技术领域
本发明属于CD20阳性B细胞淋巴瘤靶向治疗领域，具体为靶向化疗CD20阳性B细胞淋巴瘤的纳米活性碳-阿霉素药物递送系统、其制备方法及用途。
背景技术
肿瘤已成为危害人类健康和生命的第二大疾病，肿瘤的高发病率和高死亡率已对人类健康和生活质量构成严重威胁，且因治疗困难，总体生存率偏低，治疗费用昂贵，已经成为患者和社会的重大负担。目前在临床肿瘤治疗和诊断中广泛应用的药物还多数为非选择性药物，有些药物在常规治疗剂量下即可对正常组织器官产生显著的毒副作用，所以提高药物的肿瘤选择性，减少其在非靶向部位的聚集是提高抗肿瘤药物疗效的关键。减少药物对非靶向部位的毒副作用，降低药物治疗剂量并减少给药次数，从而提高药物疗效，这种治疗方法即被称为肿瘤靶向治疗。尽管已有多种抗肿瘤药物上市，但是由于肿瘤靶向性不佳，肿瘤内蓄积能力较差，使得抗肿瘤效果不尽如人意。抗肿瘤药物的研发目前已成为全球科研人员关注的热点。随着材料学、药剂学的发展，采用纳米技术递送抗肿瘤药物已经成为研究热点。
相较正常组织，肿瘤具有独特的微环境：一方面，由于肿瘤细胞的快速增殖，使得肿瘤组织内血管和淋巴管不完整，从而导致物质容易从血管内渗漏进入肿瘤组织，且难以从淋巴管回流，导致肿瘤具有增强的渗透和滞留效应(enhanced permeability and retention effect，EPR效应)；另一方面，肿瘤淋巴管缺陷也导致肿瘤间质液回流困难，从而使得肿瘤间质压增高，影响药物在肿瘤内的扩散。同时肿瘤的快速增殖使得氧供不足，从而在肿瘤内部，尤其是血管缺乏的核心区，存在缺氧区域。该区域不仅化疗药物难以到达，而且肿瘤细胞更易耐受化疗药物，从而产生化疗盲区，导致肿瘤更易复发和转移。
肿瘤靶向药物递送策略通常分为两类：被动靶向和主动靶向。被动靶向系指依靠肿瘤部位的生理、病理特点以及纳米递药系统本身的性质，使纳米递药系统能够有效蓄积在肿瘤部位；而主动靶向则是指依靠纳米系统表面的特定分子与肿瘤部位的特定分子间、蛋白间的主动识别而结合，达到肿瘤组织、细胞中药物选择性浓集的目的。
现今在肿瘤靶向治疗领域，靶向抗肿瘤纳米颗粒研究正日益受到人们的普遍关注和重视。所谓的纳米颗粒，就是在尺寸在1～1000nm的颗粒，纳米颗粒可以将药物包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面，而靶向纳米颗粒则可以通过连接在其表面的靶向性分子(如抗体)与细胞表面特异性受体结合，在细胞摄取作用下进入细胞内，实现安全有效的靶向药物输送。
淋巴细胞发生病变即称为淋巴瘤，是一组起源于造血干/祖细胞的恶性克隆性疾病,严重危害人类健康。淋巴瘤在发病率、生存率、生物学行为、预后等方面存在高度异质性。按照“世界卫生组织淋巴系统肿瘤病理分类标准”，目前已知淋巴瘤有近70种病理类型，大体可分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkin‘s lymphoma,HL)和非霍奇金淋巴瘤(non Hodgkin’s lymphoma,NHL)两大类。在我国，霍奇金淋巴瘤占淋巴瘤病例数的10％，是一组疗效相对较好的恶性肿瘤；非霍奇金淋巴瘤占全部淋巴瘤病例的90％左右，近十几年来发病率逐年升高，发病率和死亡率居恶性肿瘤第5位，非霍奇金淋巴瘤又分B细胞淋巴瘤和T/NK细胞淋巴瘤，其中B细胞来源的淋巴瘤占非霍奇金淋巴瘤发病率的85％，因此本研究主要是针对CD20阳性的B细胞来源的非霍奇金淋巴瘤的靶向化疗。
恶性淋巴瘤患者常需接受以化疗为主的综合治疗。CHOP方案(环磷酰胺+多柔比星+长春新碱+泼尼松)一直是治疗NHL的标准方案，近年来，虽然有人先后报道了一些新的联合化疗方案，但其疗效均未超过CHOP方案。近年来出现的新药如脂质体阿霉素、抗CD20单抗美罗华(Rituximab)、偶联同位素的CD20单抗(zevalin)、蛋白酶体抑制剂万坷(Bortezomib)等的开发,非霍奇金淋巴瘤的化疗疗效已经得到了很大的提高。尽管如此,有数据统计表明B细胞淋巴瘤中的Burkitt淋巴瘤、弥漫大B细胞性淋巴瘤等亚型、多种T细胞淋巴瘤亚型及结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的5年生存率仍不足50％。尽管标准化疗及这些新药对NHL的有效率高，但复发率也高，且复发后再次治疗的缓解率低，缓解持续时间短、毒副反应大，患者耐受性差。开发和应用于临床的第二代和第三代化疗方案与CHOP方案相比，在提高生存率或延长生存时间方面并无优势，而毒性却有所增加，这提示传统细胞毒化疗药物提高恶性淋巴瘤临床疗效的空间十分有限。探索和发现治疗恶性淋巴瘤新的策略，成为目前亟待解决的问题。
抗体偶联药物(antibody-drug conjugates，ADC)由单克隆抗体、高效应的细胞毒性物质以及连接臂(Linker)三部分组成，它将抗体的靶向性与细胞毒性药物的抗肿瘤作用相结合，可以降低细胞毒性抗肿瘤药物的不良反应，提高肿瘤治疗的选择性，还能更好地应对靶向单抗的耐药性问题。ADC药物因其良好的靶向性及抗癌活性目前已成为抗肿瘤抗体药物研发的新热点和重要趋势，受到越来越多的关注。截止到2013年11月，已经有35个抗体偶联药物进入临床试验阶段。
CD20是B淋巴细胞和B淋巴瘤细胞表面特有的膜表面蛋白，不表达于造血干细胞、祖细胞、正常浆细胞以及人体其它正常组织，分子量为35kDa，它对B淋巴细胞的增殖和分化可能具有调节作用。CD20的功能一直都不能确定，甚至连天然配体都难觅踪影。CD20在B细胞表面的表达非常稳定，在与抗CD20抗体结合以后不易脱落与内化。
Anti-CD20单克隆抗体:抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体为可以特异结合CD20的IgG1κ型单抗，并可通过Fc段介导CD20阳性细胞的抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和补体依赖的细胞毒作用(CDC)。1997年已上市用于治疗NHL，单独使用治疗复发以及难治的NHL缓解率可达50％左右，若与化疗药物联用，在一些NHL亚型中治愈率可达100％。
Linker:目前大多数抗体偶联药物所采用的接头可以分为两大类:可切除接头与不可切除接头。可切除接头依赖抗体偶联药物进入细胞内后接头本身的降解获得游离的药物，包括腙键接头和二硫键接头，此类接头在循环系统中相对稳定，进入细胞内后依靠细胞内微环境(如溶酶体内低pH条件或细胞质中还原的环境)发生降解，从而释放药物。而不可切除接头则需要相应的酶降解接头或偶联物中的抗体部分来释放药物。
综上，尽管现有技术在B细胞淋巴瘤的治愈上已经有了较为突破的研究，但瘤靶向性不佳肿瘤内蓄积能力较差，使得抗肿瘤效果不尽如人意，故在该领域中丞待寻找到更好的传递系统，打破该领域发展的瓶颈。
发明内容
本发明为了解决上述技术问题，本发明提供的一种纳米活性靶向药物递送系统、制备方法及其用途，实现的目的为：选择具有被动淋巴靶向作用的纳米活性碳作为恶性B淋巴细胞淋巴瘤临床一线化疗药物阿霉素(DOX)的载体，利用功能化的磷脂对纳米活性碳进行修饰，同时利用磷脂的功能化氨基与人源化的anti-CD20上的羧基进行共价结合，使ACNP-DOX不仅发挥被动靶向淋巴组织的作用，而且能主动靶向识别B淋巴瘤细胞表面的标志物CD20抗原，从而起到高效杀伤癌细胞，降低化疗药物毒性的作用。
