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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410775191.9 (22)申请日 2014.12.12 A61K 49/00(2006.01) A61K 31/704(2006.01) A61K 47/46(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 中国科学院大连化学物理研究所 地址 116023 辽宁省大连市中山路 457 号 (72)发明人 谭明乾 王姿懿 马小军 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 21002 代理人 马驰 (54) 发明名称 一种来自啤酒的碳点的制备方法及应用 (57) 摘要 本发明公开了一种以啤酒为。
2、主要原料， 通过 葡聚糖凝胶色谱法分离提纯并收集碳点的方法， 该碳点可以直接用于活细胞荧光成像， 此外将碳 点与阿霉素在水中混合搅拌， 获得担载阿霉素的 碳点， 可用于杀死肿瘤细胞。 本发明制备的啤酒碳 点成本低， 毒性小， 方法简单， 担载阿霉素后水溶 性良好， 可作为荧光药物载体， 在肿瘤荧光标记及 治疗方面进行应用。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图5页 CN 105727313 A 2016.07.06 CN 105727313 A 1/1 页 2 1.一种来自啤酒的碳点的制备方法， 其特征在于 ： 将。
3、啤酒浓缩， 去除不溶性杂质后， 通 过分离提纯， 收集强荧光组分， 干燥得碳点 ； 将碳点与阿霉素按质量比 1000:11:10 混合， 溶解于去离子水中， 调节 pH 值至 3-12， 避光搅拌 0.572h， 加入有机溶剂， 收集沉淀， 挥发 干燥后得到担载阿霉素碳点。 2.根据权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于 ： 所述的浓缩方法是旋转蒸发、 冷冻干 燥或喷雾干燥中的一种或二种以上的组合。 3.根据权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于 ： 所述的分离提纯方法为超滤、 透析、 超速离心、 凝胶色谱中的一种或任意二种及以上方法的结合。 4.根据权利要求 1 所述的制备方法， 其。
4、特征在于 ： 所述的强荧光组分为啤酒中天然存 在的碳量子点。 5.根据权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于 ： 其特征在于 ： 所述的有机溶剂为甲 醇、 乙醇、 正丙醇、 异丙醇、 乙腈、 丙酮中的一种或任意二种或二种以上以任意比例组成的混 合物， 有机溶剂的加入量与碳点的质量比为 1:1-50:1。 6.一种权利要求 1 所述的碳点的应用， 其特征在于 ： 所述的碳点， 可作为荧光药物载 体， 在肿瘤荧光标记及治疗方面进行应用， 担载阿霉素的碳点到达肿瘤部位， 缓慢释放药 物， 运用纳米粒的 EPR 效应， 增强肿瘤治疗效果， 并在成像方面有较好应用， 且可能会降低 阿霉素的心肌毒性。。
5、 权 利 要 求 书 CN 105727313 A 2 1/4 页 3 一种来自啤酒的碳点的制备方法及应用 技术领域 0001 本发明涉及一种来自啤酒碳点的制备方法， 及其作为荧光性抗肿瘤药物载体， 在 肿瘤细胞成像及治疗方面的应用。 背景技术 0002 癌症是严重危害人类健康的一大疾病， 每年全球约有 700 万人死于癌症， 其中 24发生在中国。目前治疗癌症主要有三种方法 ： 手术疗法、 化学疗法以及放射疗法。但是 过大剂量的化疗药物进入体内对人类有明显的副作用。因此发明一种能担载抗癌药物， 对 癌症进行有效治疗的并无副作用的荧光载体是人类共同关心的重大科学难题。 0003 近年来纳米材料。
6、作为一种新型材料， 引起了全世界的关注和研究热潮。而荧光 纳米材料更是因其具有良好的光学性等优点备受关注， 使得它在生物医药领域和纳米 光学器件中拥有很好的应用前景 ( 文献 1 ： Alivisatos A P Semiconductor clusters， nanocrystals， and quantum dotsJ.Science， 1996， 271(5251) ： 933-937)。半导体量子 点 ( 如 CdSe) 具有优越的光稳定性、 水溶性、 量子产率高等特点。但是最近有研究发现， 半导体量子点由于含有重金属元素， 在生物体内表现出毒副作用， 很大程度的限制了其在 生物医药方。
