗脱部分。在还原条件下在12% 的SDS-PAGE上可见，并且用考马斯R-250染色。
图6.通过0.1μM的、用1μM PMSF处理过的p-BLF、BLF、N-小叶、 C-小叶、np-BLF以及BLF的丝氨酸蛋白酶底物30μM Z-Phe-Arg-AMC水 解的速率。数据代表平均值+SD.（对p-BLF而言，n=3；对BLF、N- 小叶、C-小叶、np-BLF以及BLF而言，n=6）。*与p-BLF相比，统计学 上显著差异（p<0.005）。#与天然的BLF相比，统计学上显著差异（p< 0.05）。
图7.通过1mM PMSF，在具有或不具有丝氨酸蛋白酶抑制作用下， 在12.6μM以及252μM天然的BLF（分为非蛋白水解的（np-BLF）以及 蛋白水解的（p-BLF）部分）存在下，碱诱导的HCLE创伤的闭合。数据 代表平均值+SD（n=8）。*与PMSF处理的相比，统计学上显著差异（p <0.001）。#与PMSF处理的相比，统计学上显著差异（p<0.005）。^与 1/20th浓度相比，统计学上显著差异（p<0.001）。
图8.来自胰蛋白酶消化以及BLF N-小叶和C-小叶纯化的部分：（A） 蛋白标准;（B）胰蛋白酶消化4小时的BLF;（C）从“B”中通过阳离子交 换以及尺寸排阻色谱法纯化的C-小叶;（D）BLF;（E）胰蛋白酶消化0.5 小时的BLF;（F、G、H）分别为从“E”的尺寸排阻色谱法的多个峰中分 离出的BLF、部分消化的C-小叶、以及N-小叶。在还原条件下在12%的 SDS-PAGE上可见，并且用考马斯R-250染色。
图9.在1.28、6.4、12.8、64以及128μM浓度处，用天然的BLF、BLF N-小叶、BLF C-小叶以及BSA处理的碱诱导的HCLE创伤的闭合。数据 代表平均值+SD（n=8）。*与等摩尔的天然BLF（p<0.05）以及BLF N- 小叶（p<0.001）相比，统计学上显著增加。#与等摩尔的天然BLF相比， 统计学上显著减少（p<0.005）。^与等摩尔的BSA相比，统计学上显著减 少（p<0.05）。
图10.在豚鼠眼睛内，用64μM BLF、N-小叶、C-小叶或PBS（载体） 处理的、表示为创伤平均直径±标准差的清创术创伤的闭合。用25μL 剂量给药，对于头24小时，每3个小时一次，并且然后一天3次，直至创 伤闭合。^C-小叶创伤小于N-小叶处理的创伤（p<0.04）。#C-小叶创伤 小于PBS处理的创伤（p<0.005）。*C-小叶创伤小于BLF处理的创伤（p =0.02）。
图11.在豚鼠眼睛内，用64μM BLF、N-小叶、C-小叶或PBS（载体） 处理的、表示为创伤平均直径±标准差的碱创伤的闭合。用25μL剂量 给药，对于头8小时，每1小时一次，并且然后一天3次，直至创伤闭合。 #C-小叶创伤显著小于载体处理的创伤（p=0.013）。
图12.人类角膜缘上皮细胞在添加有1.28、6.4、12.8、64以及128μM 浓度的牛血清白蛋白（BSA）、牛乳铁蛋白（BLF）、N-小叶亦或C-小叶的 介质（M）中的增殖。在0、8、16以及24小时孵化后，通过CyQuant 进行测量。对所有的组，n=8。#与等摩尔的BSA相比，更小的增殖（p <0.001）。*与等摩尔的BSA相比，更大的增殖（p<0.05）。
图13.当用1mM羟基脲抑制增殖时，在添加有1.28、6.4、12.8、64 以及128μM浓度的牛血清白蛋白（BSA）、牛乳铁蛋白（BLF）、N-小叶亦 或C-小叶的介质（M）中，人类角膜缘上皮细胞通过迁移的创伤闭合。对 所有的组，n=8。在去除迁移障碍0、8、16以及24小时之后，进行测量。 *与等摩尔的BSA相比，更大的迁移（p<0.05）。#与等摩尔的BSA相比， 更小的迁移（p<0.001）。
实施方案的详细说明
现在将详细地参照本发明的某些实施方案。尽管将结合实施方案描述 本发明，但将应理解，不旨在将本发明不局限于那些实施方案。相反，本 发明意在覆盖全部替代形式、修改、和等同物，它们可以被包括在如权利 要求书所定义的本发明范围内。
本领域技术人员将认识到，与在此所述的那些相似或等同的许多方法 和材料，它们可以用于本发明的实践。本发明无论如何不局限于所述的方 法和材料。
术语“乳铁蛋白的C-小叶”是指乳铁蛋白的C-端小叶。如以上讨论 的，该蛋白由一条单个多肽链组成，该多肽链折叠为两个球状域。这些域 被定义为N-小叶(N-lobe)和C-小叶(C-lobe)，对应于该蛋白的氨基（N-lobe） 端半段和羧基（C-lobe）端半段。每个小叶包含一个铁-结合位点。已经 示出，乳铁蛋白为约690个氨基酸长，其中C-小叶对应于约氨基酸364（至 少对于牛乳铁蛋白）至C-末端（例如，氨基酸690）的氨基酸序列。C- 小叶的N-端可以位于氨基酸364，或者在该位置的两到三个氨基酸内（例 如，氨基酸361至氨基酸366）。在一个实施方案中，C-小叶的氨基酸序 列是在图1中给出的那个（定义为SEQ ID号1）。本发明延伸至乳铁蛋白 的所有公开序列以及它们包含的C-小叶序列。
在一个优选实施方案中，C-小叶衍生自牛乳铁蛋白并且具有根据SEQ ID号:1的序列。如在此所述，本发明还包括变体，例如物种变体或多态 变体，包括如在下文描述的一个氨基酸序列，其中在括号中的这些（）氨 基酸的任何一个或多个代替其前面的氨基酸。
YTRVVWCAVGPEEQKKCQQWSQQSGQNVTCATASTTDDCIVLVLKGEADALNLDGGYI( V)YTAGKCGLVPVLAENRKS(T)SKH(Y)SSLDCVLRPTEGYLAVAVVK(R)KANEGLTWNS LKDKKSCHTAVDRTAGWNIPMGLIVNQTGSCAFDEFFSQSCAPGA(R)DPKSRLCALCAGD DQGLDKCVPNSKEKYYGYTGAFRCLAEDVGDVAFVKNDTVWENTNGESTADWAKNLN REDFRLLCLDGTRKPVTEAQSCHLAVAPNHAVVSRSDRAAHVKQVLLH(R)QQALFGKNG KNCPDKFCLFKSETKNLLFNDNTECLAKLGGRPTYEEYLGTEYVTAIANLKKCSTSPLLEA CAFLTR
术语“多肽”或“多肽链”是指氨基酸的一个聚合物，通常通过酰胺 键连接在一起。氨基酸功能上的活性聚合物通常被称作“蛋白”。
存在着乳铁蛋白的多个同种型，并且因此组成乳铁蛋白的氨基酸的确 切数量将变化。因此，C-小叶在该蛋白中的确切位置也将变化。本发明 旨在覆盖展现出如通过下文描述的方法测定的相同活性的C-小叶的所有功 能上的活性片段以及变体。这还包括C-小叶的apo-以及holo-形式、翻译 后修饰的形式、连同糖基化的或去糖基化的衍生物。C-小叶可以任选地 包括在整个乳铁蛋白的C-小叶与N-小叶之间存在的叶间区或其一部分。 叶间区可以具有乳铁蛋白的任何同种型或物种变体的序列。
