技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种治疗细菌性结膜炎的DC细胞蛋白滴眼液 及其制备方法和应用。
背景技术
细菌性结膜炎是一种由细菌感染引起的临床常见的眼科疾病之一，俗称“红眼”或“火 眼”。其临床常见症状为结膜充血、结膜囊脓性、粘液性或黏脓性分泌物，也是定性和病变 程度的诊断依据。常见的致病细菌有科一韦杆菌、肺炎双球菌、流行性感冒杆菌、金黄色葡 萄球菌等，一般多在春夏暖和季节流行，但由肺炎双球菌引起者多见于冬季。
该病具有一定的自限性，病程通常在两周之内。虽然该病的诊断和治疗不难，但是，若 治疗不及时或方法不当，容易转为慢性结膜炎，对患者的损伤较大。临床上通常使用抗生素 滴眼液进行治疗，虽然可以收到显著的效果，但复发率相对较高，而且临床上有普遍滥用抗 生素的问题，从而导致耐药菌株不断增多，故开发一种敏感有效的药物来治疗细菌性结膜炎 是当务之急。
DC细胞是一种重要的淋巴细胞，在机体抗病毒自然免疫中发挥着重要作用，故将DC 细胞应用于细菌性结膜炎的治疗无疑具有重大意义。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种治疗细菌性结膜炎的DC细胞蛋白滴眼液， 含有DC细胞分泌的蛋白浓缩物，不仅预防及治疗细菌性结膜炎的效果显著、不易复发，能 够大大减轻患者的痛苦，而且能够替代现有技术中普遍使用的抗生素滴眼液，减少了普遍滥 用抗生素的问题。
本发明的另一目的是提供一种治疗细菌性结膜炎的DC细胞蛋白滴眼液的制备方法。
本发明的再一目的是提供一种DC细胞蛋白滴眼液用于治疗细菌性结膜炎的用途。
本发明通过以下技术方案实现该目的：
一种治疗细菌性结膜炎的DC细胞蛋白滴眼液，由DC细胞分泌的蛋白的浓缩液和生理 盐水组成。
进一步的，所述生理盐水中含有1～5％的人血白蛋白和0.01～0.05％的氢化可的松溶液。
作为优选的，所述DC细胞分泌的蛋白的浓缩液与生理盐水的体积比为1:2。
一种治疗细菌性结膜炎的DC细胞蛋白滴眼液的制备方法，包括以下步骤：
1)采集患者自身外周血50mL，离心后收集血浆；
2)将下层血细胞用生理盐水进行稀释，再将稀释液加入已有Ficoll分离液的sepmate离 心管中，300～500g离心10-20min，血细胞与生理盐水的体积比为1:2～2:1；
3)将步骤2)中离心后的上层液体从离心管中倒出，再加入15～25mL的RPMI1640培 养基重悬细胞，300～500g离心10-20min；
4)分别采用抗CD14抗体和抗CD86的抗体磁珠分选出单核细胞和DC细胞；
5)向分选出的单核细胞和DC细胞中加入X-VIVO15培养基进行培养，细胞密度为5～ 10×105/mL；同时向培养基中加入100-1000U/mL的IL-4和100-1000U/mL的GM-CSF，每 日观察DC细胞的形态；
6)分别在培养的第6天和第8天向培养基中添加50-500U/mL的TNF-α以促进DC细胞 的成熟；
7)培养10天后收集DC细胞和培养上清，将DC细胞进行裂解；
8)将裂解后的DC细胞内容物和培养上清中的蛋白浓缩70～90倍，将浓缩液稀释在含 有1～5％的人血白蛋白(HSA)和0.01～0.05％的氢化可的松溶液的生理盐水溶液中，浓缩 液与生理盐水的体积比为1:2，制得DC细胞蛋白滴眼液。
作为优选的，在培养过程中每隔两日计数细胞一次，并补加一定量的X-VIVO15培养基、 IL-4和GM-CSF。
其中，在培养10天后，抽取1×106的细胞进行DC细胞的流式检测。