7、面的应用。所以寻找一种无毒副作用的荧光探针是亟待解决的问题。碳量子 点， 又称为碳点， 是碳纳米家族的新成员， 其平均粒径分布在 1-10nm。因为其大部分只含 有 C、 H、 O、 三种元素， 与传统的量子点相比， 它不仅保持了原有的荧光稳定和水溶性等有 点， 而且具有明显的低毒性和良好的生物相容性、 并易被功能化 ( 文献 2 ： S.N.Baker,G. A.Baker,Luminescent carbon nanodots:emergent nanolights.Angew.Chem.,Int. Ed.,2010,49(38),6726-6744.)。所以荧光碳点被认为是一种最为理想的。
8、用于肿瘤的荧光 标记和药物载体材料。 0004 近 十 年 来， 碳 点 的 合 成 方 法 有 了 大 幅 度 的 提 高， 例 如 水 热 法 ( 文 献 3 ： B.Bourlinos,A.Stassinopoulos,D.Anglos,et al.Surface Functionalized Carbogenic Quantum Dots.Small,2008,4(4):455-458.)， 氧化法 ( 文献 4 ： H.P.Liu,T.Ye,C. D.Mao,Fluorescent carbon nanoparticles derived from candle soot.Angew。
9、. Chem.,Int.Ed.,2007,46(34):6473-6475.)， 微波辅助法 ( 文献 5 ： Q.L.Wang,H.Z.Zheng,Y. J.Long,L.Y.Zhang,et al.Microwave-hydrothermal synthesis of fluorescent carbon dots from graphite oxide.Carbon,2011,49(9),3134-3140.)， 但普遍合成的条件比较繁 琐， 所需时间通常较长， 温度较高， 并不是一种绿色的合成方法。日常食品及饮品主要由碳 水化合物组成， 在其加工过程中能够形成碳点。 食品及饮品形成的碳。
10、点无毒副作用， 具有优 越的生物相容性。因此在生物成像及药物输送方面具有更广阔的应用。 发明内容 0005 本发明首次以啤酒中天然存在的碳点作为荧光性抗癌药物的荧光载体， 公开了一 种功能化荧光碳点药物载体的制备方法， 该啤酒碳点可以有效地担载抗癌药物， 并应用于 说 明 书 CN 105727313 A 3 2/4 页 4 肿瘤细胞的成像及治疗。 0006 本发明采取的技术方案为 ： 所提供的啤酒碳点的制备方法为 ： 将啤酒浓缩， 去除 不溶性杂质后， 通过分离提纯， 收集强荧光组分， 干燥得碳点 ； 将碳点与阿霉素按质量比 1000:11:10 混合， 溶解于去离子水中， 调节 pH 值至。
11、 3-12， 避光搅拌 0.572h， 加入有机 溶剂， 收集沉淀， 挥发干燥后得到担载阿霉素碳点。 0007 所述的浓缩方法是旋转蒸发、 冷冻干燥或喷雾干燥中的一种或二种以上的组合。 0008 所述的分离提纯方法为超滤、 透析、 超速离心、 凝胶色谱中的一种或任意二种及以 上方法的结合。 0009 所述的强荧光组分为啤酒中天然存在的碳量子点。 0010 所述的有机溶剂为甲醇、 乙醇、 正丙醇、 异丙醇、 乙腈、 丙酮中的一种或任意二种或 二种以上以任意比例组成的混合物， 有机溶剂的加入量与碳点的质量比为 1:1-50:1。 0011 所述的碳点， 可作为荧光药物载体， 在肿瘤荧光标记及治疗方。
12、面进行应用， 担载阿 霉素的碳点到达肿瘤部位， 缓慢释放药物， 运用纳米粒的 EPR 效应， 增强肿瘤治疗效果， 并 在成像方面有较好应用， 且可能会降低阿霉素的心肌毒性。 0012 本发明具有如下优点 ： 0013 (1) 本发明所需原料易购。 0014 (2) 本发明的碳点在啤酒加工过程中已经形成， 无须进行特意 0015 合成。 0016 (3) 本发明的啤酒碳点具有良好的荧光性及生物相容性。 0017 (4) 本发明的啤酒碳点具有极高的安全性。 0018 (5) 本发明的啤酒碳点担载阿霉素抗肿瘤效果明显。 附图说明 0019 图 1 是啤酒碳点的透射电子显微镜照片。 0020 图 2 。
13、是啤酒碳点的紫外， 荧光光谱。 0021 图 3 是啤酒碳点的荧光寿命图。 0022 图 4 是啤酒碳点的 XPS 图谱。 0023 图 5 是啤酒碳点的 FTIR 图谱。 0024 图 6 是啤酒碳点的 XRD 的图谱。 0025 图 7 是啤酒碳点的离子强度稳定图。 0026 图 8 是啤酒碳点的细胞毒性结果。 0027 图 9 是啤酒碳点担载阿霉素的细胞毒性结果。 0028 图 10 是啤酒碳点的细胞标记图。 具体实施方式 0029 下面通过具体实施方式对本发明做进一步说明。 0030 实施例 1 ： 功能化荧光碳点制备以及阿霉素担载 0031 (1) 将约 100mL 的青岛啤酒在 6。
14、0条件下旋蒸至约 5mL， 依次通过 0.45m、 0.22m的滤膜过滤， 收集滤液。 随后以葡聚糖Sephadex G-25凝胶色谱分离提纯， 在340nm 说 明 书 CN 105727313 A 4 3/4 页 5 激发光辅助下观察， 收集强荧光的组分， 冷冻干燥得碳点。 0032 (2) 将碳点与阿霉素以质量比 8 ： 1 的比例混合， 并溶解于去离子水中。用 1M NaOH 水溶液将 pH 值调至 8， 避光搅拌 24h。加入上述混合溶液 8 倍体积的无水乙醇， 高速离心 (10000rpm， 10min) 收集沉淀， 干燥后得到担载阿霉素碳点。 0033 实施例 2 ： 啤酒碳点性。
