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一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物及制备方法和应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201511022287.9 (22)申请日 2015.12.30 (65)同一申请的已公布的文献号申请公布号 CN 105641704 A (43)申请公布日 2016.06.08 (73)专利权人上海理工大学地址 200093 上海市杨浦区军工路516号专利权人上海交通大学附属第一人民医院 (72)发明人王世革李想安潇刘璐黄明贤 (74)专利代理机构上海申汇专利代理有限公司 31001 代理人吴宝根 (51)Int.Cl. A61K 47/34(2017.。

2、01) A61K 31/704(2006.01) A61P 35/00(2006.01) 审查员高玉婕 (54)发明名称一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物及制备方法和应用 (57)摘要本发明一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物，由聚乳酸-羟基乙酸、泡腾物、化疗药物和有机溶剂组成，聚乳酸-羟基乙酸在有机溶剂中的浓度为0.1g/mL1.0 g/mL；泡腾物由有机酸和碱性物质组成，有机酸的在有机溶剂中的浓度为 0.1g/mL0.5 g/mL，所述的碱性物质在有机溶剂中的浓度为0.1g/mL0.5 g/mL；所述的化疗药物在有机溶剂中的浓度为1-10mg/mL。还提供了一种。

3、产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物和一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物支架材料的制备方法。在HIFU的刺激下，支架材料中泡腾物产生气泡而增强HIFU对肿瘤的消融效果；负载的化疗药物释放出来，赋予支架化疗治疗肿瘤的能力。权利要求书2页说明书5页附图7页 CN 105641704 B 2018.08.28 CN 105641704 B 1.一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物，其特征在于：由聚乳酸-羟基乙酸、泡腾物、化疗药物和有机溶剂组成，所述的有机溶剂为1-甲基-2-吡咯烷酮或N,N-二甲基甲酰胺中的任一种；所述的聚乳酸-羟基乙酸在有机溶剂中的浓度为0.1g/mL1.0 g/。

4、mL；所述的泡腾物由有机酸和碱性物质组成，所述的有机酸在有机溶剂中的浓度为0.1g/mL0.5 g/mL，所述的碱性物质在有机溶剂中的的浓度为0.1g/mL0.5 g/mL，所述的有机酸为柠檬酸、酒石酸、枸橼酸、果酸、或者谷氨酸中的任一种；所述的碱性物质为碳酸钠、或者碳酸氢钠中的任一种；所述的化疗药物为盐酸阿霉素、紫杉醇、喜树碱、或者康普瑞汀中的任一种，所述的化疗药物在有机溶剂中的浓度为1-10mg/mL。 2.一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物的制备方法，其特征在于包括如下步骤： 1）将聚乳酸-羟基乙酸溶解于有机溶剂中，搅拌使聚乳酸-羟基乙酸完全溶解。

5、，所述的聚乳酸-羟基乙酸在有机溶剂中的浓度为0.1g/mL1.0 g/mL；所述的有机溶剂为1-甲基- 2-吡咯烷酮或N,N-二甲基甲酰胺中的任一种； 2）在搅拌下，将泡腾物和化疗药物均匀分散于步骤（1）所得的聚乳酸-羟基乙酸溶液中，得聚乳酸-羟基乙酸/泡腾/化疗药物溶液；所述的泡腾物由有机酸和碱性物质组成，分散后，所述的有机酸的浓度为0.1g/mL0.5 g/mL，所述的碱性物质的浓度为0.1g/mL0.5 g/mL，所述的有机酸为柠檬酸、酒石酸、枸橼酸、果酸、或者谷氨酸中的任一种；所述的碱性物质为碳酸钠、或者碳酸氢钠中的任一种；所述的化疗药物为。

6、盐酸阿霉素、紫杉醇、喜树碱、或者康普瑞汀中的任一种，分散后，所述的化疗药物的浓度为1-10mg/mL。 3.根据权利要求2所述的一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物的制备方法，其特征在于：所述的聚乳酸-羟基乙酸的分子量为100010000道尔顿，其中，单体乳酸和羟基乙酸的摩尔比为10:9090:10。 4.根据权利要求2所述的一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的搅拌为磁力搅拌，其速率为50-200 r/min，时间为30分钟-12小时。 5.一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物支架材料的制备方法，其特征在于包括如下步骤： 1）将聚乳。

7、酸-羟基乙酸溶解于有机溶剂中，搅拌使聚乳酸-羟基乙酸完全溶解，所述的聚乳酸-羟基乙酸在有机溶剂中的浓度为0.1g/mL1.0 g/mL；所述的有机溶剂为1-甲基- 2-吡咯烷酮或N,N-二甲基甲酰胺中的任一种； 2）在搅拌下，将泡腾物和化疗药物均匀分散于步骤（1）所得的聚乳酸-羟基乙酸溶液中，得聚乳酸-羟基乙酸/泡腾/化疗药物溶液；所述的泡腾物由有机酸和碱性物质组成，分散后，所述的有机酸的浓度为0.1g/mL0.5 g/mL，所述的碱性物质的浓度为0.1g/mL0.5 g/mL，所述的有机酸为柠檬酸、酒石酸、枸橼酸、果酸、或者谷氨酸中的任一种；所述的碱。

8、性物质为碳酸钠、或者碳酸氢钠中的任一种；所述的化疗药物为盐酸阿霉素、紫杉醇、喜树碱、或者康普瑞汀中的任一种，分散后，所述的化疗药物的浓度为1-10mg/mL； 3）将该聚乳酸-羟基乙酸/泡腾/化疗药物溶液加入水中，所述的聚乳酸-羟基乙酸/泡腾/化疗药物溶液和水的体积比为1:1030，形成产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物支架材料。 6.权利要求2所述的方法获得的一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物在制备治疗肿瘤药物中的应用。 7.通过权利要求5所述的方法获得的一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物支架材料在制权利要求书 1/2 页 2 CN 105641704 B 2 备治疗肿瘤。

9、药物中的应用。权利要求书 2/2 页 3 CN 105641704 B 3 一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物及制备方法和应用技术领域 0001 本发明属于药物化学领域，涉及一种治疗肿瘤的药物，具体来说是一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物及制备方法和应用。背景技术 0002 众所周知，癌症已成为当今社会威胁人类生命健康的巨大杀手。随着材料科学与纳米工程的发展，发展高疗效、低毒副作用的肿瘤诊疗方法，对提高人类的生活质量和发展国民经济等具有重要意义。高强度聚焦超声（High-intensity focused ultrasound， HIFU）治疗肿瘤是近年来兴起的。