为得到上述技术效果，本发明采用的技术方案为，本发明提供的一种纳米活性碳靶向药物递送系统，原材料包括纳米活性碳、与纳米活性碳吸附的药物分子、修饰材料以及靶向分子。
纳米活性炭，自1985年荻原等报道将其应用于临床以来，常被用作淋巴引流的指示剂和药物缓释剂。是目前唯一应用于临床的碳材料。我们课题组在前期实验研究中发现纳米活性炭装载化疗药物的递送系统在具有纳米粒子所共有的组织靶向性和淋巴靶向性的基础上，具有可任意设定的释药浓度，恒定的释药速率常数，超长的释药半衰期和有效药物浓度保持时间等优势，但我们在研究中也发现纳米活性炭由于其超强的吸附性能使得制剂的水溶性和分散性较差，是我们一直努力克服的瓶颈，我们课题组近期实验发现用高分子功能性磷脂DSPE-PEG2000包裹纳米活性炭后，制剂的水溶性和稳定性均有很大的提高，如果将一部分DSPE-PEG2000用Dspe-PEG2000-NH2来代替，就可以利用-NH2与抗体上的-COOH基反应，将具有主动识别细胞表面抗原的抗体引入到装载药物的纳米粒子表面，这样就实现了对肿瘤细胞的主动靶向杀伤作用，同时再利用纳米活性炭载药后本身的超长的缓释作用以及PEG2000修饰的纳米粒在体内的长循环作用和稳定性，就可以同时实现对肿瘤细胞的主动和被动靶向杀伤作用。
本发明的发明人经过长期实验，令人惊奇的发现将纳米活性碳作为载体材料装载阿霉素，并进行一系列修饰后，可用于CD20阳性的淋巴瘤细胞的选择性靶向和有效清除。
进一步的，所述纳米活性碳为纯化活化的纳米活性碳。
优选的，所述纳米活性碳的粒径为100～400nm。
进一步的，所述药物分子包括阿霉素、阿霉素可药用盐、阿霉素可药用盐的衍生物中任意一种。阿霉素及其药用盐、药用盐衍生物都可以负载在纳米活性碳上，制得递送系统。
进一步的，所述修饰材料为两亲分子，优选的两亲分子包括二硬脂酰磷酸乙醇胺-N-甲氧基聚乙二醇、壳聚糖、聚乙二醇、普朗尼克嵌段聚合物、纤维素中一种或一种以上。
进一步的，所述靶向分子为能够特异性靶向CD20阳性的淋巴瘤分子。
优选的，所述能够特异性靶向CD20阳性的淋巴瘤分子包括特异性靶向B细胞伯基特淋巴瘤Raji的分子。
进一步的，所述靶向分子选自能够与淋巴瘤细胞表面的细胞标志物特异性结合的分子。优选的，所述够与淋巴瘤细胞表面的细胞标志物特异性结合的分子为能够和CD20、CD19特异性结合的分子。所述够和CD20、CD19特异性结合的分子包括单克隆抗体anti-CD20、anti-CD19。
进一步的，所述药物分子重量占所述纳米活性碳重量的10-40％。
进一步的，修饰材料与载有药物的纳米活性碳重量比为1：1—10：1。
进一步的，靶向分子与经过修饰材料修饰的载药纳米活性碳重量比为2：1-10：1。
进一步的，该系统的粒径为150-400nm。
本发明还公开了制备上述纳米活性碳靶向药物递送系统的方法，包括如下步骤，(1)通过非共价相互作用，将药物分子负载到纳米活性碳表面，得到载药纳米活性碳；
(2)利用修饰材料对载药纳米活性碳进行功能化修饰，得到修饰后的载药纳米活性碳；
(3)将靶向分子偶联到修饰材料表面，得到靶向药物递送系统。
进一步的，在步骤(1)前还包括利用高温对纳米炭进行活化和抽滤的步骤。
进一步的，所述步骤(1)的具体操作方法为：加20ml～100ml无菌生理盐水溶液溶解药物，将所得药物溶液与纯化的纳米活性碳混合，经冰浴超声、高速离心，去掉上清液，将载药的纳米活性碳用冷冻干燥机在-45℃冷冻干燥处理24h，得到载药纳米活性碳。本步骤的主要作用为除掉游离的未吸附的药物分子和生理盐水溶液，用纯水高速离心除掉未结合的药物，冷冻干燥得到固体的载药纳米活性碳。
所述步骤(2)的具体操作方法：将步骤1)得到的载药纳米活性碳加至修饰材料的氯仿甲醇溶液中，修饰材料在氯仿甲醇溶液中的质量浓度为0.5～5mg/ml，超声处理后，用旋转蒸发仪除掉有机溶液得到修饰后的载药纳米活性碳。
所述步骤(3)具体操作方法：将步骤2)得到的修饰载药纳米活性碳加至靶向分子水溶液中，经EDC/NHS活化反应后将反应液用透析袋在PBS溶液中透析，除去未结合的靶向分子及无机盐等得到靶向药物递送系统。
进一步的，所述步骤(1)中每次超声处理4h，高速离心的速率为16000rpm，离心时长为20min。
进一步的，所述步骤(2)中旋转蒸发时溶剂的温度≤35℃，氯仿与甲醇溶液的体积比为4：1。
本发明还发现，上述系统用于制备抗恶性肿瘤药物中的用途。
进一步的，所述CD20阳性B细胞淋巴瘤，进一步的为源于CD20阳性B细胞淋巴瘤。
进一步的，所述药物包括药学上可接受的载体或赋形剂。
采用上述技术方案，本发明包括的有益效果：本发明针对B细胞淋巴瘤表面标志物为靶点，选择纳米活性碳作为基本载体材料，阿霉素为抗癌药物，构建一种新的靶向药物递送系统。可以显著抑制CD20阳性的Raji细胞的增殖，诱导细胞凋亡。本发明为CD20阳性B细胞淋巴瘤的选择性靶向和有效清除提供一种新型的策略。
附图说明
图1为抗体偶联及DSPE-PEG2000修饰前后载药ACNP电镜对比图；
图2为纳米活性碳中ACNP-DOX-DSPE-PEG2000-anti-CD20的表征；
图中，1、ACNP在紫外光谱中的吸收峰；2、游离的DOX紫外光谱中的吸收峰；3、ACNP-DOX在紫外光谱中的吸收峰；4、ACNP-DOX-DSPE-anti-CD20在紫外光谱中的吸收峰；5、ACNP-DOX-DSPE在紫外光谱中的吸收峰；
图3为SDS-PAGE检测抗体与纳米粒的偶联的图谱；
图4为荧光光谱扫描各组碳纳米粒及抗体偶联碳纳米粒荧光特征吸收峰，图中，6、游离的DOX组吸收荧光的吸收峰；
图5为DOX从碳纳米粒及抗体偶联碳纳米粒中的释放曲线；图中，7、在PH5.5条件下AcnpDox在PBS中释放的曲线；8、在PH5.5条件下AcnpDoxDspePeg在PBS中释放的曲线；9、在PH5.5条件下AcnpDoxantiCD20在PBS中释放的曲线；10、在PH7.4条件下AcnpDox在PBS中释放的曲线；11、在PH7.4条件下AcnpDoxDspePeg在PBS中释放的曲线；12、在PH7.4条件下AcnpDoxantiCD20在PBS中释放的曲线；
图6为Raji细胞在光镜下细胞的形态结构观察图；
图7-A3为Raji细胞AFM高度图；
图7-A4为Raji细胞AFM高度图；
图7-A5为Raji细胞AFM相位图；
图7-A6为Raji细胞AFM相位图；
图7-A7为图7-A5的三维成像图；
图7-A8为图7-A6的三维成像图；
图8为CD20阴性的YTS细胞光镜图；
图9为CD20阴性的YTS细胞AFM图；
图10为Raji细胞CD20阳性率检测图；
图11为Yts细胞CD20阳性率检测图；
图12为Raji细胞培养72h光镜图；
图13为Raji细胞的AFM单细胞高度及三维图；
图14C1为正常的Raji细胞对照组C2为ACNP与Raji细胞共培养24h后的细胞超微结构图；
