溪黄草提取物作为STAT3信号特异性抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 103417620 B (45)授权公告日 2015.02.11 CN 103417620 B (21)申请号 201310284442.9 (22)申请日 2013.07.09 A61K 36/53(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (73)专利权人 赵晨阳 地址 730900 甘肃省白银市高新技术产业园 孵化器基地 (72)发明人 赵晨阳 唐培克 张斌 (74)专利代理机构 甘肃省知识产权事务中心 62100 代理人 张英荷 CN 1144114 A,1997.03.05, 全文 . CN 101011461 A,2007.08.08, 全。

2、文 . CN 1785178 A,2006.06.14, 全文， 尤其是摘 要和实施例 2. CN 102526543 A,2012.07.04, 全文 . CN 1405177 A,2003.03.26, 全文 . CN 102260274 A,2011.11.30, 全文， 尤其是 摘要和权利要求 1-4. 林宇祺 . 溪黄草提取物及其在化妆品中的应 用 .中国优秀硕士学位论文全文数据库 . 工程 科技 I 辑 .2012,( 第 3 期 ),B018-38， 10-12 页 . 谢瑞杰 . 冬凌草和溪黄草化学成分及生物活 性研究 . 中国优秀硕士学位论文全文数据库 . 医 药卫生科技辑 。

3、.2013,( 第 4 期 ),E057-69， 91-92 页 . 郑琴 . 溪黄草化学成分的研究 .中国优 秀硕士学位论文全文数据库 . 医药卫生科技 辑 .2012,( 第 3 期 ),E057-93， 4， 32 页 . 郑穗华 . 溪黄草新型抗肿瘤活性组分的研 究 .中国优秀硕士学位论文全文数据库 . 医药 卫生科技辑 .2002,( 第 2 期 ),E056-290， 31,54 页 . 何颖， 等 .In vitro screening of effective anti-HBV and anti-tumor compounds from Rabdosia serra (Masi。

4、m.) Hara. 中国现代 医学杂志 .2011,第21卷(第12期),1449-1456. (54) 发明名称 溪黄草提取物作为 STAT3 信号特异性抑制剂 在制备抗肿瘤药物中的应用 (57) 摘要 本发明提供了一种溪黄草的医药新用途 溪黄草提取物作为 STAT3 信号特异性抑制在制 备抗肿瘤药物中的应用。细胞模型筛选实验、 Western-Blot、 半定量 PCR 检测及动物实验证明， 溪黄草提取物具有良好的 STAT3 抑制活性， 并且 能有效抑制 STAT3 所调控的相关基因的表达， 从 而可以有效抑制 STAT3 信号依赖的肿瘤细胞的生 长， 因此， 以溪黄草提取物作为 STA。

5、T3 信号特异性 抑制剂， 采用药剂学上可接受的工艺和辅料， 制备 成基于 STAT3 为靶点的抗肿瘤药物制剂， 具有很 好的开发前景。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 程心旻 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 9 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 附图9页 (10)授权公告号 CN 103417620 B CN 103417620 B 1/1 页 2 1. 溪黄草提取物单独作为 STAT3 信号特异性抑制剂在制备抗具有持续活化 STAT3 信 号的肺癌细胞的药物中的应用， 所述溪黄草提取物是通过如下方法制备 ： 。

6、将风干的溪黄草 1 Kg， 打成20 目粗粉 ； 加90%的乙醇 5 L， 在悬蒸仪中煮 2 h， 收集提取液 ； 再将沉渣用80% 的乙醇 5 L 提取在悬蒸仪中煮 2 h， 收集提取液 ； 混和两次提取液， 以3000 rpm/min离心， 取上清 ； 将上清置回流中蒸发乙醇， 浓缩至 5100 mL 液体， 即得溪黄草提取物。 2. 如权利要求 1 所述的应用， 其特征在于 ： 所述持续活化 STAT3 信号是由白细胞介素 6、 干扰素 或干扰素 激活引起的。 权 利 要 求 书 CN 103417620 B 2 1/5 页 3 溪黄草提取物作为 STAT3 信号特异性抑制剂在制备抗肿瘤。

