技术领域
本发明涉及异甘草素及其衍生物的新用途，具体涉及异甘草素及衍生物 抗肿瘤以及与抗肿瘤药物合用增敏、减少耐药性方面的应用。
背景技术
异甘草素为一种黄酮类化合物，广泛存在于豆科植物中。现代药理研究 表明，异甘草素具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、治疗心血管病等用途。
近年有抗肿瘤的治疗研究发现异甘草素具有抗肿瘤的活性，但对其与化 疗药物共用的增敏、减少耐药等效果未见报道。
发明内容
本发明的一个目的在于提供异甘草素及其衍生物在制备抗肿瘤药物中 的应用；
本发明的第二个目的在于提供异甘草素及其衍生物在制备作为化疗药 的增效剂或减少化疗药耐药性药物中的应用。
本发明的第三个目的在于提供一种抗肿瘤的药物组合物。
本发明的第四个目的在于提供一种抗肿瘤的药剂盒。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
异甘草素及其衍生物在制备治疗肿瘤药物中的应用；
进一步，其特征在于在抑制肿瘤细胞增殖；
进一步，其特征在于在诱导肿瘤细胞凋亡；
进一步，所述肿瘤为乳腺肿瘤/肝脏肿瘤等肿瘤。
异甘草素及其衍生物在制备作为化疗药的增效剂或减少化疗药耐药性 药物中的应用。
从理论上讲，包含异甘草素的天然植物均具有抗肿瘤和与化疗药物协同 增效、减低抗药性的作用；此外由天然植物经常规提取得到的提取物同样具 有上述作用。其中，所述包含异甘草素的天然植物如豆科植物鸡血藤、甘草、 黄芪、红芪等；所述提取物为水/乙醇提取物，或水/乙醇提取物经进一步分 离纯化得到的提取物。
本发明还进一步提供了一种抗肿瘤的药物组合物，该组合物由作为活性 成分的异甘草素或其衍生物及化疗药物组成，其剂量为临床所接受的常规剂 量。
进一步，所述异甘草素的日用剂量为2mg/kg－100mg/kg。
本发明组合物可按照常规工艺加入常规辅料制成药剂学可接受的任何 制剂，如茶剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、凝胶剂、缓释剂、口服液、滴丸剂 或纳米制剂；也可与其他相关药物配伍使用，制成相应的制剂。所述药学可 接受的辅料包括：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫 味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、 甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维 素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基 纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅 等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基 纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等。
本发明还提供了一种抗肿瘤的药剂盒，该药剂盒由异甘草素或其衍生物 和化疗药物组成，其中活性成分的重量比例为（5～150）：（0.5～3）。
进一步，活性成分的重量比为5:1.5－50:1.5。
进一步，所述异甘草素的日用剂量为2mg/kg－100mg/kg。
本发明所述化疗药为临床常用的化疗药物，包括紫杉醇，多西他赛，长 春新碱，门冬酰胺，阿糖胞苷，环磷酰胺，比柔比星，氟尿嘧啶，硫嘌呤， 阿霉素等。
本发明所述异甘草素可以从市场购买，也可以从豆科植物鸡血藤、甘草 中提取或其它植物中提取得到，还可以从其他植物中分离纯化得到，也可以 通过化学合成或生物合成方法得到，其结构式如下：
异甘草素
本发明所述异甘草素衍生物为与异甘草素具有相同黄酮母核的化合物， 本发明研究发现异甘草素衍生物同样具有抗肿瘤、及与化疗药物协同增效、 减低抗药性的用途。
进一步，本发明所述异甘草素衍生物为新异甘草素，结构如下：
新异甘草素
本发明研究表明，异甘草素及其衍生物以及包含异甘草素及其衍生物的 均能够显著抑制肿瘤细胞增殖及克隆，诱导肿瘤细胞凋亡；其与化疗药物联 用能够实现增敏、减少耐药性的目的。
附图说明
图1异甘草素对癌细胞的长期增殖抑制作用