图15为Raji细胞与ACNP共培养后细胞生长曲线图；
图16为光镜下观察ACNP-DOX-DSPE-PEG2000-anti-CD20和其它制剂对B淋巴细胞瘤Raji作用48h时对其增殖的影响图；
图17为光镜下观察ACNP-DOX-DSPE-PEG2000-anti-CD20T淋巴瘤细胞Yts作用48h时对其增殖的影响图；
图18为用MTT方法检测了各种制剂对CD20阳性的Raji细胞的抑制作用；图中，13、AcnpDox对CD20阳性的Raji细胞的抑制作用；14、Acnp对CD20阳性的Raji细胞的抑制作用；15、AcnpDoxantiCD20对CD20阳性的Raji细胞的抑制作用；16、AcnpDspePeg对CD20阳性的Raji细胞的抑制作用；17、游离的DOX对对CD20阳性的Raji细胞的抑制作用；
图19为用MTT方法检测了各种制剂对CD20阴性的Yts细胞的抑制作用；图中，18、AcnpDox对CD20阴性的Yts细胞的抑制作用；19、Acnp对CD20阴性的Yts细胞的抑制作用；20、游离的DOX对CD20阴性的Yts细胞的抑制作用；21、AcnpDoxDspePeg对CD20阴性的Yts细胞的抑制作用；22、AcnpDoxantiCD20对CD20阴性的Yts细胞的抑制作用；
图20为各制剂中DOX在Raji细胞中的摄取情况图；
图21为DOX在Raji细胞中的摄取情况图；
图22为DOX在Yts细胞中的摄取情况图；
图23为含相同浓度DOX各组制剂处理后的Raji细胞的细胞核凋亡情况；
图24为含相同浓度DOX各组制剂处理后的Yts细胞的细胞核凋亡情况。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望再次对这些术语和短语更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
在本发明中，术语“纳米活性碳”具有本领域公知的含义，其例如记载于Zhong Y.,J Nanosci Nanotechnol,2010,10(12):8603-8609。
在本发明中，术语“纳米活性碳的粒径”是指通常是以其统计学平均值表示的。
在本发明中，术语“载药量”，如无另有指代，指在该药物递送系统中，以所述药物分子重量占所述纳米活性碳重量的百分数计，即药物分子重量/纳米活性碳重量×100％。
本发明中“修饰材料”是指具有良好生物相容性和生物可降解性，同时可用于改善纳米活性碳的水溶性的材料。
实施例一：本发明提供的一种纳米活性碳靶向药物递送系统，原材料包括纳米活性碳、与纳米活性碳吸附的药物分子、修饰材料以及靶向分子；药物分子重量占所述纳米活性碳重量的10％，修饰材料与载有药物的纳米活性碳重量比为1：1，靶向分子与经过修饰材料修饰的载药纳米活性碳重量比为1：1。
所述纳米活性碳为纯化活化的纳米活性碳，粒径为100nm。
所述药物分子为阿霉素；修饰材料为两亲分子，例如二硬脂酰磷酸乙醇胺-N-甲氧基聚乙二醇；所述靶向分子为能够特异性靶向CD20阳性的淋巴瘤分子，例如特异性靶向B细胞伯基特淋巴瘤Raji的分子。
最终得到的该递药系统粒径为150nm。
制备上述药物递送系统的方法，包括如下步骤，(1)通过非共价相互作用，将药物分子负载到纳米活性碳表面，得到载药纳米活性碳：加20ml无菌生理盐水溶液溶解药物，将所得药物溶液与纯化的纳米活性碳混合，经冰浴超声4h、在16000rpm高速离心20min后，去掉上清液，将载药的纳米活性碳进行用冷冻干燥机在-45℃冷冻干燥处理24h，得到载药纳米活性碳，-20℃储存备用。
所述在步骤(1)前还包括利用高温对纳米炭进行活化和抽滤的步骤：选择市售的纳米活性炭ACNP3g,混悬于2L的灭菌蒸馏水中，于室温悬浮沉淀72h,将悬浮液依次用0.25um和0.1um的微孔滤膜抽滤，得到粒径大小为100nm-150nm的ACNP,冷冻干燥后，-20℃备用。
(2)利用修饰材料对载药纳米活性碳进行功能化修饰，得到修饰后的载药纳米活性碳：将步骤1)得到的载药纳米活性碳加至修饰材料的氯仿甲醇溶液中，修饰材料在氯仿甲醇溶液中的质量浓度为0.5mg/ml，超声处理后，用旋转蒸发仪除掉有机溶液得到修饰后的载药纳米活性碳，旋转蒸发时溶剂的温度≤35℃，氯仿与甲醇溶液的体积比为4：1；
(3)将靶向分子偶联到修饰材料表面，得到靶向药物递送系统：将步骤2)得到的修饰载药纳米活性碳5ml加至浓度为10mg/ml靶向分子水溶液中，再加入1mg/ml EDC·HCL，室温搅拌30min后，用NaOH将反应液的pH值调至8.5中止活化反应,加入1.7mg NHS至混合液中，室温搅拌2h,终止反应。将反应液用截留100KDa的透析袋透析，在PBS溶液中透析12h，除去未结合的靶向分子及无机盐等得到靶向药物递送系统。
在本发明中，首先基于疏水纳米活性碳和阿霉素之间的非共价疏水相互作用将阿霉素负载到纳米活性碳内部的孔径中，然后将修饰材料缠绕包覆到载有阿霉素的纳米活性碳表面来改善它们的水溶性和生物相容性，最后靶向分子共价结合到外部修饰材料层来实现对靶细胞的主动靶向。
在本发明中，药物分子可以吸附于纳米活性碳的表面或者腔内。
实施例二：本发明提供的一种纳米活性碳靶向药物递送系统，原材料包括纳米活性碳、与纳米活性碳吸附的药物分子、修饰材料以及靶向分子；药物分子重量占所述纳米活性碳重量的40％，修饰材料与载有药物的纳米活性碳重量比为3：1，靶向分子与经过修饰材料修饰的载药纳米活性碳重量比为5：1。
所述纳米活性碳为纯化活化的纳米活性碳，粒径为400nm。
所述药物分子为阿霉素可药用的盐；修饰材料为两亲分子，例如壳聚糖；所述靶向分子选自能够与淋巴瘤细胞表面的细胞标志物特异性结合的分子，例如单克隆抗体anti-CD20。
本文所用术语“可药用盐”包括由药学上可接受的无机酸或有机酸或者无机碱或有机碱形成的常规的盐以及季铵的酸加成盐。合适的酸盐的更具体的例子包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、高氯酸、富马酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、羟基乙酸、甲酸、乳酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、扑酸、丙二酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、羟基萘甲酸、氢碘酸、苹果酸、steroic、鞣酸等的盐。其它的酸，如草酸，虽然其本身并非药学上可接受的，但可以用于制备用作中间体的盐，以获得本发明化合物及其可药用盐。合适的碱盐的更具体的例子包括钠、锂、钾、镁、铝、钙、锌、N,N’-二苄基乙二胺、氯代普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因盐。此后涉及到盐霉素可药用盐时，通常是指制药领域可使用，对产品或者对哺乳动物无害，或具有合理的或可接受的利益/风险比。例如本实施例选择阿霉素盐酸盐。
最终得到的该递药系统粒径为400nm。