10、一种肿瘤微/无创治疗方法，它利用超声波具有良好的方向性，穿透能力强等特点，通过一定方法将超声波聚焦于肿瘤靶点处，并以最小侵入或非侵入性方法的方式向组织中沉积声能。高强度声能量几乎被完全聚焦到病变组织处，并产生瞬间的高温高压，致使病变组织发生大量的物理、化学变化而坏死。自上世纪40年代被用于局部肿瘤治疗后， HIFU已成为一种临床上广泛使用的肿瘤治疗手段。相对于传统的手术治疗、化疗、放疗以及其他微无创治疗手段， HIFU治疗肿瘤所具有的操作简单、无辐射、无创、适形热消融、实时影像监控等技术特点顺应了当前高疗效、低毒副作用治疗肿瘤的发展要求，成为了。

11、医学科研界研究的热点。 0003 目前，临床上多采用核磁共振成像（MRI）或超声成像（US）介导下实现肿瘤的HIFU 消融。适用的治疗范围也从最初的胰腺癌发展到当前的肝癌、乳腺癌、骨肉瘤及子宫肌瘤等多种肿瘤。然而， HIFU在临床肿瘤治疗应用中的推广还需要解决下面两个重要问题。首先，精准的HIFU治疗需要利用先进的临床成像系统（如US、 MRI、计算机断层扫描成像（CT）、正电子发射计算机断层显像（PET-CT）等）对肿瘤病灶进行定位；其次，在实际HIFU治疗中，超声波在传播过程中的能量降低使其难以消除深部病变组织。针对上述问题，除了进行高。

12、昂的仪器设备升级外，研究者开始开发各种各样的HIFU增效剂，以实现在较小的超声功率下，达到满意的肿瘤消融效果。在治疗中， HIFU治疗的空化效应是指HIFU的正负声压变换会产生强大的空化效应而形成大量气泡。这些气泡会吸收声能量，并振动、膨胀、破裂，而增加焦点组织的热量、对肿瘤组织造成更大的损伤。研究表明，微纳米生物材料能够改变组织的声学环境，增加超声能量在病变组织中的沉积，增加肿瘤的消融效果。 0004 基于这一事实，从纳米技术的角度出发，研究者们将气泡或可以产生气泡的纳米材料通过表面靶向配体作用主动输运或者利用肿瘤组织部位血管增强的通透性（即EPR。

13、效应）被动富集到肿瘤组织内。在HIFU的刺激下，这些气泡与HIFU发生复杂反应而增加HIFU对肿瘤组织的消融效果。例如，声诺维（即注射用六氟化硫微泡）是一种已经商品化的超声造影剂。研究表明，除了作为临床超声造影剂外，声诺维还可以减少 HIFU治疗子宫肌瘤时的超声能量，提高 HIFU 消融子宫肌瘤的效果。又如，以无机材料介孔二氧化硅为载体，通过真空灌注温敏性全氟戊烷， Shi等人设计了出了基于介孔二氧化硅的HIFU增效剂，在体外实验和动物实验中增强了HIFU对肿瘤的消融效果。 Zheng等人通过用磷脂装载氟碳化合物实现了肿瘤的超声成像和HIFU增效。。

14、然而，大部分注射的无机材料都被肝脏等器官捕捉；此说明书 1/5 页 4 CN 105641704 B 4 外，有机微泡的粒径较大（微米级别），难以通过肿瘤的血管内皮间隙，导致在肿瘤内气泡的富集量很少。而且，温敏型全氟化合物热稳定性差，在材料的储存过程中气泡容易破裂，进一步的HIFU临床应用受到了很大的制约。 0005 泡腾崩解剂通常是有机酸（如柠檬酸）和碳酸钠、碳酸氢钠组成的混合物；泡腾崩解剂放入水后会发生剧烈的复分解反应，产生大量二氧化碳。这种气泡的产生是一种瞬时的变化过程，无法直接应用于HIFU治疗。基于上述技术问题，设想可以通过一定的。

15、技术手段，将泡腾崩解剂束缚于肿瘤部位，并控制气泡的产生速度，以应用于HIFU治疗。聚乳酸羟基乙酸共聚物（poly(lactide-co-glycolide)， PLGA）是一种已经被美国食品与药物管理局 (FDA)批准使用，具有良好的生物相容性和生物降解性的高分子聚合物。作为一种优良的生物医用材料， PLGA已被广泛地应用于可植入材料和组织工程用支架材料领域。 PLGA具有一个显著的物理特性，即强疏水性。截止目前，尚没有文献报道通过控制泡腾的崩解、融化，利用其气泡增加HIFU对肿瘤的消融效果。发明内容 0006 针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了。

16、一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物及制备方法和应用，所述的这种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物及制备方法和应用解决了现有技术中采用高强度聚焦超声治疗肿瘤的效果不佳的技术问题。 0007 本发明提供了一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物，由聚乳酸-羟基乙酸、泡腾物、化疗药物和有机溶剂组成，所述的有机溶剂为1-甲基-2-吡咯烷酮或N,N-二甲基甲酰胺中的任一种；所述的聚乳酸-羟基乙酸在有机溶剂中的浓度为0.1g/mL1.0 g/mL；所述的泡腾物由有机酸和碱性物质组成，所述的有机酸的在有机溶剂中的浓度为0.1g/mL0.5 g/ mL，所述的碱性物质在有机溶剂中的的浓度为0.1g/mL0。

17、.5 g/mL，所述的有机酸为柠檬酸、酒石酸、枸橼酸、果酸、或者谷氨酸中的任一种；所述的碱性物质为碳酸钠、或者碳酸氢钠中的任一种；所述的化疗药物为盐酸阿霉素、紫杉醇、喜树碱、或者康普瑞汀中的任一种，所述的化疗药物的浓度在有机溶剂中的浓度为1-10mg/mL。 0008 本发明提供了一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物的制备方法，包括如下步骤： 0009 1)将聚乳酸-羟基乙酸溶解于有机溶剂中，搅拌使聚乳酸-羟基乙酸完全溶解，所述的聚乳酸-羟基乙酸在有机溶剂中的浓度为0.1g/mL1.0 g/mL；所述的有机溶剂为1-甲基-2-吡咯烷酮或N,N-二甲基甲酰胺中的。