图2异甘草素肿瘤细胞珠蛋白质表达的影响
图3异甘草素对肿瘤组织LDH-A,HIF-1a和Ki67的影响
图4A异甘草素对正常组织（心肝脾肺肾）的影响
图4B异甘草素对心脏和肌肉形态及其中LDH的表达
实验例1异甘草素（ISL）对肿瘤细胞增殖及克隆形成的抑制作用
1.MTT法检测异甘草素对肿瘤细胞增殖的影响
1.1实验方法
分别取乳腺肿瘤细胞株MDA-MB-231、MCF-7，乳腺正常细胞株 MCF-10A，肝肿瘤细胞株7703、HepG2，肝正常细胞株LO2，以3×103/ml 的细胞浓度加至96孔板，180μl/孔。配制各浓度异甘草素，使其终质量浓 度分别为0，10，20，30，40，50uM，每一浓度设5个平行孔。同时设立对 照孔(只含等体积细胞悬液，不加药物)，空白调零孔(只含等体积完全培养基， 不加药物)分别培养24、48和72h以观时效。于每孔加10μl新配制的MTT 溶液(10mg/ml)，培养箱中孵育4h；弃培养基，每孔加150μL DMSO振 荡5min，使结晶物充分溶解，用酶标仪在490nm处测定吸光值(OD value)。 实验重复3遍，取平均值。
1.2实验结果
实验结果见表1-2。
表1异甘草素对肿瘤细胞增殖作用的影响
表2异甘草素对正常细胞增殖作用的影响
MCF-10A LO2 ISL(uM) 48h 48h 0 0.412±0.022 0.353±0.023 10 0.428±0.021 0.388±0.041 20 0.411±0.045 0.502±0.074 30 0.389±0.071 0.449±0.081 40 0.358±0.036 0.462±0.076 50 0.361±0.043 0.402±0.024
结果显示异甘草素（ISL）能明显抑制乳腺肿瘤细胞MCF-7和 MDA-MB-231的增殖，且具有明显量效与时效的关系。但对乳腺正常细胞 MCF-10A则不具有上述特点。同时，异甘草素（ISL）同样具有抗肝肿瘤细 胞HepG2和7703的作用，但对肝的正常组织细胞LO2抑制作用很小，类 似于对MCF-10A增殖作用。
2.细胞克隆形成实验检测异甘草素对癌细胞生存、克隆形成的影响
2.1实验方法
取对数生长期的MDA-MB-231、MCF-7、7703、HepG2单层培养细胞， 用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，以每孔200个细胞的细胞浓度接 种于六孔板中，两周后计数克隆数目，细胞数大于30为一个克隆。终止培 养，弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加1:3醋酸/甲醇固定15分钟。 加适量Giemsa染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干 燥。
2.2实验结果
实验结果见图1。
结果表明异甘草素（ISL）处理后细胞与对照组比较积落数明显减少， 说明异甘草素（ISL）有显着的影响乳癌及肝癌的细胞集落形成能力，即异 甘草素（ISL）能抑制乳癌及肝癌的生存能力，并具有量效依赖的关系，而 对正常的细胞则不具有明显的抑制作用。
实验例2异甘草素（ISL）诱导肿瘤细胞凋亡的作用
1异甘草素对肿瘤细胞周期的影响
1.1实验方法
将处于对数生长期的MDA-MB-231,MCF-7,HepG2和7703细胞，按每 孔2×105个细胞接种于6孔培养板中，待细胞贴壁过夜后加入异甘草素使 终浓度为25uM和50uM，于37℃作用24h。胰酶消化收集细胞，4℃1000r/min 离心5min，弃上清液；用预冷的PBS重悬细胞，4℃1000r/min离心5min， 弃上清液；加入预冷的PBS300ul和预冷的无水乙醇700ul，迅速涡旋混匀； 将该细胞悬液置于4℃固定过夜；第2天，4℃1000r/min离心5min，弃上清 液；加入预冷的PBS重悬细胞1ml，3000r/min离心5min，弃上清液；向细 胞沉淀中加入预冷的PBS0.5ml和Rnase（终浓度10ug/ml）1ul，涡旋混匀后， 于37℃水浴15min；最后，加入碘化丙啶（终浓度20ug/ml）2.5ml，室温避 光染色30min。用流式细胞仪检测细胞ＤＮＡ含量，每组样品分析1×104 个细胞，实验结果采用CellQuest软件分析。