与乳铁蛋白的C-小叶的多肽序列片段或变体相关的术语“功能上活性 的”意思是，通过，例如，被施加到的要治疗的创伤上，如通过下文描述 的方法测定，能够愈合角膜创伤的片段或变体（例如，类似物、衍生物或 突变体）。此类变体包括天然发生的变体以及非天然发生的变体。考虑到 了这些氨基酸的一个或多个的添加、缺失、取代以及衍生，只要这些修饰 不导致该片段或变体的功能活性丧失。通过缩短氨基酸序列，例如，使用 一种肽链外切酶或者通过合成更短长度的氨基酸序列，可以容易地确定功 能上的活性片段，并且然后例如通过在以下实例中说明的方法，对任何创 伤愈合活性进行测试。
在无天然变体发生的情况下，可以将该片段称作肽模拟物，肽模拟物 也在本发明的范围内。例如，合成的氨基酸以及它们的类似物可以替代如 在以下方法中测定、提供创伤的愈合活性的这些天然氨基酸的一个或多个。
“肽模拟物”是一种合成的化学化合物，其基本上具有本发明的肽的 相同的结构和/或功能特征，在此进一步描述后者。典型地，肽模拟物具 有与本发明的肽相同或相似的结构，例如，与乳铁蛋白的C-小叶相同或相 似的序列。肽模拟物总体上包含至少一个非天然合成的残基。肽模拟化 合物的非天然组分可以根据以下项一个或多个：a)除天然酰胺键（“肽键”） 连接之外的残基连锁群；b)非天然的残基代替天然发生的氨基酸残基；或 c)诱导二级结构拟态的残基，即，用以诱导或稳定二级结构，例如，β转 角、γ转角、β片层、α螺旋构象、等。
使用在科学以及专利文献中（例如，《有机合成集合卷》，吉尔曼等人， 约翰·威利父子出版公司，纽约（Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman et al.(eds)John Wiley&Sons,Inc.,NY）；欧贝迪；《分子生物技术》 （al-Obeidi;Mol Biotechnol1998;9:205-223）；赫鲁比《化学生物学新见》 （Hruby Curr Opin Chem Biol1997;1:114-119）；奥斯特加德《分子多样性》 （Ostergaard Mol Divers1997;3:17-27）；奥斯德士《酶学方法》（Ostresh Methods Enzymol1996;267:220-234））描述的多种步骤和方法学可以合成 肽模拟物。
优选地，功能上的活性片段具有30、40、50、60、70、80、90或更大 的氨基酸长度。优选地，该功能上的活性片段或变体具有该片段或变体对 应的SEQ ID号1的有关部分的至少约60%同一性，更优选至少约65%、 70%、75%、80%或85%同一性，甚至更优选90%同一性，甚至更优选至 少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性。该功能上的活性片段 或变体可以对应于，或者具有与来自乳铁蛋白的C-小叶的连续的氨基酸序 列的同一性，然而，还考虑到，一个功能上的活性片段对应于，或者具有 与空间上聚集在乳铁蛋白的C-小叶的立体结构中的氨基酸序列的同一性。
此类功能上的活性片段与变体包括，例如，具有保守的氨基酸置换的 那些。本领域的那些技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括实 现对进行比较的序列的全长的最大比对所需要的任何算法（下述非限制性 实例）。当比对氨基酸序列时，给出的氨基酸序列A与（to、with或against） 给出的氨基酸序列B（可以可替代地被表述为给出的氨基酸序列A具有或 包括与（to、with或against）给出的氨基酸序列B的某一百分数的氨基酸 序列同一性）的百分数氨基酸序列同一性可以被计算为：百分数氨基酸序 列同一性=(X/Y)x100，其中，X是通过A与B的序列比对程序的或算法 的比对，被打分为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且Y是B中的氨基酸 残基的总数。如果氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不等，则 A对B的百分数氨基酸序列同一性将不等于B对于A的百分数氨基酸序列 同一性。
在计算百分数同一性中，计数确切的匹配。两个序列之间的百分数同 一性的确定可以通过使用数学算法来完成。用于两个序列的比较的一种数 学算法的一个非限制性的实例是卡尔林和阿尔丘尔《美国国家科学院院刊》 （Karlin and Altschul Proc Natl Acad Sci1990USA;87:2264）的算法，该算 法被修改为卡尔林和阿尔丘尔《美国国家科学院院刊》（Karlin and Altschul Proc Natl Acad Sci USA1993;90:5873-5877）。这样一种算法被结合到阿尔 丘尔等人，《分子生物学杂志》（Altschul et al.J MoI Biol1990;215:403）的 BLASTN以及BLASTX程序中。为了获得用于比较目标的有缺口的比对， 可以利用如在阿尔丘尔等人，《核酸研究》（Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res25:3389）中所述的有缺口的BLAST（BLAST2.0中）。可替代 地，可以将PSI-Blast用于进行检测两个分子之间的距离关系的迭代检索。 参看阿尔丘尔等人（Altschul et al.(1997)），同上。在一个优选实施方案中， 利用BLAST、有缺口的BLAST以及PSI-Blast程序，使用各自程序的默认 参数（例如，BLASTX以及BLASTN）。还可以通过检查，手动进行比对。 用于序列比较的一种数学算法的另一个非限制性的实例是ClustalW算法 （希金斯等人，《核酸研究》（Higgins et al.Nucleic Acids Res1994;22: 4673-4680））。ClustalW比较多个序列并且将全部的氨基酸或DNA序列对 齐，并且因此可以提供关于全部氨基酸序列的序列保守性的数据。 ClustalW算法被用在若干可商购的DNA/氨基酸分析软件包中，例如，Vector NTI程序套装的ALIGNX模块（Invitrogen公司，加利福尼亚州，卡尔斯 巴德（Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA））。用ClustalW进行氨基酸序 列比对之后，可以估算出百分数氨基酸同一性。对于ClustalW比对的分 析有用的一个软件程序的非限制性实例是GENEDOCTM或JalView （htp://www.jalview.org/）。GENEDOCTM允许评估多个蛋白之间的氨基酸 （或DNA）相似性以及同一性。用于序列比较的一种数学算法的另一个 非限制性的实例是梅耶斯和米勒的算法（algorithm of Myers and Miller） （CABIOS1988;4:11-17）。这样一种算法被结合到ALIGN程序（2.0版） 中，该程序是GCG威斯康辛州遗传学软件包（Wisconsin Genetics Software Package），10版（得自美国，加利福尼亚州，圣迭戈，斯克兰顿路9685 的Accelrys公司（Accelrys,Inc.,9685Scranton Rd.,San Diego,CA,USA）） 的一部分。在一个优选实施方案中，当估算百分比同一性时，利用被用于 比较氨基酸序列的ALIGN程序，PAM120权重残基表、12的缺口长度罚 分以及4的缺口罚分。