18、任一种； 0010 2)在搅拌下，将泡腾物和化疗药物均匀分散于步骤（1）所得的聚乳酸-羟基乙酸溶液中，得聚乳酸-羟基乙酸/泡腾/化疗药物溶液；所述的泡腾物由有机酸和碱性物质组成，分散后，所述的有机酸的浓度为0.1g/mL0.5 g/mL，所述的碱性物质的浓度为0.1g/mL 0.5 g/mL，所述的有机酸为柠檬酸、酒石酸、枸橼酸、果酸、或者谷氨酸中的任一种；所述的碱性物质为碳酸钠、或者碳酸氢钠中的任一种；所述的化疗药物为盐酸阿霉素、紫杉醇、喜树碱、或者康普瑞汀中的任一种，分散后，所述的化疗药物的浓度为1-10mg/mL。 0011 进一步的，所。

19、述的聚乳酸-羟基乙酸的分子量为100010000道尔顿，其中，单体乳酸和羟基乙酸的摩尔比为10:9090:10。 0012 进一步的，步骤（1）中所述的搅拌为磁力搅拌，其速率为50-200 r/min，时间为30 分钟-12小时。说明书 2/5 页 5 CN 105641704 B 5 0013 本发明还提供了一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物支架材料的制备方法，包括如下步骤： 0014 1)将聚乳酸-羟基乙酸溶解于有机溶剂中，搅拌使PLGA完全溶解，所述的聚乳酸- 羟基乙酸在有机溶剂中的浓度为0.1g/mL1.0 g/mL；所述的有机溶剂为1-甲基-2-吡咯烷酮。

20、或N,N-二甲基甲酰胺中的任一种； 0015 2)在搅拌下，将泡腾物和化疗药物均匀分散于步骤（1）所得的PLGA溶液中，得聚乳酸-羟基乙酸/泡腾/化疗药物溶液；所述的泡腾物由有机酸和碱性物质组成，分散后，所述的有机酸的浓度为0.1g/mL0.5 g/mL，所述的碳酸氢钠的浓度为0.1g/mL0.5 g/mL，所述的有机酸为柠檬酸、酒石酸、枸橼酸、果酸、或者谷氨酸中的任一种；所述的碱性物质为碳酸钠、或者碳酸氢钠中的任一种；所述的化疗药物为盐酸阿霉素、紫杉醇、喜树碱、或者康普瑞汀中的任一种，分散后，所述的化疗药物的浓度为1-10mg/mL； 00。

21、16 3)将该聚乳酸-羟基乙酸/泡腾/化疗药物溶液加入水中，所述的聚乳酸-羟基乙酸/泡腾/化疗药物溶液和水的体积比为1:1030，形成产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物支架材料。 0017 本发明还提供了上述的一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物在制备治疗肿瘤药物中的应用。 0018 本发明还提供了通过的方法获得的一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物支架材料在制备治疗肿瘤药物中的应用。 0019 本发明将泡腾崩解剂、 PLGA和抗肿瘤药物溶解于NMP溶剂中，得泡腾崩解剂、 PLGA 和化疗药物分散液体。注射所得分散液体至肿瘤内，在与肿瘤内水分子接触后， PLGA因疏水而蜷缩，泡腾崩解剂和化疗。

22、药物被束缚于所形成的PLGA支架中，形成PLGA/泡腾（PT） /药物支架。在无HIFU刺激时，疏水的PLGA阻止了泡腾崩解剂和药物与水分子的接触，因而无气泡产生，药物释放缓慢；在HIFU刺激下， PLGA分子间隙瞬时增大，水分子与泡腾崩解剂和药物接触，产生气泡；束缚于支架内的药物也可被释放出来。产生的气泡可以增强肿瘤的HIFU治疗效果，而释放的药物可以杀死肿瘤。因此，该支架材料兼具气泡的HIFU增效效果和化疗药物的化疗治疗肿瘤的功效；且气泡稳定性高、气泡和药物利用率高，避免了对正常组织和脏器的损伤，有效地弥补了静脉注射微泡或产泡材料和化疗药物的。

23、不足，具有重要的临床转化意义。 0020 通过实验证明注射PLGA/Dox并施加同等强度和时间的HIFU组、注射PLGA/PT并施加同等强度和时间的HIFU组、注射PLGA并施加同等强度和时间的HIFU组的肿瘤生长均受到抑制，但程度较低，抑制顺序： PLGA/Dox+HIFUPLGA/PT+HIFUPLGA+HIFUPLGA/Dox对照组。这一实验结果表明PLGA/PT/药物支架可以增强HIFU消融的效果，实现HIUF治疗和化疗联合治疗。 0021 本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明工艺简单，所得药物和支架具有良好的血液相容性和生物相容性，可以实。

24、现对肿瘤的化疗治疗，并增强HIFU对肿瘤的消融效果，在肿瘤治疗等领域具有广阔的应用前景。而且所用PLGA和泡腾崩解剂成本低，药物利用率高，原料易得。附图说明说明书 3/5 页 6 CN 105641704 B 6 0022 图1、（a） PLGA/PT/化疗药物支架FESEM图片（泡腾崩解剂：柠檬酸+碳酸氢钠；化疗药物： Dox）；（b） PLGA/PT （左）和PLGA/PT/Dox （右）分散体系的数码照片，溶剂为NMP；（c）标准 1 mL注射器中的PLGA/PT/Dox；（d）空气中悬挂于标准1 mL注射器针尖的PLGA/PT/Dox；（e）。

25、蒸馏水中泡腾崩解剂剧烈反应的照片；（f）蒸馏水中PLGA/PT/Dox形成支架。 0023 图2、 HIFU刺激前的（a） PLGA、（c） PLGA/PT/Dox和刺激后的（b） PLGA、（d） PLGA/PT/ Dox照片；（e） PLGA/PT/Dox支架在不同条件下的DOX释放曲线。 0024 图3、不同方法治疗后肿瘤体积随时间的变化曲线。 0025 图4、（a）治疗后荷瘤兔的体重变化；（b） - （d）治疗1周后不同组的肿瘤照片：（b）对照组、（c） PLGA/PT+HIFU和（d） PLGA/PT/Dox+HIFU。 0026 图5、 PLGA/PT/Dox支架。