一种DC细胞蛋白滴眼液用于治疗细菌性结膜炎的用途。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明的治疗细菌性结膜炎的DC细胞蛋白滴 眼液，含有DC细胞分泌的蛋白浓缩物，不仅预防及治疗细菌性结膜炎的效果显著、不易复 发，能够大大减轻患者的痛苦，而且能够替代现有技术中普遍使用的抗生素滴眼液，减少了 普遍滥用抗生素的问题，制备方法首先对DC细胞进行扩增培养，然后再收集DC细胞分泌 的蛋白，将蛋白进行浓缩后与生理盐水复配制得DC细胞蛋白滴眼液，制备方法简单、成本 低，本发明的滴眼液在治疗细菌性结膜炎的应用中具有显著的效果，且不易复发。
附图说明
图1为实施例1中培养第2天的DC细胞形态图。
图2为实施例1中培养第7天的DC细胞形态图。
图3为实施例1中的DC细胞流式检测结果图。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明进行详细描述。
实施例1。
本实施例提供一种治疗细菌性结膜炎的DC细胞蛋白滴眼液的制备方法，包括以下步骤：
1)采集患者自身外周血50mL，离心后收集血浆；
2)将下层血细胞用生理盐水进行稀释，再将稀释液加入已有Ficoll分离液的sepmate离 心管中，300g离心10min，血细胞与生理盐水的体积比为1:2；
3)将步骤2)中离心后的上层液体从离心管中倒出，再加入15mL的RPMI1640培养基 重悬细胞，300g离心10min；
4)分别采用抗CD14抗体和抗CD86的抗体磁珠分选出单核细胞和DC细胞；
5)向分选出的单核细胞和DC细胞中加入X-VIVO15培养基进行培养，细胞密度为 5×105/mL；同时向培养基中加入100U/mL的IL-4和100U/mL的GM-CSF，每日观察DC细 胞的形态，其中培养第2天和第7天的DC细胞形态分别如图1、图2所示；
6)分别在培养的第6天和第8天向培养基中添加50U/mL的TNF-α以促进DC细胞的 成熟；
7)培养10天后收集DC细胞和培养上清，将DC细胞进行裂解；
8)将裂解后的DC细胞内容物和培养上清中的蛋白浓缩70倍，将浓缩液稀释在含有1％ 的人血白蛋白(HSA)和0.01％的氢化可的松溶液的生理盐水溶液中，浓缩液与生理盐水的 体积比为1:2，制得DC细胞蛋白滴眼液。
作为优选的，在培养过程中每隔两日计数细胞一次，并补加一定量的X-VIVO15培养基、 IL-4和GM-CSF。
其中，在培养10天后，抽取1×106的细胞进行DC细胞的流式检测，流式检测结果如图 3所示。
实施例2。
本实施例提供一种治疗细菌性结膜炎的DC细胞蛋白滴眼液的制备方法，包括以下步骤：
1)采集患者自身外周血50mL，离心后收集血浆；
2)将下层血细胞用生理盐水进行稀释，再将稀释液加入已有Ficoll分离液的sepmate离 心管中，400g离心15min，血细胞与生理盐水的体积比为1:1；
3)将步骤2)中离心后的上层液体从离心管中倒出，再加入20mL的RPMI1640培养基 重悬细胞，400g离心15min；
4)分别采用抗CD14抗体和抗CD86的抗体磁珠分选出单核细胞和DC细胞；
5)向分选出的单核细胞和DC细胞中加入X-VIVO15培养基进行培养，细胞密度为 8×105/mL；同时向培养基中加入500U/mL的IL-4和500U/mL的GM-CSF，每日观察DC细 胞的形态；
6)分别在培养的第6天和第8天向培养基中添加300U/mL的TNF-α以促进DC细胞的 成熟；
7)培养10天后收集DC细胞和培养上清，将DC细胞进行裂解；
8)将裂解后的DC细胞内容物和培养上清中的蛋白浓缩80倍，将浓缩液稀释在含有3％ 的人血白蛋白(HSA)和0.03％的氢化可的松溶液的生理盐水溶液中，浓缩液与生理盐水的 体积比为1:2，制得DC细胞蛋白滴眼液。
作为优选的，在培养过程中每隔两日计数细胞一次，并补加一定量的X-VIVO15培养基、 IL-4和GM-CSF。