术语“保守的氨基酸置换”是指一个氨基酸被另一个相同类别的氨基 酸置换，这些类别如下：
非极性的：Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met Phe、Trp
极性不带电荷的：Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln
酸性的：Asp、Glu
碱性的：Lys、Arg、His
其他保守的氨基酸置换还可以如以下组成：
芳香族的：Phe、Tyr、His
质子供体：Asn、Gln、Lys、Arg、His、Trp
质子接受体：Glu、Asp、Thr、Ser、Tyr、Asn、Gln
术语“治疗”（treating或treatment）是指向受试者给药一个治疗有效 量的、包括该肽或肽模拟物（如，乳铁蛋白的C-小叶）的组合物，使得该 受试者被治疗的病症（例如，角膜创伤）有所改善。将认识到，该治疗可 以改善该病症，但是可能不会提供对该病症的完全治愈。该药用组合物可 以包括乳铁蛋白的C-小叶、或它的一种或多种功能活性片段或变体。
术语“受试者”是指向其给药一种包含乳铁蛋白的C-小叶的组合物的 任何动物。在一个优选实施方案中，该受试者是有创伤的人类患者。该 创伤优选是一种角膜创伤，并且在一个实施方案中，是一种角膜上皮创伤。 虽然本发明发现了人类中的应用，但是本发明对于兽用目的也是有用的。 如在此所述，本发明对于治疗家畜（例如牛、绵羊、马以及家禽）；宠物（例 如猫和狗）；以及动物园动物的创伤是有用的。
术语“治疗有效量”或“有效量”是指导致该疾病或病症的一个或多 个症状改善或恢复的肽或肽模拟物的量。
术语“创伤”是指由于疾病或紊乱或者由于事故、偶然事件或外科手 术（例如，LASIK或PRK）引起的一种损伤，例如溃疡或病损。例如， 该创伤可以是由角膜与异物（例如，沙子）接触导致的一种磨损。该创伤 可以是由于碱损伤，即碱诱导的创伤或任何其他化学烧伤引起的一种角膜 创伤（确切地，包括具有或不具有与其他创伤或损伤一起的角膜上皮创伤）。 溃疡可以是有传染性的、炎性的或自身免疫源性的。病损可以是一种不愈 合角膜病损。该创伤还可能是由于干眼病引起的。
术语“药用组合物”是指包括肽或肽模拟物（如，乳铁蛋白的C-小叶） 的组合物，该组合物被分散在一种药学上可接受的载体中。该药用组合物 可以包括乳铁蛋白的C-小叶或它的一种或多种功能活性片段或变体。该 组合物可以进一步包括一种或多种额外的赋形剂，如，稀释剂、乳化剂、 缓冲剂、稳定剂、粘合剂、填充剂，以及类似物。可任选地，它可以包括 一个有效量的其他的药学上的活性组分。例如，还可以包括一种抗生素， 如喹诺酮家族的一个成员或氨基糖甙与β-内酰胺的一个组合。其他抗生素 包括但不局限于，氯霉素、四环素类并且还可以使用大环内酯类。此外， 该组合物可以包括一种或多种抗炎剂，这个或这些抗炎剂可以是甾体的或 非甾体的抗炎剂。
本发明的药用组合物还可以仅包含乳铁蛋白的C-小叶（即，主要由其 组成）。可替代地，本发明包括一种药用组合物，该药用组合物包含与任 何其他肽、肽模拟物和/或其他活性成分相比，一个更大浓度的一种主要由 乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段或变体组成的肽或肽模拟物。
如在此使用，除非上下文另外要求，否则术语“包括”和该术语的变 体，如“包括着”（comprising）、“包括了”（comprises）和“被包括”（comprised） 不意在排除其他添加物、组分、整数或步骤。
本发明治疗角膜创伤，并且涉及向受试者给药一种包括有效量的肽或 肽模拟物（例如乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段或变体）的药用组合 物。本发明具体涉及角膜创伤的治疗。具体地，本发明考虑的角膜创伤 的类型是上皮的角膜创伤。这些创伤可能是由于，例如，化学损伤，如由 眼睛暴露于碱性试剂导致的（即，碱诱导的创伤）或外科的酒精清创术引 起的。碱诱导的创伤可以，例如，由于眼睛意外暴露于碱性液体、肥料、 石膏以及水泥粉、家用清洁产品（特别是含氨的那些）、排水沟清洁产品、 烘箱清洁剂以及类似物而发生的。本发明还协助将病原体进入角膜中最小 化。
碱暴露导致上皮细胞死亡、基质胶原变性并且危害角膜，以及使眼睛 内部被异物与病原入侵。碱诱导的创伤特征为升高的炎症应答以及阻碍的 创伤愈合，这将延长在其间可以发生威胁视力的次级并发症（例如，微生 物感染）的危险期。一些损伤还可以导致上皮溃疡的复发、慢性基质溃疡、 深度基质新生血管形成、结膜过度生长、或者甚至角膜穿孔。
可以用本发明的肽或肽模拟物或者通过本发明的方法或用途治疗的其 他角膜创伤是由清创术、磨损、刮伤或任何其他磨蚀损伤引起的创伤。这 些创伤通常被认为是非炎性创伤。
本发明的诸位申请人已经发现，乳铁蛋白的C-小叶能够比乳铁蛋白的 N-小叶亦或天然的（即，整个）乳铁蛋白更有效地增加创伤闭合速率。
由天然乳铁蛋白促进角膜不同部分愈合、角膜基质创伤愈合先前已经 被归因于其刺激成纤维细胞增殖（致使细胞外基质的合成）。相比之下， 本发明涉及不包含成纤维细胞的角膜上皮创伤的治疗。不希望受任何理论 或行动模式的约束，本发明的诸位申请人提出乳铁蛋白的C-小叶通过促进 上皮细胞迁移跨越眼表并且上调不同细胞因子以及生长因子（例如，IL-6 以及PDGF）的表达，来增加上皮创伤闭合的速率。
图2示出了基本的角膜解剖。上皮是最前面的一层，形成了角膜的外 表面。该层主要是细胞的（由角质化细胞组成）。基质在上皮下面并且包 含角膜细胞。它大部分由胶原组成。角膜细胞形成了在由非常细的分支 相连的胶原层之间的松散连接的网络，并且占基质的约10%。角膜上皮细 胞（角质化细胞）的迁移发生在纤连蛋白的临时基质（provisional matrix）、 粘连的胞外糖蛋白上，后两者出现在角膜上皮创伤部位处的基质的暴露面 上。已经示出，纤连蛋白的表达在损伤之后增加，并且某些生长因子能够 增强纤连蛋白对细胞迁移的效应。在上皮创伤愈合的病例中，提出这些生 长因子通过天然乳铁蛋白的上调可以被归因于它与不同受体（如，在创伤 愈合以及PDGF-信号通路中涉及的那些）的相互作用。
再次，不希望受任何理论或行动模式的约束，与N-小叶以及天然乳铁 蛋白相比，C-小叶的增加的效力可能是由于空间因子、更大的底物亲和力 或来自N-小叶的抑制效应。例如，将C-小叶从N-小叶的不必要的40kDa 上释放，可以减少这些肽在具体靶结合位点的空间干扰，由此促进创伤愈 合。可替代地，乳铁蛋白N-端附近的阳离子精氨酸对普遍存在的阴离子 底物（例如，硫酸化的氨基聚糖）的吸引将减少可用于结合靶的乳铁蛋白， 用于促进创伤愈合。最后，与创伤闭合温和地拮抗的活性（例如，蛋白水 解活性）可以存在于N-小叶的肽上。