制备上述药物递送系统的方法，包括如下步骤，(1)通过非共价相互作用，将药物分子负载到纳米活性碳表面，得到载药纳米活性碳：加100ml无菌生理盐水溶液溶解药物，将所得药物溶液与纯化的纳米活性碳混合，经冰浴超声4h、在16000rpm高速离心20min后，去掉上清液，将载药的纳米活性碳用冷冻干燥机在-45℃冷冻干燥处理24h，得到载药纳米活性碳，-20℃储存备用。
所述在步骤(1)前还包括利用高温对纳米炭进行活化和抽滤的步骤：选择市售的纳米活性炭ACNP3g,混悬于2L的灭菌蒸馏水中，于室温悬浮沉淀72h,将悬浮液依次用0.25um和0.1um的微孔滤膜抽滤，得到粒径大小为100nm-150nm的ACNP,冷冻干燥后，-20℃备用。
(2)利用修饰材料对载药纳米活性碳进行功能化修饰，得到修饰后的载药纳米活性碳：将步骤1)得到的载药纳米活性碳加至修饰材料的氯仿甲醇溶液中，修饰材料在氯仿甲醇溶液中的质量浓度为5mg/ml，超声处理后，用旋转蒸发仪除掉有机溶液得到修饰后的载药纳米活性碳，旋转蒸发时溶剂的温度≤35℃，氯仿与甲醇溶液的体积比为4：1；
(3)将靶向分子偶联到修饰材料表面，得到靶向药物递送系统：将步骤2)得到的修饰载药纳米活性碳5ml加至浓度为10mg/ml靶向分子水溶液中，再加入1mg/ml EDC·HCL，室温搅拌30min后，用NaOH将反应液的pH值调至8.5中止活化反应,加入1.7mg NHS至混合液中，室温搅拌2h,终止反应。将反应液用截留100KDa的透析袋透析，在PBS溶液中透析12h，除去未结合的靶向分子及无机盐等得到靶向药物递送系统。
实施例三：本发明提供的一种纳米活性碳靶向药物递送系统，原材料包括纳米活性碳、与纳米活性碳吸附的药物分子、修饰材料以及靶向分子；药物分子重量占所述纳米活性碳重量的25％，修饰材料与载有药物的纳米活性碳重量比为10：1，靶向分子与经过修饰材料修饰的载药纳米活性碳重量比为10：1。
所述纳米活性碳为纯化活化的纳米活性碳，粒径为250nm。
所述药物分子为阿霉素可药用的盐；修饰材料为两亲分子，例如壳聚糖；所述靶向分子选自能够与淋巴瘤细胞表面的细胞标志物特异性结合的分子，例如单克隆抗体anti-CD19。
本文所用术语“可药用盐”包括由药学上可接受的无机酸或有机酸或者无机碱或有机碱形成的常规的盐以及季铵的酸加成盐。合适的酸盐的更具体的例子包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、高氯酸、富马酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、羟基乙酸、甲酸、乳酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、扑酸、丙二酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、羟基萘甲酸、氢碘酸、苹果酸、steroic、鞣酸等的盐。其它的酸，如草酸，虽然其本身并非药学上可接受的，但可以用于制备用作中间体的盐，以获得本发明化合物及其可药用盐。合适的碱盐的更具体的例子包括钠、锂、钾、镁、铝、钙、锌、N,N’-二苄基乙二胺、氯代普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因盐。此后涉及到盐霉素可药用盐时，通常是指制药领域可使用，对产品或者对哺乳动物无害，或具有合理的或可接受的利益/风险比。例如本实施例选择阿霉素氢溴酸盐。
最终得到的该递药系统粒径为250nm。
制备上述药物递送系统的方法，包括如下步骤，(1)通过非共价相互作用，将药物分子负载到纳米活性碳表面，得到载药纳米活性碳：加50ml无菌生理盐水溶液溶解药物，将所得药物溶液与纯化的纳米活性碳混合，经冰浴超声4h、在16000rpm高速离心20min后，去掉上清液，将载药的纳米活性碳用冷冻干燥机在-45℃冷冻干燥处理24h，得到载药纳米活性碳，-20℃储存备用。
所述在步骤(1)前还包括利用高温对纳米炭进行活化和抽滤的步骤：选择市售的纳米活性炭ACNP3g,混悬于2L的灭菌蒸馏水中，于室温悬浮沉淀72h,将悬浮液依次用0.25um和0.1um的微孔滤膜抽滤，得到粒径大小为100nm-150nm的ACNP,冷冻干燥后，-20℃备用。
(2)利用修饰材料对载药纳米活性碳进行功能化修饰，得到修饰后的载药纳米活性碳：将步骤1)得到的载药纳米活性碳加至修饰材料的氯仿甲醇溶液中，修饰材料在氯仿甲醇溶液中的质量浓度为3mg/ml，超声处理后，用旋转蒸发仪除掉有机溶液得到修饰后的载药纳米活性碳，旋转蒸发时溶剂的温度≤35℃，氯仿与甲醇溶液的体积比为4：1；
(3)将靶向分子偶联到修饰材料表面，得到靶向药物递送系统：将步骤2)得到的修饰载药纳米活性碳5ml加至浓度为10mg/ml靶向分子水溶液中，再加入1mg/ml EDC·HCL，室温搅拌30min后，用NaOH将反应液的pH值调至8.5中止活化反应,加入1.7mg NHS至混合液中，室温搅拌2h,终止反应。将反应液用截留100KDa的透析袋透析，在PBS溶液中透析12h，除去未结合的靶向分子及无机盐等得到靶向药物递送系统。
实施例四：本发明提供的一种纳米活性碳靶向药物递送系统，原材料包括纳米活性碳、与纳米活性碳吸附的药物分子、修饰材料以及靶向分子；药物分子重量占所述纳米活性碳重量的20％，修饰材料与载有药物的纳米活性碳重量比为3：1，靶向分子与经过修饰材料修饰的载药纳米活性碳重量比为5：1。
所述纳米活性碳为纯化活化的纳米活性碳，粒径为150nm。
所述药物分子为阿霉素可药用的盐衍生物,如盐酸阿霉素；修饰材料为两亲分子，例如聚乙二醇；所述靶向分子选自能够与淋巴瘤细胞表面的细胞标志物特异性结合的分子，例如单克隆抗体anti-CD19。
最终得到的该递药系统粒径为200nm。
制备上述药物递送系统的方法，包括如下步骤，(1)通过非共价相互作用，将药物分子负载到纳米活性碳表面，得到载药纳米活性碳：加30ml无菌生理盐水溶液溶解药物，将所得药物溶液与纯化的纳米活性碳混合，经冰浴超声4h、在16000rpm高速离心20min后，去掉上清液，将载药的纳米活性碳用冷冻干燥机在-45℃冷冻干燥处理24h，得到载药纳米活性碳，-20℃储存备用。
所述在步骤(1)前还包括利用高温对纳米炭进行活化和抽滤的步骤：
选择市售的纳米活性炭ACNP3g,混悬于2L的灭菌蒸馏水中，于室温悬浮沉淀72h,将悬浮液依次用0.25um和0.1um的微孔滤膜抽滤，得到粒径大小为100nm-150nm的ACNP,冷冻干燥后，-20℃备用。
(2)利用修饰材料对载药纳米活性碳进行功能化修饰，得到修饰后的载药纳米活性碳：将步骤1)得到的载药纳米活性碳加至修饰材料的氯仿甲醇溶液中，修饰材料在氯仿甲醇溶液中的质量浓度为1.5mg/ml，超声处理后，
用旋转蒸发仪除掉有机溶液得到修饰后的载药纳米活性碳，旋转蒸发时溶剂的温度≤35℃，氯仿与甲醇溶液的体积比为4：1；
(3)将靶向分子偶联到修饰材料表面，得到靶向药物递送系统：将步骤2)得到的修饰载药纳米活性碳5ml加至浓度为10mg/ml靶向分子水溶液中，再加入1mg/ml EDC·HCL，室温搅拌30min后，用NaOH将反应液的pH值调至8.5中止活化反应,加入1.7mg NHS至混合液中，室温搅拌2h,终止反应。将反应液用截留100KDa的透析袋透析，在PBS溶液中透析12h，除去未结合的靶向分子及无机盐等得到靶向药物递送系统。