15、质的表征 0034 (1) 啤酒碳点的形态及大小尺寸 0035 图 1 是啤酒碳点的透射电子显微镜照片及粒径统计图， 结果显示， 经过分离提纯 的啤酒碳点大小均匀、 形态规则成圆球型， 统计得啤酒碳点粒径尺寸集中在 2-3nm。 0036 (2) 啤酒碳点的荧光光谱和紫外光谱特征 0037 图 2 是啤酒碳点的荧光光谱图和紫外光谱。图中啤酒碳点的荧光光谱随着激发 波长增加出现明显的红移， 咖啡碳点的最大激发波长出现在 340nm 处。紫外光谱图可见在 270nm 处出现了 n * 跃迁的特征吸收峰。 0038 (3) 啤酒碳点的荧光寿命 0039 图 3 是啤酒碳点的荧光寿命图。配置 6mg/。
16、mL 的啤酒碳点水溶液， 在 376nm 的激发 光下激发， 最大发射峰为 440nm 发射， 测得荧光寿命。经实验中发现啤酒碳点是三指数猝 灭， 经计算啤酒碳点的荧光寿命是 4.79ns。 0040 (4) 啤酒碳点的 X 射线光电子能谱 (XPS) 表征 0041 图 4 是啤酒碳点 XPS 的图谱。图中结果表明啤酒碳点中主要含有 C 和 O 两种元素 并且含有很少量的 N 元素。 0042 (1) 啤酒碳点的傅立叶变化红外光谱表征 0043 图 5 是啤酒碳点的红外图谱。图中结果表明经过纯化后的啤酒碳点的 3326cm-1含 有 O-H 和 N-H 的伸缩振动峰， 2927cm-1有饱和。
17、烷烃的伸缩振动峰， 1637cm -1有 N-H 的变形振 动峰， 1044cm-1有 C-O 的伸缩振动峰。 0044 (2) 啤酒碳点的 XRD 实验 0045 图 6 是啤酒碳点的 XRD 的图谱， 可见 2theta 22处仅有一馒头峰， 根据 XRD 图 谱， 说明此碳点是具有无定形碳的结构。 0046 (3) 啤酒碳点的 pH 稳定性实验 0047 图 7 是啤酒碳点的 pH 的稳定图。配置不同 pH(211) 的 B-R 缓冲溶液， 取碳点溶 液分别加入不同的 pH 溶液中 (2mg/mL)， 用荧光分光光度计测荧光强度， 取三次平均值。图 8中可以看出啤酒碳点在酸性条件下荧光较。
18、稳定， 在pH8处荧光强度明显下降， 碱性条件 下荧光强度较酸性条件低。 0048 实施例 3 ： 0049 细胞毒性实验 0050 选用 MCF-7 细胞和含有 10的胎牛血清的高糖 DMEM 培养基， 添加抗生素和非必 需氨基酸。将 MCF-7 细胞以 10000 个 / 孔接种于 96 孔板中， 待贴壁完全后 (12h)， 弃去原 培养基。 将碳点、 担载有阿霉素的碳点以及阿霉素分别以培养基溶解后， 再以培养基稀释成 不同浓度， 并加入到上述 96 孔板中。孵育 48h 后， 以 MTT 法测定增值率。如图 8 所示， 啤酒 碳点在较大浓度下 (50mg/mL)， MCF-7 细胞存活率。
19、仍能达到 80以上， 说明啤酒碳点毒性较 低。如图 9 所示， 啤酒碳点担载阿霉素后对 MCF-7 细胞的有较大的毒性。 说 明 书 CN 105727313 A 5 4/4 页 6 0051 实施例 4 ： 0052 啤 酒 碳 点 细 胞 标 记 实 验 ： MCF-7 细 胞 经 胰 酶 消 化 后 形 成 单 细 胞 悬 液， 以 1105cells/mL 的密度接种于培养皿中， 向每个培养基中加入 1ml 啤酒碳点浓度为 20mg/ ml 的培养基， 在 37， 5的 CO2条件下孵育 24h。随后倾去培养基， 并用磷酸盐缓冲液洗脱 2 次。将培养皿置于激光共聚焦显微镜下， 分别在 。
20、405nm， 488nm 波段下激发， 观察啤酒碳点 的细胞标记情况。如图 10 所示， 与对照组相比， 经啤酒碳点标记的细胞都能发出明显的荧 光， 在 405nm 波段激发下发出明显的蓝光， 在 488nm 波段激发下发出明显的绿光， 说明啤酒 碳点可以作为良好的荧光材料用于细胞荧光成像。 说 明 书 CN 105727313 A 6 1/5 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 105727313 A 7 2/5 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 105727313 A 8 3/5 页 9 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 105727313 A 9 4/5 页 10 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 105727313 A 10 5/5 页 11 图 9 图 10 说 明 书 附 图 CN 105727313 A 11 。