7、 药物中的应用 技术领域 0001 本发明属于医药应用领域， 涉及一种溪黄草提取物的医药新用途作为 STAT3 信号特异性抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。 背景技术 0002 溪黄草， 俗称熊胆草、 血风草、 黄汁草、 溪沟草、 香茶菜、 土黄连等， 主产于长江以南 的湖南、 四川、 云南、 江西、 广东、 广西等省区。在医学上溪黄草具有清热利湿、 退黄祛湿、 凉 血散瘀的功效， 用于治疗急性黄疸型肝炎、 急性胆囊炎、 痢疾、 肠炎、 跌打瘀痛等病症。溪黄 草在广东各地临床应用普遍， 并开发出多种以之为主要原料的保健品及中成药， 如溪黄草 冲剂、 溪黄草袋泡茶、 消炎利胆片、 复方胆通等。 0。

8、003 溪黄草中主要含有萜类、 黄酮类、 挥发油、 甾醇类、 微量元素、 香豆素类、 酚类等多 种化学成分， 具有多种药理活性， 是一味具有较大开发前景的中药。 但当前溪黄草仍以传统 煎剂应用为主， 而中成药均以溪黄草的水煎煮粗提物使用， 以药理活性为导向的成分研究 较少， 导致对其药效物质基础及其作用机制等基础性问题方面的认识不足。 0004 STAT3 是至今研究非常透彻的与肿瘤相关的一系列信号传导分子中的重要成员 之一， 几乎参与了肿瘤发生的所有过程， 包括了细胞的增殖、 存活、 血管生成、 转移等关键 步骤。结肠癌、 乳腺癌、 神经胶质瘤细胞、 肺癌、 肝癌等细胞中， 都有持续活化的 。

9、STAT3 活 性。白细胞介素 6（IL-6） 参与的 STAT3 活化对早期结肠炎相关癌症的发生有重要关系 （Grivennikov 等人 ： Cancer Cell 2009） ； 同时 IL-6 介导的 JAK-STAT 信号对前列腺癌细 胞的增殖也有非常明显的促进作用 （Lou 等人 ： Prostate 2000） ； 由酪氨酸激酶参与的组成 型 STAT3 活性促进了乳腺癌细胞的存活和增殖 （Garcia 等人 ： Oncogene 2001） ； Src 诱导 的 STAT3 活化对黑色素瘤的促进， 以及 STAT3 持续活化引起的 VEGF 的上调和肿瘤血管的 生长也受到研究者。

10、们的关注 （Niu等人 ： Oncogene 2002; Niu等人 ： Oncogene 2002; Wei等 人 ： Oncogene 2003） ； STAT3 及其调控的相关 MMPs 蛋白参与了肿瘤的浸润和转移 （Xie 等 人 ： Cancer Res 2004; Xie 等人 ： Oncogene 2006） ； Kanda, N 等人发现持续活化的 STAT3 能通过 Survivin 促进胃癌细胞的增殖 （Kanda 等人 ： Oncogene 2004） ； 此外 IL-6 信号参 与了体内循环肿瘤细胞在原病灶部位的复发 （Kim 等人 ： J Gastroenterol 。

11、Hepatol 2009） ； STAT3 活性高是某些肿瘤预后差的重要原因之一 （Kusaba 等人 ： Oncol Rep 2006; Kim 等 人 ： Cell 2009） 。最近的研究表明， 像 BMX 非受体酪氨酸激酶参与的 STAT3 持续活化可 在一定程度上维持神经胶质瘤干细胞样细胞的自我更新 （Guryanova 等人 ： Cancer Cell 2011） 。研究还表明， 在众多肿瘤细胞中， STAT3 和另外一个重要的肿瘤相关因子 NF-kB 还存在相互结合、 共同作用促进肿瘤相关基因表达和肿瘤发生、 发展的现象 （Yang 等人 ： Cancer Res 2005; Y。