其中，在培养10天后，抽取1×106的细胞进行DC细胞的流式检测。
实施例3。
本实施例提供一种治疗细菌性结膜炎的DC细胞蛋白滴眼液的制备方法，包括以下步骤：
1)采集患者自身外周血50mL，离心后收集血浆；
2)将下层血细胞用生理盐水进行稀释，再将稀释液加入已有Ficoll分离液的sepmate离 心管中，500g离心20min，血细胞与生理盐水的体积比为2:1；
3)将步骤2)中离心后的上层液体从离心管中倒出，再加入25mL的RPMI1640培养基 重悬细胞，500g离心20min；
4)分别采用抗CD14抗体和抗CD86的抗体磁珠分选出单核细胞和DC细胞；
5)向分选出的单核细胞和DC细胞中加入X-VIVO15培养基进行培养，细胞密度为 10×105/mL；同时向培养基中加入1000U/mL的IL-4和1000U/mL的GM-CSF，每日观察DC 细胞的形态；
6)分别在培养的第6天和第8天向培养基中添加500U/mL的TNF-α以促进DC细胞的 成熟；
7)培养10天后收集DC细胞和培养上清，将DC细胞进行裂解；
8)将裂解后的DC细胞内容物和培养上清中的蛋白浓缩90倍，将浓缩液稀释在含有5％ 的人血白蛋白(HSA)和0.05％的氢化可的松溶液的生理盐水溶液中，浓缩液与生理盐水的 体积比为1:2，制得DC细胞蛋白滴眼液。
作为优选的，在培养过程中每隔两日计数细胞一次，并补加一定量的X-VIVO15培养基、 IL-4和GM-CSF。
其中，在培养10天后，抽取1×106的细胞进行DC细胞的流式检测。
实施例4、DC细胞蛋白滴眼液治疗细菌性结膜炎的临床效果观察实验
1、基本资料：
2015年3月～2015年4月在中山大学眼科医院诊断为细菌性结膜炎的患者30例50眼， 其中男10例18眼，女20例32眼，年龄25-45岁。
2、症状体征：
刺痛、痒感、分泌物、流泪、眼睛红肿、睑结膜充血。
3、根据上述症状体征，按照不同程度分为4级：
无、轻度、中度和重度，并依次定位为0分、1分、2分和3分。
4、实验方法：
随机分为实验组、对照组各15例。实验组使用DC细胞蛋白滴眼液，对照组使用0.5％ 病毒唑滴眼液(上海集成制药厂)，均6次/天，1滴/次，连续治疗10天。分别在用药后7 天、14天进行复查，复查项目包括刺痛、痒感、分泌物、流泪、眼睛红肿、睑结膜充血等项 目，所有患者复查时均询问用药时是否有刺激感、异物感和眼痒等不适症状。
5、疗效评价标准：
按照痊愈、显效、有效和无效四级评定。以治疗前后总分值的下降来判断单个患者的疗 效，症状体征积分的下降值＝治疗前积分-治疗后积分。
(1)痊愈：第1、第2次复查时症状体征全消失(总分为0)；
(2)显效：积分减少≥85％且＜100％；
(3)有效：积分减少≥50％且＜85％；
(4)无效：积分减少＜50％，或症状体征加重。
总有效率＝(痊愈病例数+显效病例数)/可供评价疗效病例数。
6、实验结果：
实验组治愈18眼，显效2眼，有效5眼，总有效率为80.0％(20/25)，对照组治愈17 眼，显效1眼，有效4眼，无效3眼，总有效率为72.0％(18/25)，两组有统计学意义。
7、结论：
相对于使用0.5％病毒唑滴眼液治疗细菌性结膜炎，本发明的DC细胞蛋白滴眼液治疗细 菌性结膜炎具有更高的有效率，不仅预防及治疗细菌性结膜炎的效果显著、不易复发，能够 大大减轻患者的痛苦，而且能够替代现有技术中普遍使用的抗生素滴眼液，减少了普遍滥用 抗生素的问题。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因 此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。 因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。