实施例五：本发明提供的一种纳米活性碳靶向药物递送系统，原材料包括纳米活性碳、与纳米活性碳吸附的药物分子、修饰材料以及靶向分子；药物分子重量占所述纳米活性碳重量的30％，修饰材料与载有药物的纳米活性碳重量比为3：1，靶向分子与经过修饰材料修饰的载药纳米活性碳重量比为5：1。
所述纳米活性碳为纯化活化的纳米活性碳，粒径为300nm。
所述药物分子为阿霉素可药用的盐；修饰材料为两亲分子，例如普朗尼克嵌段聚合物；所述靶向分子选自能够与淋巴瘤细胞表面的细胞标志物特异性结合的分子，例如单克隆抗体anti-CD19。
本文所用术语“可药用盐”包括由药学上可接受的无机酸或有机酸或者无机碱或有机碱形成的常规的盐以及季铵的酸加成盐。合适的酸盐的更具体的例子包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、高氯酸、富马酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、羟基乙酸、甲酸、乳酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、扑酸、丙二酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、羟基萘甲酸、氢碘酸、苹果酸、steroic、鞣酸等的盐。其它的酸，如草酸，虽然其本身并非药学上可接受的，但可以用于制备用作中间体的盐，以获得本发明化合物及其可药用盐。合适的碱盐的更具体的例子包括钠、锂、钾、镁、铝、钙、锌、N,N’-二苄基乙二胺、氯代普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因盐。此后涉及到盐霉素可药用盐时，通常是指制药领域可使用，对产品或者对哺乳动物无害，或具有合理的或可接受的利益/风险比。例如本实施例选择的阿霉素硫酸盐。
最终得到的该递药系统粒径为300nm。
制备上述药物递送系统的方法，包括如下步骤，(1)通过非共价相互作用，将药物分子负载到纳米活性碳表面，得到载药纳米活性碳：加80ml无菌生理盐水溶液溶解药物，将所得药物溶液与纯化的纳米活性碳混合，经冰浴超声4h、在16000rpm高速离心20min后，去掉上清液，将载药的纳米活性碳用冷冻干燥机在-45℃冷冻干燥处理24h，得到载药纳米活性碳，-20℃储存备用。
所述在步骤(1)前还包括利用高温对纳米炭进行活化和抽滤的步骤：选择市售的纳米活性炭ACNP3g,混悬于2L的灭菌蒸馏水中，于室温悬浮沉淀72h,将悬浮液依次用0.25um和0.1um的微孔滤膜抽滤，得到粒径大小为100nm-150nm的ACNP,冷冻干燥后，-20℃备用。
(2)利用修饰材料对载药纳米活性碳进行功能化修饰，得到修饰后的载药纳米活性碳：将步骤1)得到的载药纳米活性碳加至修饰材料的氯仿甲醇溶液中，修饰材料在氯仿甲醇溶液中的质量浓度为4mg/ml，超声处理后，用旋转蒸发仪除掉有机溶液得到修饰后的载药纳米活性碳，旋转蒸发时溶剂的温度≤35℃，氯仿与甲醇溶液的体积比为4：1；
(3)将靶向分子偶联到修饰材料表面，得到靶向药物递送系统：将步骤2)得到的修饰载药纳米活性碳5ml加至浓度为10mg/ml靶向分子水溶液中，再加入1mg/ml EDC·HCL，室温搅拌30min后，用NaOH将反应液的pH值调至8.5中止活化反应,加入1.7mg NHS至混合液中，室温搅拌2h,终止反应。将反应液用截留100KDa的透析袋透析，在PBS溶液中透析12h，除去未结合的靶向分子及无机盐等得到靶向药物递送系统。
实施例六：本发明提供的一种纳米活性碳靶向药物递送系统，原材料包括纳米活性碳、与纳米活性碳吸附的药物分子、修饰材料以及靶向分子；药物分子重量占所述纳米活性碳重量的35％，修饰材料与载有药物的纳米活性碳重量比为3：1，靶向分子与经过修饰材料修饰的载药纳米活性碳重量比为5：1。
所述纳米活性碳为纯化活化的纳米活性碳，粒径为350nm。
所述药物分子为阿霉素可药用的盐；修饰材料为两亲分子，例如纤维素；所述靶向分子选自能够与淋巴瘤细胞表面的细胞标志物特异性结合的分子，例如单克隆抗体anti-CD19。
本文所用术语“可药用盐”包括由药学上可接受的无机酸或有机酸或者无机碱或有机碱形成的常规的盐以及季铵的酸加成盐。合适的酸盐的更具体的例子包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、高氯酸、富马酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、羟基乙酸、甲酸、乳酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、扑酸、丙二酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、羟基萘甲酸、氢碘酸、苹果酸、steroic、鞣酸等的盐。其它的酸，如草酸，虽然其本身并非药学上可接受的，但可以用于制备用作中间体的盐，以获得本发明化合物及其可药用盐。合适的碱盐的更具体的例子包括钠、锂、钾、镁、铝、钙、锌、N,N’-二苄基乙二胺、氯代普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因盐。此后涉及到盐霉素可药用盐时，通常是指制药领域可使用，对产品或者对哺乳动物无害，或具有合理的或可接受的利益/风险比。例如本实施例选择的阿霉素磷酸盐。
最终得到的该递药系统粒径为350nm。
制备上述药物递送系统的方法，包括如下步骤，(1)通过非共价相互作用，将药物分子负载到纳米活性碳表面，得到载药纳米活性碳：加70ml无菌生理盐水溶液溶解药物，将所得药物溶液与纯化的纳米活性碳混合，经冰浴超声4h、在16000rpm高速离心20min后，去掉上清液，将载药的纳米活性碳用冷冻干燥机在-45℃冷冻干燥处理24h，得到载药纳米活性碳，-20℃储存备用。
所述在步骤(1)前还包括利用高温对纳米炭进行活化和抽滤的步骤：选择市售的纳米活性炭ACNP3g,混悬于2L的灭菌蒸馏水中，于室温悬浮沉淀72h,将悬浮液依次用0.25um和0.1um的微孔滤膜抽滤，得到粒径大小为100nm-150nm的ACNP,冷冻干燥后，-20℃备用。
(2)利用修饰材料对载药纳米活性碳进行功能化修饰，得到修饰后的载药纳米活性碳：将步骤1)得到的载药纳米活性碳加至修饰材料的氯仿甲醇溶液中，超声处理后，用旋转蒸发仪除掉有机溶液得到修饰后的载药纳米活性碳，旋转蒸发时溶剂的温度≤35℃，氯仿与甲醇溶液的体积比为4：1；
(3)将靶向分子偶联到修饰材料表面，得到靶向药物递送系统：将步骤2)得到的修饰载药纳米活性碳5ml加至浓度为10mg/ml靶向分子水溶液中，再加入1mg/ml EDC·HCL，室温搅拌30min后，用NaOH将反应液的pH值调至8.5中止活化反应,加入1.7mg NHS至混合液中，室温搅拌2h,终止反应。将反应液用截留100KDa的透析袋透析，在PBS溶液中透析12h，除去未结合的靶向分子及无机盐等得到靶向药物递送系统。