26、的（a）溶血实验和（b）凝血实验结果；（c、 d）血常规分析结果；（e）各主要脏器中的H&E染色结果，实验兔瘤内注射30 LPLGA/PT/Dox，并赋予HIFU治疗（180W，刺激时间400ms，间隔200ms，刺激次数6次），在注射第28天处死裸鼠，照片放大倍数为100。具体实施方式 0027 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 00。

27、28 实施例1 0029 称取1 g PLGA （分子量为10000道尔顿， LA:GA=1： 1，购自济南岱罡生物科技有限公司），与2 mLNMP混合，室温下搅拌12小时，得澄清透明溶液。取0.1g柠檬酸和0.1g碳酸氢钠，与上述PLGA溶液混合均匀，室温下超声分散（输出功率为500W） 0.5小时，使柠檬酸和碳酸氢钠均匀地分散于上述PLGA溶液中。称取5mgDox （购自北京华丰制药公司），室温下超声分散于上述PLGA/PT分散体系中（输出功率为500W） 0.5小时，得PLGA/PT/Dox。取50 L PLGA/PT/ Dox溶液，迅速注入水中，。

28、待溶液完全相变后，即得PLGA/PT/Dox支架。 PLGA、 PLGA/PT和PLGA/ Dox支架的制备方法同上。 0030 从图1可以看出，由于PLGA具有强疏水性， PLGA/PT/Dox与水接触后，会快速交换出溶剂，发生 “固-液” 相变，形成PLGA/PT/Dox多孔块状支架材料。泡腾崩解剂和Dox均可以均匀地分散于PLGA溶液中（图1 （b）），形成的PLGA/PT/Dox溶液具有良好的可注射性（图1 （c、 d））。泡腾崩解剂遇水后会剧烈反应，快速释放出CO2气泡；而包裹于PLGA内的泡腾崩解剂遇水后不会发生明显的崩解、融化，说明PL。

29、GA可以很好地控制泡腾崩解剂的分解，为其HIFU增效应用奠定了基础。 0031 实施例2 0032 分别取0.5mL实施例1中PLGA和PLGA/PT/Dox，注射至装满蒸馏水的冻存管中。待相变完成后，将此冻存管置于37 摇床中孵育。在每个预定时间点，吸取1 mL含有DOX的蒸馏水，并加入1 mL对应的新鲜缓冲溶液。通过标准曲线确定释放出的DOX的浓度，计算DOX在不同时间点的累计释放总量，分析PLGA/PT/Dox支架对DOX的释放情况。为了研究HIFU对气泡的产生速度和药物释放速度的影响，在孵育5min后，分别用HIFU （180W，刺激时间400ms。

30、，间说明书 4/5 页 7 CN 105641704 B 7 隔200ms，刺激次数6次）刺激PLGA和PLGA/PT/Dox支架，观察气泡和药物释放情况，结果如图 2所示。 HIFU刺激前后， PLGA支架均无气泡产生，而HIFU刺激PLGA/PT/Dox支架则可以产生明显的气泡。此外， HIFU刺激后， Dox的释放速度明显加快。这是因为在无HIFU刺激时，疏水的 PLGA阻止了泡腾崩解剂和药物与水分子的接触，因而无气泡产生，药物释放缓慢；而在HIFU 刺激下， PLGA分子间隙瞬时增大，水分子与泡腾崩解剂和药物接触，产生气泡并释放药物。 0033 实施。

31、例3 0034 取18只荷VX2肿瘤的新西兰大白兔（肿瘤直径约为1.5-2.0cm），随机平均分为6组。分别注射30 L生理盐水（空白对照组）； 30 L PLGA/Dox； 30 L PLGA，并辅以HIFU刺激； 30 L PLGA/PT，并辅以HIFU刺激； 30 L PLGA/Dox，并辅以HIFU刺激； 30 L PLGA/ PT/Dox，并辅以HIFU刺激（180W，刺激时间400ms，间隔200ms，刺激次数6次）。治疗完毕后，隔日记录裸鼠肿瘤体积。在治疗后第14天从第组中各只实验图耳静脉取血，测试血液指标；治疗后第28天对第组实验兔施。

32、安乐死，对各主要器官进行组织切片，通过H&E染色分析各主要脏器的病理变化情况（另取一致健康兔作为对照）。 0035 实验结果表明，空白对照组肿瘤生长不受影响，而其他5组中肿瘤生长均被不同程度地抑制（如图3和图4所示）。在不施加HIFU刺激的情况下， Dox可以从PLGA/Dox支架中缓慢释放出来，抑制肿瘤的生长。施加HIFU刺激后，一方面HIFU可以起到消融肿瘤的修够；另一方面， HIFU可以促进药物的释放，增强Dox对肿瘤的化疗疗效。更重要的是， HIFU可以促进泡腾崩解剂与水分子的接触，产生的气泡可以吸收HIFU的能量，并振动、膨胀、破裂，。

33、而增加焦点组织的热量、对肿瘤组织造成更大的损伤。因此， PLGA/PT/Dox 0036 支架可以实现对肿瘤的HIFU增效治疗和化疗治疗联合治疗，并完全抑制肿瘤的生长。如图3所示，在治疗后第7天，肿瘤即被完全清除。随着时间的推移，肿瘤完全消失，愈合肿瘤无复发。而空白对照组、或单独施加HIFU、单独施加化疗，均无法完全抑制肿瘤的生长。通过与健康裸鼠对比分析发现，实验组中大白兔的各项血液指标均在正常范围内，表明材料具有良好的血液相容性；心、肝、脾、肺和肾各器官既没有显示出明显的应激性毒性，又无长期的组织毒性；实验兔的体重在整个治疗过程中没有明显。

34、的变化，证明了PLGA/PT/Dox支架在活体水平的低毒性。 0037 实施例4 0038 取肝素锂稳定的健康成年人全血5 mL，离心3 min （转速为3000 r/min），用PBS洗涤沉淀3次，得血红细胞。用PBS按照1： 100的比例配置成人血红细胞悬浊液，于4冰箱中备用。 0039 称取3份一定质量（150 mg左右）的实施例1中制备的PLGA/PT/Dox支架。按照支架质量：人血红细胞悬浊液体积之比为100 mg:1 mL将支架人血红细胞悬浊液中（对照组设置 0.3 mL人血红细胞悬浊液溶于1.2 mLPBS中，以及0.3 mL人血红细胞悬浊液溶于。