12、ang 等人 ： Genes Dev 2007; Torres 等人 ： Nat Cell Biol 2008; Lee 等人 ： Cancer Cell 2009; Yu等人 ： Nat Rev Cancer 2009） 。 大量实验表明， 通过特异性抑 制 STAT3信号能在很大程度抑制肿瘤细胞的生存、 增殖和迁移 （Ni等人 ： Cancer Res 2000; 说 明 书 CN 103417620 B 3 2/5 页 4 Rahaman 等人 ： Oncogene 2002; Leong 等人 ： Proc Natl Acad Sci 2003; Barton 等人 ： Mol Can。

13、cer Ther 2004; Darnell ： Nat Med 2005; Jing 等人 ： Anticancer Drugs 2005; Kortylewski等人 ： Nat Med 2005; Xin等人 ： Cancer Res 2009） 。 目前以 STAT3 为靶点开 发药物已成为公认的治疗某些肿瘤的重要方案， 但是尚未出现理想的药物用于临床。 0005 中国专利申请 201110423004.7 公开了一种基于 STAT3 信号通路为靶点的抗肿 瘤药物筛选细胞模型及其构建和应用， 在筛选相关抑制复方的过程中， 发现溪黄草提取物 能有效抑制所选用筛药模型中的荧光素酶活性， 经。

14、过进一步验证发现， 溪黄草提取物对 STAT3 信号有稳定的抑制效果， 且在细胞水平具有高效低毒的抑制效果， 能对 STAT3 信号 依赖的肿瘤细胞具有较好的抑制作用。由于溪黄草相关活性成分本身已用于临床， 其副作 用在可控范围之内， 故以其作为 STAT3 信号抑制剂在开发治疗由于STAT3持续活化造成的 肿瘤及相关疾病的药物具有很大的潜力。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种溪黄草提取物的医药新用途溪黄草提取物作为 STAT3 信号特异性抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。 0007 下面通过细胞实验和动物实验来说明对溪黄草提取物对 STAT3 活性的抑制作 用。 0008 仪器 ： 。

15、PerkinElmer Victor3 荧光/化学发光分析仪， Biorad 蛋白质电泳及转印 系统， Biorad 荧光定量 PCR 分析仪。 0009 试剂 ： 萤火虫荧光素酶测定试剂盒以及 RNA 反转录试剂盒购自 Promega 公司 ； IL-6 购自 Peprotech 公司 ； DMEM（高糖） 及胎牛血清购自 Hyclone（Thermo 公司） ； 各种 抗体购自 Cell Signaling Technology 公司 ； 用于荧光定量 PCR 的 Cyber Green 购自 Roche 公司 ； 总 RNA 提取试剂盒购自天根公司 ； MTT 购自上海生工。 0010 。

16、方法及结果 ： 0011 1、 Western-Blot 检测溪黄草提取物对 STAT3 活性的抑制 0012 文献报道， 在具有持续活化 STAT3 的细胞中， 抑制 STAT3 将明显抑制这一类细 胞的增殖后生长， 人乳腺癌细胞 MDA-MB-468 细胞就是其中之一， 抑制 STAT3 将有效抑制 该细胞的增殖， 故选用该细胞作为验证细胞。 0013 MDA-MB-468 细胞于 6 cm 细胞培养皿中生长至汇合度为 70% 80%， 更换新鲜 完全培养基， 加入溪黄草提取物 （1 g/100 l DMEM） 预处理 2 h， 同时以加入等量 DMSO 作为对照， 提取总蛋白， 结果见图。

17、 2 和图 3。图 2 的结果表明， 使用溪黄草提取物处理 468 细胞 4h， 能有效抑制 468 细胞中的 STAT3 活性， 图 3 的结果表明该复方对其他相关 信号关键磷酸化没有明显的作用， 如 AKT 的磷酸化。 0014 2、 溪黄草提取物对 STAT3 持续活化细胞的抑制增殖作用 0015 使用相同数目 MDA-MB- 468 细胞， 以人正常上皮细胞 hTERT-HME1 作为对照， 接 种于 96 孔板至 25%， 换含有溪黄草提取物 （1 g/100 l DMEM） 的完全培养基处理细 胞， 以含有 DMSO 的完全培养基作为对照， 分别处理 24 h， 48 h， 72 。