实施例七：本发明提供的一种纳米活性碳靶向药物递送系统，原材料包括纳米活性碳、与纳米活性碳吸附的药物分子、修饰材料以及靶向分子；药物分子重量占所述纳米活性碳重量的35％，修饰材料与载有药物的纳米活性碳重量比为3：1，靶向分子与经过修饰材料修饰的载药纳米活性碳重量比为5：1。
所述纳米活性碳为纯化活化的纳米活性碳，粒径为350nm。
所述药物分子为阿霉素可药用的盐；修饰材料为两亲分子，二硬脂酰磷酸乙醇胺-N-甲氧基聚乙二醇；所述靶向分子选自能够与淋巴瘤细胞表面的细胞标志物特异性结合的分子，例如单克隆抗体anti-CD20。
本文所用术语“可药用盐”包括由药学上可接受的无机酸或有机酸或者无机碱或有机碱形成的常规的盐以及季铵的酸加成盐。合适的酸盐的更具体的例子包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、高氯酸、富马酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、羟基乙酸、甲酸、乳酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、扑酸、丙二酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、羟基萘甲酸、氢碘酸、苹果酸、steroic、鞣酸等的盐。其它的酸，如草酸，虽然其本身并非药学上可接受的，但可以用于制备用作中间体的盐，以获得本发明化合物及其可药用盐。合适的碱盐的更具体的例子包括钠、锂、钾、镁、铝、钙、锌、N,N’-二苄基乙二胺、氯代普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因盐。此后涉及到盐霉素可药用盐时，通常是指制药领域可使用，对产品或者对哺乳动物无害，或具有合理的或可接受的利益/风险比。例如本实施例选择的阿霉素富马酸盐。
最终得到的该递药系统粒径为350nm。
制备上述药物递送系统的方法，包括如下步骤，(1)通过非共价相互作用，将药物分子负载到纳米活性碳表面，得到载药纳米活性碳：加60ml无菌生理盐水溶液溶解药物，将所得药物溶液与纯化的纳米活性碳混合，经冰浴超声4h、在16000rpm高速离心20min后，去掉上清液，将载药的纳米活性碳用冷冻干燥机在-45℃冷冻干燥处理24h，得到载药纳米活性碳，-20℃储存备用。
所述在步骤(1)前还包括利用高温对纳米炭进行活化和抽滤的步骤：选择市售的纳米活性炭ACNP3g,混悬于2L的灭菌蒸馏水中，于室温悬浮沉淀72h,将悬浮液依次用0.25um和0.1um的微孔滤膜抽滤，得到粒径大小为100nm-150nm的ACNP,冷冻干燥后，-20℃备用。
(2)利用修饰材料对载药纳米活性碳进行功能化修饰，得到修饰后的载药纳米活性碳：将步骤1)得到的载药纳米活性碳加至修饰材料的氯仿甲醇溶液中，修饰材料在氯仿甲醇溶液中的质量浓度为4.5mg/ml，超声处理后，用旋转蒸发仪除掉有机溶液得到修饰后的载药纳米活性碳，旋转蒸发时溶剂的温度≤35℃，氯仿与甲醇溶液的体积比为4：1；
(3)将靶向分子偶联到修饰材料表面，得到靶向药物递送系统：将步骤2)得到的修饰载药纳米活性碳5ml加至浓度为10mg/ml靶向分子水溶液中，再加入1mg/ml EDC·HCL，室温搅拌30min后，用NaOH将反应液的pH值调至8.5中止活化反应,加入1.7mg NHS至混合液中，室温搅拌2h,终止反应。将反应液用截留100KDa的透析袋透析，在PBS溶液中透析12h，除去未结合的靶向分子及无机盐等得到靶向药物递送系统。
本发明的药物递送系统用于制备制备抗恶性肿瘤药物中的用途，所述恶性肿瘤为源于CD20阳性B细胞淋巴瘤，例如伯基特淋巴瘤，药物还可以包括药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的试剂均是从现有市场中购买得到的，下表列举部分试剂：
以下选取实施例七制得的药物递送系统为例，采用试验说明本发明药物递送系统具有的有益效果。本发明附图中文字具有本领域技术人员公知的一般含义，如有与公知含义不一致的，以本发明下面解释的含义为准：
DOX阿霉素
ACNP纳米活性碳
DSPE-PEG2000 1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-甲氧基聚乙二醇
ACNP-DOX载阿霉素的纳米活性碳
ACNP-DOX-DSPE-PEG2000DSPE-PEG2000修饰的载阿霉素的纳米活性碳
Anti-CD20CD20单克隆抗体
ACNP-DOX-DSPE-PEG2000-anti-CD20偶联CD20单克隆抗体的DSPE-PEG2000修饰纳米活性碳载阿霉素
Release rate释放率
PE表达率
FITC异硫氰酸荧光素
Counts计数
FL2-Height荧光脉冲高度
Survival存活率
Free DOX游离阿霉素
Control对照
PBS磷酸盐缓冲液
Raji cell人源化的伯基特淋巴瘤细胞
Normal正常
Early apoptosis早期凋亡
Late apoptosis晚期凋亡
Dead cells坏死细胞
一、实施例七得到药物递送系统的表征：
1、采用Nano Series Zen 4003Zeta Sizer测定ACNP-DOX-DSPE-PEG2000-anti-CD20的粒径和Zeta电位。
2.采用分光光度法测定ACNP-DOX上阿霉素的载药量。
载药量按下式计算：
如表1所示，ACNP-DOX的粒径为140.2±19.1nm，与ACNP的粒径(138.6±28.6nm)较接近，这就表明DOX的加载并没有改变ACNP的粒径，这主要是因为ACNP内部由孔隙结构组成，DOX均被吸附到ACNP的孔隙内。而偶联了1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-methoxypolyethyleneglycol-2000(DSPE-PEG2000)和anti-CD20的ACNP-DOX NDDS(ACNP-DOX-DSPE-PEG2000-anti-CD20)的粒径为290.2±21.5nm,要比ACNP-DOX-DSPE-PEG2000(202.9±17.3nm)和ACNP-DOX(140.2±19.1nm)的粒径要大。
表1各种载药纳米活性碳的物理化学表征
二、透射电镜观察各种载药纳米活性碳颗粒的形态
采用透射电镜观察原型纳米活性碳(ACNP)、载阿霉素的纳米活性碳(ACNP-DOX)、修饰纳米活性碳(ACNP-DOX-DSPE-PEG2000)、抗体偶联载阿霉素的纳米活性碳(ACNP-DOX-DSPE-PEG2000-anti-CD20)的形态学与结构。