35、1.2 mL蒸馏水中），并在37 环境下孵育1h。然后，将浸泡过支架的人血红细胞悬浊液离心1 min （1000 rpm），取上清液并用Lamada 25型紫外分光光度计测试上清液在540 nm处的吸光值，以评价材料的溶血性。结果表明PLGA/PT/Dox支架不会使血红细胞发生溶血（见附图5a）。说明书 5/5 页 8 CN 105641704 B 8 图1 说明书附图 1/7 页 9 CN 105641704 B 9 图2 说明书附图 2/7 页 10 CN 105641704 B 10 图3 说明书附图 3/7 页 11 CN 105641704 B 11 说明书附图 4/7 页 12 CN 105641704 B 12 图4 说明书附图 5/7 页 13 CN 105641704 B 13 说明书附图 6/7 页 14 CN 105641704 B 14 图5 说明书附图 7/7 页 15 CN 105641704 B 15 。

摘要
申请专利号：	CN201511022287.9	申请日：	20151230
公开号：	CN105641704B	公开日：	20180828
当前法律状态：		有效性：	有效
法律详情：
IPC分类号：	A61K47/34,A61K31/704,A61P35/00	主分类号：	A61K47/34,A61K31/704,A61P35/00
申请人：	上海理工大学,上海交通大学附属第一人民医院
发明人：	王世革,李想,安潇,刘璐,黄明贤
地址：	200093 上海市杨浦区军工路516号
优先权：	CN201511022287A
专利代理机构：	上海申汇专利代理有限公司	代理人：	吴宝根
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内容摘要

本发明一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物，由聚乳酸‑羟基乙酸、泡腾物、化疗药物和有机溶剂组成，聚乳酸‑羟基乙酸在有机溶剂中的浓度为0.1g/mL～1.0 g/mL；泡腾物由有机酸和碱性物质组成，有机酸的在有机溶剂中的浓度为0.1g/mL～0.5 g/mL，所述的碱性物质在有机溶剂中的浓度为0.1g/mL～0.5 g/mL；所述的化疗药物在有机溶剂中的浓度为1‑10mg/mL。还提供了一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物和一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物支架材料的制备方法。在HIFU的刺激下，支架材料中泡腾物产生气泡而增强HIFU对肿瘤的消融效果；负载的化疗药物释放出来，赋予支架化疗治疗肿瘤的能力。

权利要求书

1.一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物，其特征在于：由聚乳酸-羟基乙酸、泡腾物、化疗药物和有机溶剂组成，所述的有机溶剂为1-甲基-2-吡咯烷酮或N,N-二甲基甲酰胺中的任一种；所述的聚乳酸-羟基乙酸在有机溶剂中的浓度为0.1g/mL～1.0g/mL；所述的泡腾物由有机酸和碱性物质组成，所述的有机酸在有机溶剂中的浓度为0.1g/mL～0.5g/mL，所述的碱性物质在有机溶剂中的的浓度为0.1g/mL～0.5g/mL，所述的有机酸为柠檬酸、酒石酸、枸橼酸、果酸、或者谷氨酸中的任一种；所述的碱性物质为碳酸钠、或者碳酸氢钠中的任一种；所述的化疗药物为盐酸阿霉素、紫杉醇、喜树碱、或者康普瑞汀中的任一种，所述的化疗药物在有机溶剂中的浓度为1-10mg/mL。 2.一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：1）将聚乳酸-羟基乙酸溶解于有机溶剂中，搅拌使聚乳酸-羟基乙酸完全溶解，所述的聚乳酸-羟基乙酸在有机溶剂中的浓度为0.1g/mL～1.0g/mL；所述的有机溶剂为1-甲基-2-吡咯烷酮或N,N-二甲基甲酰胺中的任一种；2）在搅拌下，将泡腾物和化疗药物均匀分散于步骤（1）所得的聚乳酸-羟基乙酸溶液中，得聚乳酸-羟基乙酸/泡腾/化疗药物溶液；所述的泡腾物由有机酸和碱性物质组成，分散后，所述的有机酸的浓度为0.1g/mL～0.5g/mL，所述的碱性物质的浓度为0.1g/mL～0.5g/mL，所述的有机酸为柠檬酸、酒石酸、枸橼酸、果酸、或者谷氨酸中的任一种；所述的碱性物质为碳酸钠、或者碳酸氢钠中的任一种；所述的化疗药物为盐酸阿霉素、紫杉醇、喜树碱、或者康普瑞汀中的任一种，分散后，所述的化疗药物的浓度为1-10mg/mL。 3.根据权利要求2所述的一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物的制备方法，其特征在于：所述的聚乳酸-羟基乙酸的分子量为1000～10000道尔顿，其中，单体乳酸和羟基乙酸的摩尔比为10:90～90:10。 4.根据权利要求2所述的一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的搅拌为磁力搅拌，其速率为50-200r/min，时间为30分钟-12小时。 5.一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物支架材料的制备方法，其特征在于包括如下步骤：1）将聚乳酸-羟基乙酸溶解于有机溶剂中，搅拌使聚乳酸-羟基乙酸完全溶解，所述的聚乳酸-羟基乙酸在有机溶剂中的浓度为0.1g/mL～1.0g/mL；所述的有机溶剂为1-甲基-2-吡咯烷酮或N,N-二甲基甲酰胺中的任一种；2）在搅拌下，将泡腾物和化疗药物均匀分散于步骤（1）所得的聚乳酸-羟基乙酸溶液中，得聚乳酸-羟基乙酸/泡腾/化疗药物溶液；所述的泡腾物由有机酸和碱性物质组成，分散后，所述的有机酸的浓度为0.1g/mL～0.5g/mL，所述的碱性物质的浓度为0.1g/mL～0.5g/mL，所述的有机酸为柠檬酸、酒石酸、枸橼酸、果酸、或者谷氨酸中的任一种；所述的碱性物质为碳酸钠、或者碳酸氢钠中的任一种；所述的化疗药物为盐酸阿霉素、紫杉醇、喜树碱、或者康普瑞汀中的任一种，分散后，所述的化疗药物的浓度为1-10mg/mL；3）将该聚乳酸-羟基乙酸/泡腾/化疗药物溶液加入水中，所述的聚乳酸-羟基乙酸/泡腾/化疗药物溶液和水的体积比为1:10~30，形成产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物支架材料。 6.权利要求2所述的方法获得的一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物在制备治疗肿瘤药物中的应用。 7.通过权利要求5所述的方法获得的一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物支架材料在制备治疗肿瘤药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于药物化学领域，涉及一种治疗肿瘤的药物，具体来说是一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物及制备方法和应用。