18、h， 加入 20 l 5 mg/ ml MTT 母液， 37孵育 2 h 后测定吸光值 （n=3） 。检测结果见图 4。图 4 显示， 用溪黄草 提取物长时间处理 468 细胞， 发现溪黄草提取物能有效抑制 MDA-MB- 468 细胞的生长和 说 明 书 CN 103417620 B 4 3/5 页 5 增殖。 0016 大量实验证明， 溪黄草提取物对具有持续活化 STAT3 肿瘤细胞都具有明显的抑 制增殖作用， 如前列腺癌细胞、 肺癌细胞、 结肠癌细胞、 宫颈癌细胞、 乳腺癌细胞等。 0017 3、 溪黄草提取物对细胞因子介导的 STAT3 活性的抑制 0018 为了进一步说明溪黄草提取物。

19、对 STAT3 活性的广泛性， 使用 STAT3 本底活性低 的细胞 HEK293T， 用细胞因子刺激激活 STAT3 观察溪黄草提取物的效应。 0019 使用 IL-6 刺激不同细胞后检测溪黄草提取物的抑制作用。 HEK293T 于10 cm 细 胞于培养皿中生长至汇合度为 70% 80%， 更换无血清培养基过夜， 加入溪黄草提取物 （1 g/100 l DMEM） 预处理 30 min， 同时以加入等量 DMSO 作为对照， IL-6（250 ng/ml） 处理 2 h 后提取总蛋白。同样的方法， 使用溪黄草提取物预处理 HEK293T 细胞后， 使用 IFN (5,000 U/ml) 或。

20、 IFN (1,500 U/ml) 2 h 后提取总蛋白。图 5 为 Western-blot 检测溪黄草提取物对 IL-6、 IFN 或 IFN 介导的 STAT3 活性的抑制。图 5 的结果表 明， 溪黄草提取物能有效抑制细胞因子激活的 STAT3 活化。 0020 4、 半定量 PCR 检测溪黄草提取物对 STAT3 所调控下游基因的转录抑制 0021 半定量 PCR 中 HEK293T 细胞于 10 cm 细胞培养皿中生长至汇合度为 70% 80%， 更换新鲜完全培养基， 加入溪黄草提取物 （1 g/100 l DMEM） 预处理 30 min， 同时 以加入等量 DMSO 作为对照，。

21、 4 h 后提取总 RNA， 反转录后， 做半定量分析。结果见图 6， 图 6 的结果表明， 使用溪黄草提取物预处理的 HEK293T， IL-6 诱导的 STAT3 下游基因 socs3 mRNA 水平明显低于未用溪黄草提取物预处理的细胞， 证明溪黄草提取物可以抑制 由 STAT3 调控的下游基因的转录。 0022 5、 动物裸鼠实验检测溪黄草提取物对肿瘤 （肝癌） 的抑制作用 0023 于右前肢腋下皮下接种人肝癌 SMMC-7721 细胞到 30 只裸鼠中， 待裸鼠肿瘤生 长至 333 mm（20 30 mm3） 。将实验动物随机分成 6 组， 5 只 / 组， 阴性对照组 （生理 盐水）。

22、 、 阳性对照组、 给药组 （4 组 ： 低剂量组、 次低剂量组、 中剂量组、 高剂量组） 。阴性对照 组每日灌胃给予生理盐水 0.2 mL， 每日一次， 连续 32 天 ； 阳性对照组为尾静脉注射紫杉 醇 5 mg/kg 体重 （注射用紫杉醇） ， 每日一次， 连续 32 天。给药组为每日灌胃给药， 给药体 积均为每只小鼠 0.2 ml， 每日一次。 给药剂量为 ： 低剂量组 5 g 溪黄草提取物/kg 体重 ； 次低剂量组 10 g 溪黄草提取物 /kg 体重 ； 中剂量组 30 g 溪黄草提取物 /kg 体重 ； 高剂 量组 100 g 溪黄草提取物 /kg 体重， 连续 32 天。荷瘤。