本发明还涉及一种加速角膜创伤闭合的方法，包括向对其有需要的受 试者给药一种药用组合物，该组合物包括一个有效量的多肽或肽模拟物（包 括乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段或变体），或一个治疗有效量的多 肽或肽模拟物（包括乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段或变体）。与未 治疗的创伤和/或用完整的乳铁蛋白治疗的创伤相比，用本发明的肽或肽模 拟物治疗的创伤的闭合被加速。角膜创伤的加速闭合有利于防止对角膜的 额外伤害，和/或最小化感染或溃疡的风险。此外，加速创伤闭合导致视 觉功能的快速分辨。
本领域的技术人员将理解的是，乳铁蛋白的C-小叶可以通过技术人员 已知的任何合适的方法获得，这些方法包括但不局限于：重组技术，使用 遗传工程的从头合成和/或化学合成技术；从天然来源（例如，哺乳动物的 奶）中分离、纯化并蛋白水解；以及购买自商业来源。以此方式，可以纯 化、分离、重组或合成C-小叶。
在一个优选实施方案中，通过将天然来源的、重组的或可商购的乳铁 蛋白蛋白水解为N-小叶和C-小叶来获得C-小叶。优选地，使用的蛋白酶 是胰蛋白酶。然后可以使用任何数量的、技术人员已知的技术将N-小叶 和C-小叶彼此分开，这些技术例如，色谱法。阳离子交换以及尺寸排阻 色谱法都是合适的方法。
存在于本发明的药用组合物中的肽或肽模拟物（例如C-小叶）的浓度 可以是，例如，在10至70μM之间。
本发明的药用组合物可以是一种眼用组合物，它是一种适合向眼睛给 药或应用于眼睛的组合物。根据本发明的眼用组合物的实例是悬浮液、软 膏、持续释放的配制品（包括当负载到接触镜或其他生物材料中时）、凝 胶或适合用作滴眼剂的溶液。优选地，根据本发明的药用组合物将被配 制为用于局部给药或者用于持续释放递送。优选地，本发明的组合物处于 一种适合向眼睛给药的形式。基于配制容易连同受试者借助滴入一至两滴 的该溶液到病眼中，从而容易地给药此类组合物的能力，总体上优选水性 溶液。然而，该组合物还可以是悬浮液、粘性的或半粘性的凝胶或者其他 类型的固体或半固体组合物，或者适用于持续释放的那些。该药用组合物 可以是一种眼部润滑剂，例如人工泪液配制品，或接触镜溶液。
多种载体中的任一种都可以被用在本发明的组合物中，包括水，水和 水可混溶溶剂的混合物，该水可混溶溶剂例如C1至C7链烷醇类、包括从 0.5%至5%的无毒的水溶性聚合物的植物油或矿物油、凝胶产品（例如明 胶、藻酸盐、果胶、黄蓍胶、梧桐胶、黄胞胶、角叉菜胶、琼脂以及阿拉 伯胶，以及它们的衍生物）、淀粉衍生物（例如淀粉乙酸酯以及羟丙基淀 粉）、纤维素及其衍生物，并且还有其他的合成产物（例如聚乙烯醇、聚 乙烯吡咯酮、聚乙烯基甲基醚、聚氧化乙烯，优选交联的聚丙烯酸，例如 中性聚羰乙烯或那些聚合物的混合物）、天然发生的磷脂（例如，卵磷脂）、 或烯基氧化物与脂肪酸的缩合物（例如，聚氧乙烯硬脂酸酯）、或环氧乙 烷与长链脂肪醇的缩合物（例如，十七烷亚乙基氧基鲸蜡醇）、或环氧乙 烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的部分酯类的缩合物（例如聚氧乙烯山梨醇单 油酸酯）、或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的部分酯类的缩合物（例 如，聚乙烯山梨醇单油酸酯）。
通过添加水，适合制备水性悬浮液的可分散粉以及颗粒提供了与分散 剂或湿润剂、悬浮剂以及一种或多种防腐剂混合的活性成分。合适的分散 剂或湿润剂以及悬浮剂通过上文已经提及的那些进行举例说明。
根据本发明的组合物可以包括至少一种胶凝剂。适用于药用组合物的 胶凝剂是本领域那些普通技术人员熟知的，并且包括，例如，黄原胶及其 衍生物，卡波姆及其衍生物，基于丙烯酸酯的共聚物以及交联聚合物，聚 丙烯酸钠及其衍生物，纤维素及其衍生物，以及淀粉和琼脂以及它们的衍 生物。根据本发明的胶凝剂的选择在提供透明凝胶（clear gel）中是重要 的。添加到该组合物中的胶凝剂的量可以轻易地由本领域的一个普通技术 人员用最少的实验来确定，并且将取决于本领域的普那些技术人员已知的 因素，例如胶凝剂的特性以及药用组合物的希望的特性。
可以包括在本发明的药用组合物中的额外成分包括张度增强剂、防腐 剂、增溶剂、稳定剂、无毒的赋形剂、缓和剂、掩蔽剂、pH调节剂、共溶 剂以及粘度助剂。对于pH调节，优选地对于生理学pH调节，缓冲剂会 尤其有用。本溶液的pH应当保持在4至8，优选6至7.5之间的范围内。 本领域的普通技术人员将理解的是，与眼表相容的任何pH都是合适的。可 以添加合适的缓冲剂，例如硼酸、硼酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸、碳酸氢钠、 TRIS、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）以及不同的混合的磷酸盐缓冲剂（包 括Na2HPO4、NaH2PO4以及KH2PO4的组合）以及它们的混合物。通常， 在浓缩中将使用的缓冲剂的范围是从约0.05至0.5M。
如果需要的话，典型地通过张度增强剂来调节张度。此类试剂可以是， 例如，离子和/或非离子型的。离子张度增强剂的实例是碱金属或土金属 卤化物，例如像CaCl2、KBr、KCl、LiCl、NaI、NaBr或NaCl、Na2SO4或 硼酸。非离子张度增强剂是，例如，脲、甘油、山梨醇、甘露醇、丙二醇、 或右旋糖。典型地用张度剂将本发明的水性溶液调节至接近正常泪液的渗 透压。
在某些实施方案中，本发明的这些组合物额外包括一种防腐剂。防腐 剂可以典型地选自季胺类化合物，例如氯化苄烷铵（N-苄基-N-(C8-C18烷 基)-N.N-二甲基氯化铵）、苯佐氯铵或类似物。不同于季铵盐的防腐剂的实 例是硫代水杨酸的烷基汞盐，例如像，硫柳汞、硝酸苯汞、乙酸苯汞或硼 酸苯汞，过硼酸钠，亚氯酸钠，对羟苯甲酸酯，例如像，对羟苯甲酸甲酯 或对羟苯甲酸丙酯，苯甲酸钠，水杨酸，醇类，例如像，三氯叔丁醇、苯 甲醇或苯乙醇，胍基衍生物，例如像，氯己定或聚六亚甲基双胍，过硼酸 钠，或山梨酸。优选的防腐剂是季胺类化合物，特别是氯化苄 烷铵或其衍生物，例如多季胺聚合物（Polyquad）（参见，美国专利号 4,407,791）、烷基汞盐以及对羟基苯甲酸酯。在适当情况下，添加足够量 的防腐剂到该眼用组合物中，从而确保对使用期间由细菌和真菌引起的继 发性污染的保护。
在其他实施方案中，本发明的这些组合物不包括防腐剂。此类配制品 对于佩戴接触镜的受试者会特别有用。