背景技术

众所周知，癌症已成为当今社会威胁人类生命健康的巨大杀手。随着材料科学与纳米工程的发展，发展高疗效、低毒副作用的肿瘤诊疗方法，对提高人类的生活质量和发展国民经济等具有重要意义。高强度聚焦超声（High-intensity focused ultrasound，HIFU）治疗肿瘤是近年来兴起的一种肿瘤微/无创治疗方法，它利用超声波具有良好的方向性，穿透能力强等特点，通过一定方法将超声波聚焦于肿瘤靶点处，并以最小侵入或非侵入性方法的方式向组织中沉积声能。高强度声能量几乎被完全聚焦到病变组织处，并产生瞬间的高温高压，致使病变组织发生大量的物理、化学变化而坏死。自上世纪40年代被用于局部肿瘤治疗后，HIFU已成为一种临床上广泛使用的肿瘤治疗手段。相对于传统的手术治疗、化疗、放疗以及其他微无创治疗手段，HIFU治疗肿瘤所具有的操作简单、无辐射、无创、适形热消融、实时影像监控等技术特点顺应了当前高疗效、低毒副作用治疗肿瘤的发展要求，成为了医学科研界研究的热点。

目前，临床上多采用核磁共振成像（MRI）或超声成像（US）介导下实现肿瘤的HIFU消融。适用的治疗范围也从最初的胰腺癌发展到当前的肝癌、乳腺癌、骨肉瘤及子宫肌瘤等多种肿瘤。然而，HIFU在临床肿瘤治疗应用中的推广还需要解决下面两个重要问题。首先，精准的HIFU治疗需要利用先进的临床成像系统（如US、MRI、计算机断层扫描成像（CT）、正电子发射计算机断层显像（PET-CT）等）对肿瘤病灶进行定位；其次，在实际HIFU治疗中，超声波在传播过程中的能量降低使其难以消除深部病变组织。针对上述问题，除了进行高昂的仪器设备升级外，研究者开始开发各种各样的HIFU增效剂，以实现在较小的超声功率下，达到满意的肿瘤消融效果。在治疗中，HIFU治疗的空化效应是指HIFU的正负声压变换会产生强大的空化效应而形成大量气泡。这些气泡会吸收声能量，并振动、膨胀、破裂，而增加焦点组织的热量、对肿瘤组织造成更大的损伤。研究表明，微纳米生物材料能够改变组织的声学环境，增加超声能量在病变组织中的沉积，增加肿瘤的消融效果。

基于这一事实，从纳米技术的角度出发，研究者们将气泡或可以产生气泡的纳米材料通过表面靶向配体作用主动输运或者利用肿瘤组织部位血管增强的通透性（即EPR效应）被动富集到肿瘤组织内。在HIFU的刺激下，这些气泡与HIFU发生复杂反应而增加HIFU对肿瘤组织的消融效果。例如，声诺维（即注射用六氟化硫微泡）是一种已经商品化的超声造影剂。研究表明，除了作为临床超声造影剂外，声诺维还可以减少 HIFU治疗子宫肌瘤时的超声能量，提高 HIFU 消融子宫肌瘤的效果。又如，以无机材料介孔二氧化硅为载体，通过真空灌注温敏性全氟戊烷，Shi等人设计了出了基于介孔二氧化硅的HIFU增效剂，在体外实验和动物实验中增强了HIFU对肿瘤的消融效果。Zheng等人通过用磷脂装载氟碳化合物实现了肿瘤的超声成像和HIFU增效。然而，大部分注射的无机材料都被肝脏等器官捕捉；此外，有机微泡的粒径较大（微米级别），难以通过肿瘤的血管内皮间隙，导致在肿瘤内气泡的富集量很少。而且，温敏型全氟化合物热稳定性差，在材料的储存过程中气泡容易破裂，进一步的HIFU临床应用受到了很大的制约。

泡腾崩解剂通常是有机酸（如柠檬酸）和碳酸钠、碳酸氢钠组成的混合物；泡腾崩解剂放入水后会发生剧烈的复分解反应，产生大量二氧化碳。这种气泡的产生是一种瞬时的变化过程，无法直接应用于HIFU治疗。基于上述技术问题，设想可以通过一定的技术手段，将泡腾崩解剂束缚于肿瘤部位，并控制气泡的产生速度，以应用于HIFU治疗。聚乳酸羟基乙酸共聚物（poly(lactide-co-glycolide)，PLGA）是一种已经被美国食品与药物管理局(FDA)批准使用，具有良好的生物相容性和生物降解性的高分子聚合物。作为一种优良的生物医用材料，PLGA已被广泛地应用于可植入材料和组织工程用支架材料领域。PLGA具有一个显著的物理特性，即强疏水性。截止目前，尚没有文献报道通过控制泡腾的崩解、融化，利用其气泡增加HIFU对肿瘤的消融效果。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物及制备方法和应用，所述的这种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物及制备方法和应用解决了现有技术中采用高强度聚焦超声治疗肿瘤的效果不佳的技术问题。

本发明提供了一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物，由聚乳酸-羟基乙酸、泡腾物、化疗药物和有机溶剂组成，所述的有机溶剂为1-甲基-2-吡咯烷酮或N,N-二甲基甲酰胺中的任一种；所述的聚乳酸-羟基乙酸在有机溶剂中的浓度为0.1g/mL～1.0 g/mL；所述的泡腾物由有机酸和碱性物质组成，所述的有机酸的在有机溶剂中的浓度为0.1g/mL～0.5 g/mL，所述的碱性物质在有机溶剂中的的浓度为0.1g/mL～0.5 g/mL，所述的有机酸为柠檬酸、酒石酸、枸橼酸、果酸、或者谷氨酸中的任一种；所述的碱性物质为碳酸钠、或者碳酸氢钠中的任一种；所述的化疗药物为盐酸阿霉素、紫杉醇、喜树碱、或者康普瑞汀中的任一种，所述的化疗药物的浓度在有机溶剂中的浓度为1-10mg/mL。