图1为功能化ACNP的透射电镜结果。从图中可以看出，透射电镜(Transmission electronmicroscopy，TEM)的结果表明对ACNP的DSPE-PEG和抗体修饰均改变了纳米粒的形态。ACNP和ACNP-DOX都是不规则形态，如图1A1和A2所示。由于碳颗粒特别容易聚集，通常我们仅在铜网的边缘才能找到分散均匀的碳颗粒。用DSPE-PEG2000修饰后的ACNP-DOX有很好的分散性和稳定性，并表现出立方体的形态，在电镜下很容易找到分散均匀的碳颗粒，如图1A3所示。而偶联了anti-CD20的ACNP-DOX在电镜下呈球形结构，如图1A4所示。为了更加清晰地观察抗体偶联纳米粒的形态，我们对样品进行了负染。发现ACNP-DOX-DSPE-PEG2000(图1A5)立方体结构表面没有突起。而在ACNP-DOX-DSPE-PEG2000-anti-CD20NDDS球形结构的表面有类似纤毛状的结构，如图1A6所示，尽管这种类似纤毛状的突起结构我们还不能确定是什么，但这种结构有可能就是位于ACNP-DOX-DSPE-PEG2000-anti-CD20表面偶联的抗体。图1B1和B2分别是图1A5和A6的高分辨率放大图像。
三、纳米活性碳制剂在PBS溶液中的溶解性和稳定性：而为考察抗体纳米粒的稳定性和溶解性，将制得的各组制剂在PBS中放置1m后，我们观察到单纯的ACNP和ACNP-DOX已经沉淀到瓶子底部，稳定性较差，而经DSPE-PEG2000修饰后的纳米粒和抗体偶联后的纳米粒稳定性较好，未看到底部有沉淀(B1为放置前，B2为放置后)。尽管在制备样品的时候，我们对每个制剂都进行了30min的冰浴超声，但ACNP和ACNP-DOX组制剂ACNP颗粒仍然在30min内沉积到瓶子底部，说明ACNP的稳定性和分散性很差，ACNP作为药物的载体必须要经过修饰以提高其在水溶液中的稳定性和可分散性。在本实验中我们还发现，ACNP在吸附阳离子药物DOX后，ACNP-DOX的Zeta值为-41.6±2.66，仅比ACNP的Zeta值-49.8±1.50略高，如表1所示，说明DOX的加载并没有提高ACNP的分散性和稳定性。而经过DSPE-PEG2000修饰后以及偶联anti-CD20抗体后，纳米粒的溶解性和稳定性都得到了提高。
五、实施例七纳米药物递送系统中抗体偶联的确证：如图2所示，各组纳米粒经高速离心洗涤后，游离的DOX组在紫外光谱中于波长480nm处有特征吸收峰，而其它的载药碳纳米粒组中的DOX被吸附进ACNP的孔隙中后，480nm的特征吸收峰消失。ACNP,ACNP-DOX,和ACNP-DOX-DSPE复合物在200-500之间都没有吸收峰，而只有ACNP-DOX-DSPE-anti-CD20在254nm表现出明显的蛋白特征吸收峰。我们利用阿霉素紫外吸收特点，可以计算DOX的载药量。接下来我们采用SDS-PAGE的方法来检测抗体是否偶联到纳米粒上。如图3所示，泳道1，2，3，4分别是浓度为2,4,3,and6μg/ml的游离anti-CD20样品,分别在分子量为25，75kDa处表现出明显的条带，25，75kDa分别代表了抗体anti-CD20的小亚基和大亚基。第5泳道为ACNP-DOX-DSPE-PEG2000-anti-CD20，NDDS样品，在25，75kDa处也有明显的条带，说明纳米粒上偶联了抗体CD20,而第6泳道为未偶联anti-CD20的ACNP-DOX-DSPE-PEG2000纳米粒，在25，75kDa处未见条带，说明该纳米粒是未偶联抗体的纳米粒。Anti-CD20的偶联效率为20.23±2.5％。
六：实施例七纳米药物递送系统(NDDS)中加载DOX的确证：
图4表明，游离DOX组在590nm处有很强的荧光，在其它的ACNP制剂组未见DOX的荧光吸收。可以利用这个性质用流式细胞术来比较各种纳米粒中阿霉素在细胞中的摄取以及考察抗体偶联纳米粒在CD20+和CD20-细胞中的靶向性。图5为DOX从ACNP-DOX,ACNP-DOX-DSPE-PEG2000,和ACNP-DOX-DSPE-PEG2000-anti-CD20中在pH7.4和5.5PBS(37℃)中的释放曲线，，7、在PH5.5条件下AcnpDox在PBS中释放的曲线；8、在PH5.5条件下AcnpDoxDspePeg在PBS中释放的曲线；9、在PH5.5条件下AcnpDoxantiCD20在PBS中释放的曲线；10、在PH7.4条件下AcnpDox在PBS中释放的曲线；11、在PH7.4条件下AcnpDoxDspePeg在PBS中释放的曲线；12、在PH7.4条件下AcnpDoxantiCD20在PBS中释放的曲线；均表现出相似的累积释放行为。在37℃，pH7.4的PBS介质中，48h，各组制剂中DOX的释放率均不超过20％，而在pH 5.5的PBS介质组，DOX的释放率在12h内就达到了60％。
这种由pH触发的DOX释放行为，是因为在酸性的环境中，DOX是带正电的，水溶性增大，位于ACNP表面上的-COOH可以被酸化，这样就可以减少药物和ACNP之间的相互作用使得DOX可以从ACNP的孔隙中很容易被释放出来。经DSPE-PEG2000修饰后的ACNP还可以减少ACNP在水中的聚集以提高DOX的释放。这种pH敏感的DOX释放行为是非常重要的，因为肿瘤组织和细胞溶酶体的微环境都是偏酸性的。
DOX在ACNP-DOX-DSPE-PEG2000-anti-CD20中的载药量是20.1±1.6％，比DOX在ACNP-DOX-DSPE-PEG2000(29.8±2.56％)和ACNP-DOX(31.2±2.64％)中的载药率要低，如表1所示。这主要是由于加入偶联的抗体后整体复合物的体积增大所致。从表1我们还看到ACNP-DOX-DSPE-PEG2000-anti-CD20的电势(6.72±1.1mV)明显地发生变化，这跟制剂的制备相一致的。
七、CD20阳性Raji和CD20阴性Yts细胞的培养和鉴定
图6为Raji细胞的光镜、图7-A3至图7-A8为Raji细胞的AFM成像，A1和A2为光镜下Raji细胞的形态结构观察。光镜下观察，正常的raji细胞呈通透的球状，表面有不光滑，活力高的细胞聚集成团生长，呈葡萄状。将正常培养的Raji细胞制成单细胞悬液后，滴在经过粘附处理过的盖玻片上固定后，原子显微镜观察发现Raji细胞表面不光滑，有孔洞，有的可清楚看到细胞表面有絮状的向四周伸展的粘附物质，如图7-A3至图7-A8所示，其中图7-A3,图7-A4为AFM高度图，图7-A5,图7-A6为AFM相位图，图7-A7和图7-A8为图7-A5,图7-A6的三维成像图。图8、图9为本实验中的CD20阴性的YTS细胞光镜和AFM图，图A1,A2光镜下的YTS细胞，A3,A4为AFM相位图，我们发现YTS细胞比Raji细胞体积大，表面光滑，粘附性低。接下来我们用FITC标记的anti-CD20检测了Raji和Yts细胞膜上的CD20抗原阳性表达率，如图10、11所示：流式细胞术结果显示，Raji细胞的CD20阳性率为96.71％，Yts细胞的CD20阳性率仅为0.06％，Raji细胞可用于下一步靶向性试验的研究，Yts细胞可用于阴性细胞对照。
八、纳米活性碳的细胞毒性研究