本发明的组合物可能额外要求存在一种增溶剂，特别是如果该活性的 或非活性的成分倾向于形成一种悬浮液或乳液。适合上文有关的组合物的 增溶剂是，例如，选自下组，该组由以下项组成：泰洛沙泊、脂肪酸甘油 聚乙二醇酯、脂肪酸聚乙二醇酯、聚乙二醇、甘油醚、环糊精（例如α-、β- 或γ-环糊精，例如，烷基化的、羟烷基化的、羧基烷基化的或烷氧基羰基 -烷基化的衍生物，或单-或二糖基-α-、β-或γ-环糊精，单-或二麦芽糖基-α-、 β-或γ-环糊精或潘糖残基（panosyl）-环糊精）、聚山梨醇20、聚山梨酯80 或那些化合物的混合物。一种尤其优选的增溶剂的特定实例是蓖麻油与环 氧乙烷的反应产物，例如，商业产品Cremophor或Cremophor已经证明蓖麻油与环氧乙烷的反应产物是眼睛极好地耐受的特别好的增溶 剂。另一种优选的增溶剂选自泰洛沙泊并且选自环糊精。使用的浓度尤 其取决于活性成分的浓度。添加的量典型地足以溶解该活性成分。
这些组合物可以进一步包括无毒的赋形剂，例如像，乳化剂，湿润剂 或填充剂，例如像，指定的聚乙二醇200、300、400和600，或指定的碳 蜡1000、1500、4000、6000和10000。添加的赋形剂的量以及类型是根 据具体要求，并且本领域普通技术人员将理解的是，可以存在于一种组合 物中的赋形剂以及其他添加剂的类型以及量，使得该组合物与眼睛相容。 还可以添加其他的化合物到本发明的组合物中，从而增加载体的粘性。粘 度增强剂的实例包括但不局限于：多糖（如透明质酸）及其盐，硫酸软骨 素及其盐，葡聚糖，纤维素族的不同聚合物；乙烯基聚合物；以及丙烯酸 聚合物。
本发明的示例性的眼用溶液包括本发明的肽或肽模拟物、氯化钠、马 来酸二钠、氯化苄烷铵、氢氧化钠、盐酸、无菌纯净水以及具有约7.45的 生理pH或者在眼部舒适范围内的pH的溶液。为了最大舒适度，眼用溶 液应当具有与泪液相同的pH或者该溶液的pH应当位于眼部舒适范围内， 即pH6.6至7.8之间。可替代地，该溶液可以包括本发明的肽或肽模拟物、 氯化钠、磷酸二氢钠二水合物、氯化苄烷铵、氢氧化钠、盐酸、无菌纯净 水以及具有如上文讨论的pH的溶液。
一种示例性的眼用溶液是：
其中，将该溶液的pH用任何生物相容的酸和/或碱（例如，氢氧化钠 以及盐酸）调节至生理pH或者在眼部舒适范围内的pH。
本发明的药用组合物可以包含其他创伤治疗中有效的活性成分，例如， 生长因子、去污剂以及抗生素。该药用组合物还可以与治疗（例如皮肤替 代疗法、酶与外科清创术、创伤敷件以及压缩）组合给药。通常，这些活 性成分以及治疗以促进创伤愈合有效的组合量提供。这可以涉及同时或足 够接近地给药本发明的组合物以及活性成分/治疗，使得给药导致希望的效 应的重叠。可替代地，本发明的组合物可以在其他治疗之前或之后。本 发明的组合物可以在选择性外科手术（例如，LASIK手术）期间或之后给 药。
可以按本领域的普通技术人员视为合适的任何方式将该组合物进行给 药。可以将该药用组合物局部给药。
本发明的组合物可以按单或多剂量进行给药，并且持续任意长的时间， 直至该创伤完全愈合亦或直至达到希望的创伤愈合水平。本领域普通技术 人员将认识到剂量量值、剂量制度以及治疗时长将取决于多种因素，例如 像，创伤类型、创伤位置以及受试者的健康状态。在化学损伤的病例中， 需要的治疗取决于多种因素，如眼表损害程度、化学试剂眼内渗透的程度 以及涉及的试剂的浓度与性质。在一个实施方案中，该组合物可以每半小 时或每小时给药，多达，例如，一天八次。
该试剂盒或“制造物品”可以包括一个容器以及在该容器上或与该容 器相关联的一个标签或包装插入物。合适的容器包括，例如，瓶、管形瓶、 注射器、气泡包装、等。这些容器可以从多种材料（例如玻璃或塑料）形 成。该容器容纳对治疗病症有效的肽、肽模拟物或药用组合物，并且可以 具有灭菌的进入孔（例如该容器可以是皮下注射针可穿透的静脉内溶液袋 或具有阻塞物的管形瓶）。标签或包装插入物表明肽、肽模拟物或药用组 合物用于治疗选择的病症。在一个实施方案中，标签或包装插入物包括使 用说明书并且表明该治疗组合物可以用于治疗一种角膜创伤。
该试剂盒可以包括(a)一种肽、肽模拟物或药用组合物；以及(b)第 二个容器，该容器具有包含于其中的第二种活性要素或成分。在本发明的 该实施方案中的试剂盒可以进一步包括一种包装插入物，该包装插入物表 明肽、肽模拟物或药用组合物以及其他活性要素可以用于治疗角膜创伤。 可替代地，或额外地，该试剂盒可以进一步包括第二（或第三）个容器， 该容器包括药学上可接受的缓冲剂，例如用于注射的抑菌水（BWFI）、磷 酸盐缓冲盐水、林格氏溶液以及右旋糖溶液。它可以进一步包括来自商业 的以及使用者立场上的其他希望的材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤 器、针、以及注射器。
现在将参考所附实例以及绘图更充分地描述本发明。然而，应当理解 的是，以下描述仅是说明性的并且不应被视为以任何方式作为对上述的本 发明的一般性的限制。
实例
使用一种碱诱导的创伤模型，本发明的诸位发明人鉴定了促进人角膜 上皮创伤愈合的乳铁蛋白的结构。
总之，通过限制性胰蛋白酶的蛋白水解作用分离BLF小叶，并且使用 阳离子交换以及尺寸排阻色谱法纯化。根据用苯甲脒亲和柱的它们的丝氨 酸蛋白酶活性，以及它们的催化活性，分离牛乳铁蛋白（BLF）的同种型， 并且通过合成的丝氨酸蛋白酶底物Z-Phe-Arg-7-酰胺-4-甲基-香豆素的水 解作用，定量BLF小叶的那些。这些部分以及BLF（无铁的、铁结合的、 去糖基化的、暴露于兼性离子去污剂的、离液剂变性的、还原并烷基化的， 以及乳铁蛋白B肽（LFcin B））对创伤愈合的促进作用，是通过与铺满的 单层人类角膜缘上皮细胞（用浸泡在0.1M氢氧化钠中的滤纸盘引起创伤） 一起孵化而进行估算的。
依据制造商的说明书，用鲎变形细胞溶解产物测定法（QCL-1000；龙 沙公司（Lonza），沃克斯维尔，马里兰州（Lonza,Walkersville,MD））分析 BLF内毒素含量。
如由马森（Masson）等人（人类乳铁蛋白（红乳蛋白）的金属结合特 性1.在该反应中涉及碳酸氢盐，《欧洲生物化学杂志》（Metal-combining properties of human lactoferrin(red milk protein).1.The involvement of bicarbonate in the reaction.Eur J Biochem1968;6:579-584））所述的用改性的 方法制备无铁的（apo）牛乳铁蛋白（a-BLF）。在4°C，在离心超滤装置 （10kDa截留的Amicon Ultra；马萨诸塞州，贝德福德，密理博公司 （Millipore,Bedford,MA））中，针对0.1M柠檬酸，去除BLF（来自澳大 利亚，维多利亚州，科布蓝的安德鲁·布朗博士、合作的默里·古尔本（Dr Andrew Brown,Murray Goulburn Co-operative,Cobram,VIC,Australia）的惠 赠）的1%溶液中的铁。然后将生成的清液的缓冲剂更换为磷酸盐缓冲盐 水（PBS），并且通过超滤浓缩。