本发明提供了一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物的制备方法，包括如下步骤：

1)将聚乳酸-羟基乙酸溶解于有机溶剂中，搅拌使聚乳酸-羟基乙酸完全溶解，所述的聚乳酸-羟基乙酸在有机溶剂中的浓度为0.1g/mL～1.0 g/mL；所述的有机溶剂为1-甲基-2-吡咯烷酮或N,N-二甲基甲酰胺中的任一种；

2)在搅拌下，将泡腾物和化疗药物均匀分散于步骤（1）所得的聚乳酸-羟基乙酸溶液中，得聚乳酸-羟基乙酸/泡腾/化疗药物溶液；所述的泡腾物由有机酸和碱性物质组成，分散后，所述的有机酸的浓度为0.1g/mL～0.5 g/mL，所述的碱性物质的浓度为0.1g/mL～0.5 g/mL，所述的有机酸为柠檬酸、酒石酸、枸橼酸、果酸、或者谷氨酸中的任一种；所述的碱性物质为碳酸钠、或者碳酸氢钠中的任一种；所述的化疗药物为盐酸阿霉素、紫杉醇、喜树碱、或者康普瑞汀中的任一种，分散后，所述的化疗药物的浓度为1-10mg/mL。

进一步的，所述的聚乳酸-羟基乙酸的分子量为1000～10000道尔顿，其中，单体乳酸和羟基乙酸的摩尔比为10:90～90:10。

进一步的，步骤（1）中所述的搅拌为磁力搅拌，其速率为50-200 r/min，时间为30分钟-12小时。

本发明还提供了一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物支架材料的制备方法，包括如下步骤：

1)将聚乳酸-羟基乙酸溶解于有机溶剂中，搅拌使PLGA完全溶解，所述的聚乳酸-羟基乙酸在有机溶剂中的浓度为0.1g/mL～1.0 g/mL；所述的有机溶剂为1-甲基-2-吡咯烷酮或N,N-二甲基甲酰胺中的任一种；

2)在搅拌下，将泡腾物和化疗药物均匀分散于步骤（1）所得的PLGA溶液中，得聚乳酸-羟基乙酸/泡腾/化疗药物溶液；所述的泡腾物由有机酸和碱性物质组成，分散后，所述的有机酸的浓度为0.1g/mL～0.5 g/mL，所述的碳酸氢钠的浓度为0.1g/mL～0.5 g/mL，所述的有机酸为柠檬酸、酒石酸、枸橼酸、果酸、或者谷氨酸中的任一种；所述的碱性物质为碳酸钠、或者碳酸氢钠中的任一种；所述的化疗药物为盐酸阿霉素、紫杉醇、喜树碱、或者康普瑞汀中的任一种，分散后，所述的化疗药物的浓度为1-10mg/mL；

3)将该聚乳酸-羟基乙酸/泡腾/化疗药物溶液加入水中，所述的聚乳酸-羟基乙酸/泡腾/化疗药物溶液和水的体积比为1:10~30，形成产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物支架材料。

本发明还提供了上述的一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物在制备治疗肿瘤药物中的应用。

本发明还提供了通过的方法获得的一种产泡聚乳酸羟基乙酸泡腾药物支架材料在制备治疗肿瘤药物中的应用。

本发明将泡腾崩解剂、PLGA和抗肿瘤药物溶解于NMP溶剂中，得泡腾崩解剂、PLGA和化疗药物分散液体。注射所得分散液体至肿瘤内，在与肿瘤内水分子接触后，PLGA因疏水而蜷缩，泡腾崩解剂和化疗药物被束缚于所形成的PLGA支架中，形成PLGA/泡腾（PT）/药物支架。在无HIFU刺激时，疏水的PLGA阻止了泡腾崩解剂和药物与水分子的接触，因而无气泡产生，药物释放缓慢；在HIFU刺激下，PLGA分子间隙瞬时增大，水分子与泡腾崩解剂和药物接触，产生气泡；束缚于支架内的药物也可被释放出来。产生的气泡可以增强肿瘤的HIFU治疗效果，而释放的药物可以杀死肿瘤。因此，该支架材料兼具气泡的HIFU增效效果和化疗药物的化疗治疗肿瘤的功效；且气泡稳定性高、气泡和药物利用率高，避免了对正常组织和脏器的损伤，有效地弥补了静脉注射微泡或产泡材料和化疗药物的不足，具有重要的临床转化意义。

通过实验证明注射PLGA/Dox并施加同等强度和时间的HIFU组、注射PLGA/PT并施加同等强度和时间的HIFU组、注射PLGA并施加同等强度和时间的HIFU组的肿瘤生长均受到抑制，但程度较低，抑制顺序：PLGA/Dox+HIFU＞PLGA/PT+HIFU＞PLGA+HIFU＞PLGA/Dox＞对照组。这一实验结果表明PLGA/PT/药物支架可以增强HIFU消融的效果，实现HIUF治疗和化疗联合治疗。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明工艺简单，所得药物和支架具有良好的血液相容性和生物相容性，可以实现对肿瘤的化疗治疗，并增强HIFU对肿瘤的消融效果，在肿瘤治疗等领域具有广阔的应用前景。而且所用PLGA和泡腾崩解剂成本低，药物利用率高，原料易得。

附图说明

图1、（a）PLGA/PT/化疗药物支架FESEM图片（泡腾崩解剂：柠檬酸+碳酸氢钠；化疗药物：Dox）；（b）PLGA/PT（左）和PLGA/PT/Dox（右）分散体系的数码照片，溶剂为NMP；（c）标准1 mL注射器中的PLGA/PT/Dox；（d）空气中悬挂于标准1 mL注射器针尖的PLGA/PT/Dox；（e）蒸馏水中泡腾崩解剂剧烈反应的照片；（f）蒸馏水中PLGA/PT/Dox形成支架。

图2、HIFU刺激前的（a）PLGA、（c）PLGA/PT/Dox和刺激后的（b）PLGA、（d）PLGA/PT/Dox照片；（e）PLGA/PT/Dox支架在不同条件下的DOX释放曲线。

图3、不同方法治疗后肿瘤体积随时间的变化曲线。

图4、（a）治疗后荷瘤兔的体重变化；（b）-（d）治疗1周后不同组的肿瘤照片：（b）对照组、（c）PLGA/PT+HIFU和（d）PLGA/PT/Dox+HIFU。