23、小鼠停药后次日将动物处死， 解剖 皮下瘤块并称重， 计算瘤体大小， 结果见图 7 和 8。图 7 的结果表明， 高剂量溪黄草及紫 杉醇阳性对照提取物对裸鼠体重具有轻微的抑制作用， 和阴性对照相比， 在第 32 天， 小鼠 体重减轻了约 3 g ； 图 8 的结果表明， 高剂量溪黄草提取物对肝癌荷瘤裸鼠瘤体大小具有 显著抑制作用， 瘤体积抑制率约为 60% 左右， 略优于紫杉醇。 0024 6、 动物裸鼠实验检测溪黄草提取物对肿瘤 （肺癌） 的抑制作用 0025 于右前肢腋下皮下接种人肝癌 A549 细胞到 30 只裸鼠中， 待裸鼠肿瘤生长至 333 mm （20 30 mm3） 。 将实验动物。

24、随机分成 6 组， 5 只/组， 阴性对照组 （生理盐水） 、 阳 性对照组、 给药组 （4 组 ： 低剂量组、 次低剂量组、 中剂量组、 高剂量组） 。阴性对照组每日灌 胃给予生理盐水 0.2 ml， 每日一次， 连续 32 天 ； 阳性对照组为尾静脉注射紫杉醇 5 mg/ kg 体重 （注射用紫杉醇） ， 每日一次， 连续 32 天。给药组为每日灌胃给药， 给药体积均为每 说 明 书 CN 103417620 B 5 4/5 页 6 只小鼠 0.2 ml， 每日一次。 给药剂量为 ： 低剂量组 5 g 溪黄草提取物/kg 体重 ； 次低剂量 组 10 g 溪黄草提取物 /kg 体重 ； 中。

25、剂量组 30 g 溪黄草提取物 /kg 体重 ； 高剂量组 100 g 溪黄草提取物/kg 体重， 连续 32 天。 荷瘤小鼠停药后次日将动物处死， 解剖皮下瘤块并 称重， 计算瘤体大小， 结果见图 9 、 10、 11 和 12。图 9 和 10 的结果表明， 中剂量和高剂 量溪黄草及紫杉醇阳性对照提取物对裸鼠体重具有轻微的抑制作用， 和阴性对照相比， 在 第 32 天， 小鼠体重减轻了约 1 - 2 g ； 图 11 和 12 的结果表明， 中剂量和高剂量溪黄草 提取物对肺癌荷瘤裸鼠瘤体大小具有显著抑制作用， 瘤体积抑制率约为 3 4 倍左右， 并 且抑制效果明显优于紫杉醇。 0026 综。

26、上所述， 溪黄草提取物具有良好的 STAT3 抑制活性， 并且能有效抑制 STAT3 所调控的相关基因的表达， 从而可以有效抑制 STAT3 信号依赖的肿瘤细胞的生长， 并对实 体瘤也有相应的抑制作用， 因此， 以溪黄草提取物为活性成分， 可用于制备基于 STAT3 为 靶点的抗肿瘤药物 ： 以溪黄草提取物作为 STAT3 信号特异性抑制剂， 采用药剂学上可接受 的工艺和辅料， 制备成各种剂型的抗肿瘤药物， 如各种口服制剂和注射剂等。 附图说明 0027 图 1 为溪黄草提取物 HPLC 特征峰。 0028 图 2 为 Western-Blot 检测溪黄草提取物对 STAT3 活性的抑制。 0。

27、029 图 3 为 Western-Blot 检测溪黄草提取物对 AKT 活性无明显影响。 0030 图 4 溪黄草提取物对肿瘤细胞的增殖抑制。 0031 图 5 为 Western-Blot 检测溪黄草提取物对细胞因子 IL-6、 IFN 和 IFN 介 导的 STAT3 活性的抑制。 0032 图 6 为荧光定量 PCR 分析溪黄草提取物对细胞因子 IL-6 介导的 STAT3 下游 基因socs3 的转录抑制 。 0033 图 7 为高剂量溪黄草提取物对肝癌荷瘤裸鼠体重的影响。 0034 图 8 为高剂量溪黄草提取物对肝癌荷瘤裸鼠瘤体大小的抑制作用。 0035 图 9 为中剂量溪黄草提取。