通过与贝茨等人，（铁盐与转铁蛋白的反应，《生物化学杂志》（Bates et al(The reaction of ferric salts with transferrin.J Biol Chem1973;248: 3228-3232））类似的方法，通过添加铁络合物次氮基三乙酸铁（Fe-NTA） 来制备铁饱和的（holo）牛乳铁蛋白（h-BLF）。在与2:1摩尔的过量Fe-NTA 结合前，即刻添加BLF在具有5mM碳酸氢盐的pH7.4的20mM Tris-HCl 缓冲剂中的1%溶液，并且孵化1小时。然后将h-BLF的缓冲剂更换为PBS， 并且如上文浓缩。
通过280nm至465nm的吸光度比率，用分光光度计确认a-BLF的铁 饱和（牛乳铁蛋白的结构研究，《生物化学杂志》（Structural studies on bovine lactoferrin.J Biol Chem1970;245:4269-4275））。
按照索杰和巴尔（Sojar and Bahl）（蛋白去糖基化的化学方法，《生物 化学与生物物理学集刊》（A chemical method for the deglycosylation of proteins.Arch Biochem Biophys1987;259:52-57））过程，将多聚糖链从BLF 中化学去除。将在10%的溶液中的BLF在无水三氟甲磺酸（TFMS；西格 玛公司（Sigma））中，在冰上孵化30分钟，随后用60%吡啶在-20°C进行 中和，然后将缓冲剂更换为PBS。在7.5%的tris-HCl聚丙烯酰胺凝胶中， 用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），通过BLF带的表 观分子量的减少来监控进展。
如下制备还原的并烷基化的BLF制品。以超过双硫键50倍的摩尔量， 通过与β-巯基乙醇（西格玛公司（Sigma））一起孵化4小时，还原在0.6M Tris-HCl pH8.5和2%(3-((3-胆酰胺基丙基)二甲基铵)-1-磺酸丙烷（CHAPS； 西格玛公司（Sigma））中的BLF的1%溶液（具有或不具有6M盐酸胍 （Gdn-HCl；西格玛公司（Sigma））。通过添加新鲜制备的碘乙酰胺（西 格玛公司（Sigma））至浓度略低的还原剂（例如，6mM）中，进行烷化。 在4°C，在缓冲剂交换为PBS之前，在15分钟的孵化期间，使该溶液避光。
丝氨酸蛋白酶活性与分离
使用根据制造商的实验方案，用苯甲脒丝氨酸蛋白酶亲和柱（GE医疗 保健公司，瑞典，乌普萨拉（GE Healthcare,Uppsala,Sweden））纯化具有 蛋白水解活性的BLF部分。简言之，将BLF加载到在pH7.4的具有0.5M NaCl的50mM Tris-HCl缓冲剂中的柱上，并且将结合部分在pH2.0洗脱 到恢复pH至生理水平的收集缓冲剂中，。通过以10:1摩尔比过量添加1 mM甲苯磺酰氟（PMSF；弗露卡分析公司，瑞士，圣加仑，布克斯（Fluka Analytical,Buchs,SG， Switzerland）），随后通过缓冲剂交换去除，实现BLF 蛋白水解活性的不可逆抑制。BLF蛋白水解活性的定量改编自马苏奇 （Massucci）等人（牛乳铁蛋白的蛋白水解活性，《生物金属》（Proteolytic activity of bovine lactoferrin.Biometals2004;17:249-255））。在25°C，在具 有100mM NaCl的20mM pH7.0磷酸盐缓冲剂中，用底物N-α-苄氧基羰 基-苯丙氨酸-精氨酸-7-酰氨基-4-甲基-香豆素（Z-Phe-Arg-AMC；西格玛- 艾尔德林公司，密苏里，圣路易斯（Sigma-Aldrich,St Louis,MO）），在浓 度从3至300μM进行丝氨酸蛋白酶活性测量。通过0.1μM的BLF的肽 切割以及AMC组的释放，是用465nm发射以及360nm激发波长的分光 荧光测定进行监控，从而计算起始反应速度。通过双倒数作图的线性回归 外推Km以及kcat的动力参数。使用30μM Z-Phe-Arg-AMC，做出BLF丝 氨酸蛋白酶亲和柱部分、BLF小叶以及丝氨酸蛋白酶抑制的BLF的反应速 率的比较。
BLF小叶纯化
BLF分离为N-小叶以及C-小叶片段是修改自Legrand(从人乳运铁蛋白 的N-半端分离铁-结合的18-kDa糖肽的特征化和定位，《生物化学与生物物 理学学报》（Characterization and localization of an iron-binding18-kDa glycopeptide isolated from the N-terminal half of human lactotransferrin. Biochim Biophys Acta1984;787:90-96)）)。适度搅拌，在37°C，用每mg 底物25TAME单位的固定胰蛋白酶（皮尔斯公司，伊利诺州，罗克福德 （Pierce,Rockford,IL））消化包含25mM CaCl2的0.1M Tris-HCl缓冲剂（pH 8.2）中的BLF（在10mM钙的存在下，在25°C以及pH8.2，一个TAME 单位每分钟水解1μ摩尔的p-甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（TAME））。0.5小 时和4小时的孵化时间分别用于使N-小叶以及C-小叶的产量最大化。依 据制造商的指导，通过从样品中离心分离胰蛋白酶凝胶，终止该反应。
使用平衡在50mM HEPES pH8.0中的单S5/50GL柱（GE医疗保健 公司），通过阳离子交换色谱法纯化这些小叶。在同样的缓冲剂中，通过 直至1M NaCl的线性梯度执行洗脱。在10%乙酸（Legrand，参照上文） 以及150mM NaCl中，以0.4mL/min的流速，应用分离的峰至尺寸排阻柱 Bio-Gel P-6026/1000（伯乐实验室，加利福尼亚州，赫拉克勒斯（Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA））。在用考马斯蓝R-250（伯乐实验室（Bio-Rad Laboratories））染色的12%Tris-HCl凝胶上，通过具有Laemmli系统的 SDS-PAGE使BLF和片段显像（T4噬菌体头部装配期间的结构蛋白的切 割，《自然》（Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.Nature1970;227:680-685））。使用1-D凝胶分析软件 （QuantityOne,Bio-Rad）），对比蛋白标准（Precision Plus,Bio-Rad），计算 还原的、热变性的样品的表观分子量。
准备好通过被动洗脱提取的聚丙烯酰胺凝胶带的前5个氨基酸的N-端 序列测定的BLF片段的标识，以验证所收集的部分。
细胞培养