图12、图13、图14、图15为ACNP载体对raji细胞毒性体外研究的光镜结果。A1为正常培养72h的Raji细胞，细胞活力很强，聚集成串样生长。A2，A3分别为与10，20μg/ml ACNP共培养72h后的Raji细胞，光镜下我们看到细胞生长良好，与对照组无明显差异。B1为正常Raji细胞的AFM单细胞高度图，B2为B1的三维图像，B3为与ACNP共培养的Raji细胞的AFM单细胞高度图，图B4为B3的三维图像，B1和B3，B2和B4没有明显的变化。C2为ACNP与Raji细胞共培养24h后的细胞超微结构，C1为正常的Raji细胞对照组，C2和C1中的细胞核，线粒体和溶酶体均未出现明显变化，C2中的箭头所示为进入细胞细胞核内的ACNP。图15为ACNP载体细胞毒性的MTT试验，所示Raji细胞即使在与最高浓度的(100μg/ml)ACNP共培养后，细胞的生长与正常对照组相比并没有出现明显的抑制，说明ACNP可以作为一种潜在的药物载体，没有直接的毒性。
九、ACNP-DOX-DSPE-PEG2000-anti-CD20对Raji和Yts细胞的体外作用研究
图16、17为光镜下观察ACNP-DOX-DSPE-PEG2000-anti-CD20和其它制剂对B淋巴细胞瘤Raji和T淋巴瘤细胞Yts作用48h时对其增殖的影响。光镜下我们观察到与ACNP-DOX组(图16b和图17b)相比，ACNP-DOX-DSPE-PEG2000组和游离DOX对CD20阳性的Raji(图16c和图17d)和CD20阴性的Yts(图17c和图17d)细胞均有很强的抑制作用,单独应用CD20抗体组对Raji(图16f)和Yts细胞(图17f)仅有微弱的细胞杀伤作用，抗体偶联高分子磷脂包裹的ACNP载药组(ACNP-DOX-DSPE-PEG2000-anti-cd20)处理的Raji细胞(图16e)已不再呈现粘附状态，活力明显下降，细胞数量减少，而对Yts细胞(图17e)的作用与正常对照组相比变化较小，说明ACNP-DOX-DSPE-PEG2000-anti-cd20对CD20阳性的细胞具有选择性。
图18、19为用MTT方法检测了各种制剂对CD20阳性的Raji细胞和CD20阴性的Yts细胞的抑制作用。从图18和19中，我们发现游离DOX对CD20阳性Raji细胞和CD20阴性的Yts细胞均有强大的细胞毒作用，这也表明游离的DOX对细胞是没有细胞选择性的。这一发现与DOX在临床应用中具有毒性大、代谢快、有效作用持续时间短等副作用相一致。ACNP-DOX-DSPE-PEG2000-anti-CD20组对Raji细胞的抑制作用与游离DOX很接近，而对Yts细胞的作用很弱，这表明抗体偶联的NDDS对CD20阳性的Raji细胞具有靶向杀伤作用。未偶联抗体的ACNP-DOX,ACNP-DOX-DSPE-PEG2000对Raji和Yts有一定的杀伤作用，这与ACNP可作为一种可持续释放药物载体的性质是相一致的。在MTT实验中，OD值反应的是细胞活力的参数，在高剂量的ACNP组，我们发现其OD值会比低剂量的ACNP组相应偏高，这主要是因为活性碳是一种黑色的材料，对OD值的测量会产生影响。
十、激光共聚焦显微镜研究ACNP-DOX-DSPE-PEG2000-anti-CD20对Raji细胞的靶向性
图20是比较各制剂中DOX在Raji细胞中的摄取情况。由于DOX本身有荧光的性质，所以我们就利用共聚焦显微镜观察到的细胞核中DOX的荧光强弱来评价各个制剂中DOX在Raji细胞中的摄取情况。在细胞核中红色荧光为DOX发出来的，蓝色荧光为细胞核被核染色剂染色后发出的荧光。被抗体偶联纳米活性碳制剂(ACNP-DOX-DSPE-PEG2000-anti-CD20)e处理过的Raji细胞核中的红色荧光为所有制剂中最强的，即说明细胞核中摄取的DOX的浓度最大，接近于游离DOX处理组(c)细胞核中的DOX浓度。ACNP-DOX组(b)处理过的Raji细胞核中DOX的荧光在所有制剂中是最弱的，经修饰后的ACNP-DOX处理组(ACNP-DOX-DSPE-PEG2000，d)比ACNP-DOX处理组细胞荧光强，这与ACNP是一种缓释纳米材料有关。经游离anti-CD20预处理过的Raji细胞组(d)细胞核内的DOX发出的红色荧光明显减弱，主要是由于游离anti-CD20阻断了Raji细胞表面的CD20抗原，减少了细胞对DOX的摄取。这些结果表明ACNP-DOX-DSPE-PEG2000-anti-CD20的靶向作用是来自于该制剂对CD20阳性的细胞的选择性。
十一、流式细胞术评价各制剂中DOX在Raji和Yts细胞中的摄取情况：图21、22图分别为DOX在Raji和Yts细胞中的摄取情况，如图21中所示，ACNP-DOX-DSPE-PEG2000-anti-CD20处理过的Raji细胞中DOX的荧光值仅低于游离DOX组，ACNP-DOX-DSPE-PEG2000-anti-CD20处理过的Yts细胞中DOX的荧光值是最低的，这说明ACNP-DOX-DSPE-PEG2000-anti-CD20对CD20阳性的Raji细胞具有显著的靶向选择性。
十二、荧光显微镜观察各制剂引起Raji和Yts细胞核的凋亡情况
图23、24为含相同浓度DOX(1μg/ml)各组制剂处理后的Raji(图23)和Yts(图24)细胞的细胞核凋亡情况。对照组(图23a，图24a)和ACNP-DSPE-PEG2000(图图23e，图24e)处理组Raji和Yts细胞未见核凋亡，表现为正常的细胞核形态。这表明ACNP的毒性很小，与前面的MTT、AFM以及光镜的实验结果一致。ACNP-DOX(图23d，图24d)组可引起Raji细胞和Yts细胞的早期核凋亡的出现，说明ACNP是药物的缓释载体，与前面的实验结果相一致。游离DOX(图23f，图24f)，ACNP-DOX-DSPE-PEG2000组(图23b，图24b)处理后的Raji和Yts细胞，ACNP-DOX-DSPE-PEG2000-anti-CD20处理后的Raji细胞(图23c)均出现不同程度的核皱缩、染色质浓缩、核膜破裂，以及凋亡小体的出现,而在ACNP-DOX-DSPE-PEG2000-anti-CD20处理后Yts细胞(图24c),细胞核的变化不明显，说明ACNP-DOX-DSPE-PEG2000-anti-CD20对CD20+的Raji细胞是有选择性的。ACNP-DOX-DSPE-PEG2000对细胞没有选择性。
结论：
针对CD20阳性的淋巴瘤治疗，本发明以纳米材料为载体，能将抗肿瘤药物选择性地递送到癌组织，并渗入癌组织内部；将癌细胞特异性标志物的靶向抗体分子连接于纳米载体，使进入癌组织的该药物递送系统能进入癌细胞；将抗肿瘤药物结合于纳米载体，有效地避免被转运子泵出癌细胞；利用纳米载体对抗肿瘤药物的缓释功能，持续保持癌细胞内的药物浓度，有效地对抗癌细胞，减少抗肿瘤药物的毒性。
体外实验结果表明DSPE-PEG2000修饰的ACNP聚合物，是一种同时转运单克隆抗体和化疗药物的有效纳米载体，可用于靶向特殊的细胞。在本实验中是靶向CD20阳性的B淋巴瘤细胞，这种药物递送系统未来能否用于靶向治疗还取决于单克隆抗体识别特殊肿瘤细胞的发展情况，比如在体内实验时这种抗体能否识别正常的淋巴细胞和恶性的淋巴细胞。
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