28、物对肺癌荷瘤裸鼠体重的影响。 0036 图 10 为高剂量溪黄草提取物对肺癌荷瘤裸鼠体重的影响。 0037 图 11 为中剂量溪黄草提取物对肺癌荷瘤裸鼠瘤体大小的抑制作用。 0038 图 12 为中剂量溪黄草提取物对肺癌荷瘤裸鼠瘤体大小的抑制作用。 具体实施方式 0039 下面具体实施例对溪黄草提取物作为活性成分， 在制备基于 STAT3 为靶点的抗肿 瘤药物中的应用作进一步说明。 0040 实施例 1、 溪黄草提取物片剂的制备 0041 （1） 溪黄草提取物的制备 ： 将风干的溪黄草 1 Kg， 打成粗粉 （20 目） 。加 90% 的乙 醇 5 L， 在悬蒸仪中煮 2 h， 收集提取液 ；。

29、 再将沉渣用 80% 的乙醇 5 L 提取在悬蒸仪中煮 2 h， 收集提取液 ； 混和两次提取液， 离心 （3000 rpm/min） ， 取上清 ； 将上清置回流中蒸发乙 醇， 浓缩至 5100 mL 液体， 即得溪黄草提取物， 置 4备用。 溪黄草提取物HPLC 特征峰见 图 1。 说 明 书 CN 103417620 B 6 5/5 页 7 0042 （2） 溪黄草提取物片剂的制备 0043 配方 ： 溪黄草提取物 （纯度大于 95%） 20.0g 0044 填充剂 180.0g 0045 崩解剂 10.0g 0046 黏合剂 6.0g 0047 润滑剂 3.0g 0048 共计 200。

30、.0g 0049 工艺 ： 按制备片剂的常规工艺制成片剂 1000 片， 每片含溪黄草提取物钠盐 20mg。 0050 实施例 2 ： 溪黄草提取物胶囊的制备 0051 （1） 溪黄草提取物的制备 ： 同实施例 1. 0052 （2） 溪黄草提取物胶囊的制备 0053 配方 ： 溪黄草提取物 （纯度大于 95%） 50.0g 0054 填充剂 85.0g 0055 黏合剂 5.0g 0056 润滑剂 10.0g 0057 共计 200.0g 0058 工艺 ： 按制备胶囊剂的常规工艺制成 1000 粒， 每粒胶囊含溪黄草提取物钠盐 50mg。 0059 实施例 3、 溪黄草提取物注射液的制备 。

31、0060 （1） 溪黄草提取物的制备 ： 同实施例 1. 0061 （2） 溪黄草提取物注射液的制备 0062 配方 ： 溪黄草提取物 （纯度大于 95%） 100.0g 0063 枸橼酸 1.0g 0064 枸橼酸钠 0.5g 0065 氯化钠 18.0g 0066 注射用水 2000mL 0067 工艺 ： 按制备注射剂的常规工艺操作， 共制成2mL的注射剂1000支， 每支溪黄草提 取物钠盐 100mg。 0068 上述各实施例中的填充剂、 崩解剂、 黏合剂、 润滑剂等辅料均为药剂学上最常规 的辅料。 说 明 书 CN 103417620 B 7 1/9 页 8 图 1 图 2 说 明 。

32、书 附 图 CN 103417620 B 8 2/9 页 9 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103417620 B 9 3/9 页 10 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103417620 B 10 4/9 页 11 图 7 说 明 书 附 图 CN 103417620 B 11 5/9 页 12 图 8 说 明 书 附 图 CN 103417620 B 12 6/9 页 13 图 9 说 明 书 附 图 CN 103417620 B 13 7/9 页 14 图 10 说 明 书 附 图 CN 103417620 B 14 8/9 页 15 图 11 说 明 书 附 图 CN 103417620 B 15 9/9 页 16 图 12 说 明 书 附 图 CN 103417620 B 16 。