如前所述，培养无限增殖的人类角膜缘上皮（HCLE）细胞（来自马萨 诸塞州，波士顿，薛本斯眼科研究所的艾琳吉普森博士（Dr Ilene Gipson, Schepens Eye Research Institute,Boston,MA）的惠赠），（无限增殖的人类角 膜缘以及结膜上皮细胞系中的粘蛋白基因表达，《眼科学和视觉科学研究》 （Mucin gene expression in immortalized human corneal-limbal and conjunctival epithelial cell lines.Invest Ophthalmol Vis Sci2003;44: 2496-2506））。简言之，按2x104/cm，将细胞种在组织培养处理的平板上， 并且在37°C、5%CO2气氛中，将其保持在角质化细胞无血清培养基 （K-SFM；Invitrogen-Gibco公司，纽约州，格兰德岛（Invitrogen-Gibco,Grand Island,NY））中，补充25ug/mL牛垂体提取物、0.2ng/mL重组体表皮生 长因子以及0.4mM CaCl2。在50%铺满时，将它们转换到K-SFM与低钙 杜尔贝科氏（Dulbecco’s）改良的Eagle培养基（DMEM）1:1的混合物/ 汉姆氏（Ham’s）F12（Invitrogen公司）中，以便达到铺满。
HCLE碱烧伤创伤愈合模型
为了确定BLF衍生物对碱诱导的烧伤愈合的效应，使用浸泡在0.1M 氢氧化钠中的滤纸盘使铺满的单层HCLE细胞的受创伤。立即将这些细胞 用三种培养基（1:1K-SFM：低Ca2+DMEM/F12）交换冲洗，以便于恢复 pH并去除细胞碎片。在37°C，5%CO2中，在治疗溶液中孵化24小时之 前以及之后，将创伤区域以50x的放大倍数拍照。使用图像分析软件 （ImageJ1.40g；美国国立卫生研究院，马里兰州，贝斯赛达（National Institutes of Health,Bethesda,MD））对创伤面积进行定量。结果表示为相 对创伤闭合，这是作为对照倍数的创伤面积的减少，亦或创伤闭合百分数， 创伤面积相对于初始创伤面积的减少。
通过在组织培养基（如在上文所述的）中将浓缩的BLF；apo、holo、 去糖基化的、CHAPS暴露的、Gdn-HCl暴露的、还原并烷基化的，以及 LFcin B（美国肽公司，加利福尼亚州，维斯塔（American Peptide,Vista,CA）） 稀释到12.8μM来制备用于碱烧伤创伤愈合模型的治疗溶液。经过或不经 过PMSF预处理，苯甲脒柱的部分被重构成12.6μM和254μM的存在于天 然BLF中的浓度。将BLF N-小叶以及C-小叶制备为1.28、6.4、12.8、64 以及128μM的最终浓度。在每个实验中，分别包括等摩尔的天然BLF和 牛血清白蛋白（BSA；Bovogen Biologicals公司，澳大利亚，维多利亚， 阿辛顿（Bovogen Biologicals,Essendon,VIC,Australia））的阳性与阴性对照。 使用的LFcin是从头合成的，并且相对应于BLF氨基酸20至31。
统计分析
对于创伤愈合实验，对于在一个浓度的每一个处理，数据总结为样本 量8的平均值±SD。使用单因素方差分析（ANOVA），随后使用邦弗伦 尼校正（Bonferroni correction）进行事后多重比较，对BLF；apo、holo、 去糖基化的、CHAPS暴露的、Gdn-HCl暴露的，还原并烷基化的，LFcin B、 N-小叶以及C-小叶的结果进行估算以确定每一个浓度内的处理之间的差 异。
如上文所述，分析用于使用苯甲脒柱上的部分的创伤愈合试验的结果 分析，其中进行多个浓度之间的额外比较。对于反应速率实验，使用单因 素方差分析（ANOVA），随后使用Games-Howell校正（Games-Howell correction）进行事后多重比较，对多个部分之间的差异进行计算。
统计学显著性取p<0.05。使用商业统计分析软件（SPSS；SPSS公 司，伊利诺州，芝加哥（SPSS Inc.,Chicago,IL））进行分析。
结果
如通过LAL测定确定的，在这些实验中所使用的所有BLF中，发现 内毒素含量小于4EU/mg。
碱损伤HCLE单层细胞之后，BLF的铁饱和不改变对创伤闭合的促进。 光谱分析表明，对于a-BLF，铁饱和小于10%，并且对于h-BLF，铁饱和 大于90%。发现与BSA对照相比，对于a-BLF、天然BLF以及h-BLF， 创伤闭合显著增加（p<0.001；图3）。发现与BSA对照相比，对于a-BLF、 天然BLF以及h-BLF，在12.8μM浓度的创伤闭合为3倍级别的增加。
从BLF中去除聚糖不改变它对创伤愈合的促进。通过SDS-PAGE观 察到，表观分子量不进一步下降30分钟后，完成化学去糖基化（图4）。对 于在变性条件下用肽-N-糖苷酶F而酶催化去糖基化的BLF，观察到相等的 表观分子量变化（数据未示出）。与BSA相比，去糖基化的BLF显著增 加了碱诱导的角膜创伤的闭合（p<0.001，图3）。该效应与天然BLF无 显著差异（p>0.1，图3）。
与天然BLF相比，使用离液剂、6M Gdn-HCl制备的BLF产生创伤闭 合的显著更少（p<0.001；图3），而用兼性离子去污剂（2%CHAPS）预 处理的BLF继续增加创伤愈合。随着它的还原与烷基化，BLF对创伤愈 合的促进效应丧失。
在分离中，LFcin B肽未促进HCLE细胞中的碱诱导的创伤的闭合。与 BLF相比，对于LFcin B，观察到了更少的创伤愈合（p<0.001，图3），与 阴性BSA对照（p>0.1；图3）相比无显著增加。
来自丝氨酸蛋白酶亲和柱上未结合的以及洗脱的部分的总蛋白含量的 比较示出约5%的BLF结合到苯甲脒底物上。通过SDS-PAGE，所有部分 具有与BLF相同的表观分子量，其中在洗脱的部分未看到污染带（图5）。
在25°C，pH7.0中，对丝氨酸蛋白酶底物Z-Phe-Arg-AMC而言，发现 从苯甲脒洗脱的BLF的蛋白水解活性具有34±4μM的Km以及0.3±0.08 min-1的kcat。蛋白水解的BLF（p-BLF）的该部分具有基本上大于天然BLF 或未结合的、非蛋白水解的BLF（np-BLF）的蛋白水解活性（p<0.005， 图6）。与C-小叶、np-BLF以及PMSF抑制的BLF相比，发现丝氨酸蛋 白酶底物的水解显著大于天然的BLF以及N-小叶（p<0.05，图6）。
为确定p-BLF以及np-BLF部分对通过BLF的创伤愈合的促进作用的 相对贡献，初次在浓度分别为0.6μM以及12.0μM对它们进行测试，估计 它们存在于12.6μM的天然BLF中。用0.6μM p-BLF或12.0μM np-BLF 孵化的创伤产生了类似程度的创伤闭合（p>0.5，图7）。p-BLF的浓度低 于促进创伤闭合所需要的天然BLF浓度（图9）。在这些浓度的苯甲脒柱 上的部分的丝氨酸蛋白酶抑制仅显著减少了p-BLF对创伤愈合的促进（p< 0.001，图7）。
与它们对应的低浓度制剂相比，当所有部分的浓度增加20倍时，天然 BLF以及p-BLF的愈合响应明显地更小（p<0.001，图7）。这些浓度的 天然BLF以及p-BLF的丝氨酸蛋白酶抑制作用修复创伤愈合效应（p< 0.005，图7）至np-BLF水平（p>0.5，图7）。