图5、PLGA/PT/Dox支架的（a）溶血实验和（b）凝血实验结果；（c、d）血常规分析结果；（e）各主要脏器中的H&E染色结果，实验兔瘤内注射30 μLPLGA/PT/Dox，并赋予HIFU治疗（180W，刺激时间400ms，间隔200ms，刺激次数6次），在注射第28天处死裸鼠，照片放大倍数为100×。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

称取1 g PLGA（分子量为10000道尔顿，LA:GA=1：1，购自济南岱罡生物科技有限公司），与2 mLNMP混合，室温下搅拌12小时，得澄清透明溶液。取0.1g柠檬酸和0.1g碳酸氢钠，与上述PLGA溶液混合均匀，室温下超声分散（输出功率为500W）0.5小时，使柠檬酸和碳酸氢钠均匀地分散于上述PLGA溶液中。称取5mgDox（购自北京华丰制药公司），室温下超声分散于上述PLGA/PT分散体系中（输出功率为500W）0.5小时，得PLGA/PT/Dox。取50μL PLGA/PT/Dox溶液，迅速注入水中，待溶液完全相变后，即得PLGA/PT/Dox支架。PLGA、PLGA/PT和PLGA/Dox支架的制备方法同上。

从图1可以看出，由于PLGA具有强疏水性，PLGA/PT/Dox与水接触后，会快速交换出溶剂，发生“固-液”相变，形成PLGA/PT/Dox多孔块状支架材料。泡腾崩解剂和Dox均可以均匀地分散于PLGA溶液中（图1（b）），形成的PLGA/PT/Dox溶液具有良好的可注射性（图1（c、d））。泡腾崩解剂遇水后会剧烈反应，快速释放出CO2气泡；而包裹于PLGA内的泡腾崩解剂遇水后不会发生明显的崩解、融化，说明PLGA可以很好地控制泡腾崩解剂的分解，为其HIFU增效应用奠定了基础。

实施例2

分别取0.5mL实施例1中PLGA和PLGA/PT/Dox，注射至装满蒸馏水的冻存管中。待相变完成后，将此冻存管置于37 ℃摇床中孵育。在每个预定时间点，吸取1 mL含有DOX的蒸馏水，并加入1 mL对应的新鲜缓冲溶液。通过标准曲线确定释放出的DOX的浓度，计算DOX在不同时间点的累计释放总量，分析PLGA/PT/Dox支架对DOX的释放情况。为了研究HIFU对气泡的产生速度和药物释放速度的影响，在孵育5min后，分别用HIFU（180W，刺激时间400ms，间隔200ms，刺激次数6次）刺激PLGA和PLGA/PT/Dox支架，观察气泡和药物释放情况，结果如图2所示。HIFU刺激前后，PLGA支架均无气泡产生，而HIFU刺激PLGA/PT/Dox支架则可以产生明显的气泡。此外，HIFU刺激后，Dox的释放速度明显加快。这是因为在无HIFU刺激时，疏水的PLGA阻止了泡腾崩解剂和药物与水分子的接触，因而无气泡产生，药物释放缓慢；而在HIFU刺激下，PLGA分子间隙瞬时增大，水分子与泡腾崩解剂和药物接触，产生气泡并释放药物。

实施例3

取18只荷VX2肿瘤的新西兰大白兔（肿瘤直径约为1.5-2.0cm），随机平均分为6组。分别注射①30μL生理盐水（空白对照组）；②30μL PLGA/Dox；③30μL PLGA，并辅以HIFU刺激；④30μL PLGA/PT，并辅以HIFU刺激；⑤30μL PLGA/Dox，并辅以HIFU刺激；⑥30μL PLGA/PT/Dox，并辅以HIFU刺激（180W，刺激时间400ms，间隔200ms，刺激次数6次）。治疗完毕后，隔日记录裸鼠肿瘤体积。在治疗后第14天从第⑥组中各只实验图耳静脉取血，测试血液指标；治疗后第28天对第⑥组实验兔施安乐死，对各主要器官进行组织切片，通过H&E染色分析各主要脏器的病理变化情况（另取一致健康兔作为对照）。

实验结果表明，空白对照组肿瘤生长不受影响，而其他5组中肿瘤生长均被不同程度地抑制（如图3和图4所示）。在不施加HIFU刺激的情况下，Dox可以从PLGA/Dox支架中缓慢释放出来，抑制肿瘤的生长。施加HIFU刺激后，一方面HIFU可以起到消融肿瘤的修够；另一方面，HIFU可以促进药物的释放，增强Dox对肿瘤的化疗疗效。更重要的是，HIFU可以促进泡腾崩解剂与水分子的接触，产生的气泡可以吸收HIFU的能量，并振动、膨胀、破裂，而增加焦点组织的热量、对肿瘤组织造成更大的损伤。因此，PLGA/PT/Dox

支架可以实现对肿瘤的HIFU增效治疗和化疗治疗联合治疗，并完全抑制肿瘤的生长。如图3所示，在治疗后第7天，肿瘤即被完全清除。随着时间的推移，肿瘤完全消失，愈合肿瘤无复发。而空白对照组、或单独施加HIFU、单独施加化疗，均无法完全抑制肿瘤的生长。通过与健康裸鼠对比分析发现，实验组中大白兔的各项血液指标均在正常范围内，表明材料具有良好的血液相容性；心、肝、脾、肺和肾各器官既没有显示出明显的应激性毒性，又无长期的组织毒性；实验兔的体重在整个治疗过程中没有明显的变化，证明了PLGA/PT/Dox支架在活体水平的低毒性。

实施例4

取肝素锂稳定的健康成年人全血5 mL，离心3 min（转速为3000 r/min），用PBS洗涤沉淀3次，得血红细胞。用PBS按照1：100的比例配置成人血红细胞悬浊液，于4℃冰箱中备用。

称取3份一定质量（150 mg左右）的实施例1中制备的PLGA/PT/Dox支架。按照支架质量：人血红细胞悬浊液体积之比为100 mg:1 mL将支架人血红细胞悬浊液中（对照组设置0.3 mL人血红细胞悬浊液溶于1.2 mLPBS中，以及0.3 mL人血红细胞悬浊液溶于1.2 mL蒸馏水中），并在37 ℃环境下孵育1h。然后，将浸泡过支架的人血红细胞悬浊液离心1 min（1000 rpm），取上清液并用Lamada 25型紫外分光光度计测试上清液在540 nm处的吸光值，以评价材料的溶血性。结果表明PLGA/PT/Dox支架不会使血红细胞发生溶血（见附图5a）。