分离经受限制性胰蛋白酶的消化作用，随后是离子交换以及尺寸排阻 色谱法的BLF，并且纯化为它的N-小叶和C-小叶。对应于占超过90%的 蛋白（以它们对应分离的部分存在）的BLF N-小叶以及C-小叶的表观分子 量的通过SDS-PAGE可视化的带的光密度测量（图8）。
对于浓度6.4μM至128μM，C-小叶比等摩尔水平的完整BLF以及N- 小叶更大地促进创伤愈合（分别地，p<0.05以及p<0.001；图9）。在6.4 μM，与天然BLF的3倍相比，C-小叶促进创伤闭合比BSA增加4倍（图 9）。在浓度12.8μM至128μM，N-小叶促进愈合小于完整BLF（p<0.005， 图9），其中高于BSA的唯一的显著增加在6.4μM观察到（p=0.014，图9）。 对于高于该水平的N-小叶浓度，创伤闭合逐步变小。在128μM，N-小叶 促进创伤闭合小于BSA（p<0.05，图9）。
以下在豚鼠中的实验示出，分离的C-小叶比载体、N-小叶或完整的BLF 更迅速地促进体内角膜创伤愈合。
豚鼠清创术创伤：方法
通过首先区分具有3mm直径的环锯的面积，并且然后轻轻切除上皮 直到基膜，从而在角膜的中心，造成全厚度上皮清创术创伤。将这些眼睛 用25uL的载体（PBS ph7.4）亦或具有64μM BLF的载体亦或具有64μM BLF N-小叶的载体或具有64μM BLF C-小叶的载体进行处理。每个处理 组包含9只年龄、体重或健康状况无显著差异的豚鼠。清创术之后立即按 剂量给药，然后对于头24小时，每3个小时给药一次，并且然后一天给药 3次，直至完全愈合。在用于对比的荧光素钠存在下，通过每6个小时对 眼睛成像监控创伤闭合，直至观察不到染色。使用ImageJ1.44o软件（美 国，美国国立卫生研究院）计算创伤面积，并且然后转化为在每一个时间 点的平均创伤直径。
豚鼠碱创伤：方法
通过应用在1M氢氧化钠中浸渍20秒，随后用大量盐水冲洗的滤纸盘， 从而在角膜的中心，造成直径约3mm的碱烧伤。这去除上皮直到基膜。 将这些眼睛用25uL的载体（PBS pH7.4）亦或具有64μM BLF的载体亦 或具有64μM BLF N-小叶的载体或具有64μM BLF C-小叶的载体进行处 理。每个处理组包含9只年龄、体重或健康状况无显著差异的豚鼠。冲 洗之后立即按剂量给药，然后对于头8小时，每个小时给药一次，并且然 后一天给药3次，直至完全愈合。在用于对比的荧光素钠的存在下，通过 每12个小时对眼睛成像监控创伤闭合，直至观察不到染色。使用ImageJ 1.44o软件（美国，美国国立卫生研究院）计算创伤面积，并且然后转化为 在每一个时间点的平均创伤直径。
豚鼠模型：统计分析
使用单因素方差分析，随后使用邦弗伦尼校正（Bonferroni correction） 进行事后多重比较分析结果，以确定每个时间点内的处理之间的差异。通 过费氏准确性检验（Fisher’s exact test），与载体对照相比并且校正多重比较， 进一步分析在具体时间点创伤完全闭合的数量。
这些体外实验示出，分离的C-小叶对与细胞活性相关的创伤愈合的效 应。
细胞增殖测定：方法
将无限增殖的人类角膜缘上皮（HCLE）细胞种在40%铺满的96孔组 织培养板上，并且允许其在5%的CO2气氛下在37°C过夜附着。第二天， 换下培养基并且增补在1.28μM、6.4μM、12.8μM、64μM以及128μM浓 度的牛血清白蛋白（BSA）或BLF或BLF N-小叶或BLF C-小叶，每个有 8个重复，并且孵化24小时。然后根据制造商的说明书，通过CyQuant 细胞增殖测定试剂盒（Invitrogen公司，美国（Invitrogen,USA））测量细胞 增殖。简言之，这些孔中清空培养基并且储存在-80°C过夜以溶解细胞。第 二天，将这些板融化，并且向每个孔中添加200μL的在细胞溶解缓冲剂中 的CyQuant GR染料。然后在480nm的激发波长以及520nm的发射波长， 测量样品荧光（反映DNA水平）。
结果表示为每个处理在一个浓度的平均值，并且通过ANOVA以及邦 弗伦尼校正（Bonferroni correction）与等摩尔的BSA比较。
细胞迁移测定：方法
将无限增殖的人类角膜缘上皮（HCLE）细胞种在100%铺满的、涂覆 有纤连蛋白的96孔Oris细胞迁移测定（Oris Cell Migration Assay，鸭嘴兽 技术公司，美国（Platypus Technologies,USA）的组织培养板上，并且允许 其在5%的CO2气氛下在37°C过夜附着。早晨，去除栓塞以允许细胞迁 移到孔的中央2mm直径区域中。换下培养基并且增补1mM羟基脲以抑 制增殖并且增补在1.28μM、6.4μM、12.8μM、64μM以及128μM浓度的 牛血清白蛋白（BSA）或BLF或BLF N-小叶或BLF C-小叶，每个有8个 重复，并且孵化16小时。使用细胞追踪绿色CMFDA（CellTracker Green CMFDA，分子探针公司，美国（Molecular Probes,USA））对细胞质进行 染色，通过荧光共聚焦显微镜监控细胞的迁移。使用ImageJ1.44o软件（美 国，美国国立卫生研究院）分析图像，从而计算剩余的创伤面积。结果表 示为平均面积±标准差并且通过具有邦弗伦尼校正（Bonferroni correction） 的ANOVA与等摩尔的BSA进行比较。
结果
图10示出了豚鼠清创术模型中的创伤闭合的时间进程，其中分离的 C-小叶比载体、N-小叶或完整的BLF更迅速地促进愈合（表1）。12小时 后，C-小叶处理的创伤显著小于仅用载体处理的那些（p<0.005）并且剩 余更小直至闭合。
图11示出了豚鼠碱烧伤模型中的创伤闭合的时间进程，其中分离的 C-小叶以及完整的BLF比载体或N-小叶更迅速地促进愈合（表1）。在24 小时，用C-小叶处理的那些创伤显著小于用载体处理的创伤（p=0.013）。
表1对于清创术与碱创伤，分别在损伤之后的24小时以及36小时创伤完 全闭合。对于所有的组，n=9。
图12示出在体外，C-小叶在6.4μM以及12.8μM的浓度，在24小时 增加人类角膜缘上皮细胞增殖率（p<0.001），而整个BLF以及处于分离的 N-小叶在所有的浓度减少增殖（p<0.05），BLF在1.28μM例外，在此处 无效应。所有其他的C-小叶浓度相对于等摩尔的BSA对增殖无显著影响。
图13示出在体外，C-小叶在16小时，对于在6.4μM或高于其的浓度， 增加人类角膜缘上皮细胞的迁移速率，而整个BLF以及N-小叶示出细胞迁 移的浓度依赖性慢化，在128μM的浓度变得显著（p<0.001）。
因此，体外系统表明C-小叶对人类角膜缘上皮细胞在增殖、迁移以及 创伤愈合方面具有不同的效应。在豚鼠模型中，在清创术模型中，C-小叶 超过了整个BLF以及分离的N-小叶，同时在碱烧伤模型中，与整个BLF 一样有效。
将理解，本说明书中披露和限定的本发明扩展至所提到或从文本或附 图中明显的两个或更多个单独特征的全部替代性组合。这些不同组合的全 体构成本发明的多个替代性方面。