1.2实验结果
通过细胞周期检测发现，加入异甘草素可显着抑制乳腺癌及肝癌细胞的 细胞周期进程，使G2/M期阻滞。
2异甘草素对肿瘤细胞凋亡的影响
2.1实验方法
将处于对数生长期的MDA-MB-231,MCF-7,HepG2和7703细胞，按每 孔2×105个细胞接种于6孔培养板中，待细胞贴壁过夜后加入异甘草素使 终浓度为25uM和50uM，于37℃作用24h。胰酶消化收集细胞，4℃1000r/min 离心5min，弃上清液；预冷的PBS洗2次，细胞重悬于冷的结合缓冲液。 然后每0.5毫升结合缓冲液加入Annexin FITC染色溶液和溴化丙啶(PI)染色 溶液各5ul，室温避光孵育10min。用流式细胞仪检测。
2.2实验结果
结果显示异甘草素能显着提高乳腺癌及肝癌细胞的凋亡，结果也提示了 诱导癌细胞凋亡可能是异甘草素抗肿瘤作用中的重要机制。
实验例3异甘草素（ISL）对化疗增敏的体内外研究
1异甘草素（ISL）对化疗增敏的体外研究
1.1实验方法
MTT法检测：分别取MDA-MB-231、MDA-MB-231、MCF-7、MCF-7/ADR （乳癌阿霉素耐药株），以3×103/ml的细胞浓度加至96孔板，180μl/ 孔。配制各浓度异甘草素和化疗药物，每一浓度设5个平行孔。同时设立对 照孔(只含等体积细胞悬液，不加药物)，空白调零孔(只含等体积完全培养基， 不加药物)分别培养24h。于每孔加10μl新配制的MTT溶液(10mg/ml)， 培养箱中孵育4h;弃培养基，每孔加150μL DMSO振荡5min，使结晶物 充分溶解，用酶标仪在490nm处测定吸光值(OD值)。实验重复3遍，取 平均值。
蛋白提取及免疫印迹检测：细胞分别经不同浓度的异甘草素处理，继续 培养24h后收集细胞，常规提取细胞蛋白。利用BCA法测定蛋白浓度。取 适量蛋白样品30ug进行SDSPAGE凝胶电泳（分离胶10％，浓缩胶5％）， 电泳后转移至PVDF膜（100V，2h），5％脱脂牛奶室温封闭2ｈ，加入一 抗4℃孵育过夜，加入二抗（1:1000）孵育1ｈ，洗膜后，经过显、定影得 到目的蛋白表达变化条带。
1.2实验结果
异甘草素分别与紫杉醇、阿霉素、5-Fu联用对肿瘤细胞的抑制作用见表 3；异甘草素单独及与阿霉素联用耐药株MCF-7/ADR的抑制作用见表4-5； 蛋白提取及免疫印迹检测结果见图2。
表3异甘草素分别与紫杉醇、阿霉素、5-Fu联用对肿瘤细胞的抑制作用
表3结果表明，异甘草素能分别协同化疗药物紫杉醇，阿霉素和氟尿嘧 啶抑制乳癌及肝癌细胞的增殖，其中干细胞富集细胞系乳腺癌细胞系 MDA-MB-231效果最显着。由此可见异甘草素（ISL）与化疗药物合用的增 效作用主要是针对肿瘤干细胞。
表4阿霉素对乳腺肿瘤细胞株MCF-7和耐药株MCF-7/ADR的抑制作用
阿霉素(ug/ml) MCF-7 MCF-7/ADR 0 2.012±0.114 0.996±0.153 2 1.032±0.189 0.623±0.078 4 0.339±0.012 0.504±0.006 6 0.351±0.01 0.612±0.081 8 0.347±0.013 0.513±0.078 10 0.345±0.009 0.509±0.096
表5异甘草素单独及与阿霉素联用耐药株MCF-7/ADR的抑制作用
表4-5结果表明，异甘草素（ISL）能显著抑制耐药性乳腺癌细胞系 MCF-7/ADR的增殖，并协同化疗药物阿霉素诱导其凋亡。
图2结果表明，异甘草素（ISL）能抑制耐药性相关蛋白ABCG2的表达， 且具有量效依赖关系，异甘草素（ISL）能诱导MCF-7/ADR通过线体途径 凋亡，且具有量效依赖关系。
2异甘草素（ISL）对化疗增敏的体内研究
2.1实验方法
动物分组：用乳癌（MDA-MB-231）及肝癌(7703)细胞株培养后，用PBS 悬浮至1～3×106/0.1ml/鼠，i.p接种于乳腺处。待成瘤成功，将裸鼠分为5组， 每组6只。分别为空白对照组,化疗药物阿霉素组，异甘草素低剂量组，异 甘草素高剂量组，阿霉素-异甘草素协同组。剂量：化疗药物阿霉素为 1.5mg/kg/week，低剂量异甘草素为25mg/kg/day，高剂量异甘草素为 50mg/kg/day，阿霉素-异甘草素协同组为阿霉素1.5mg/kg/week加上异甘草 素50mg/kg/day。阿霉素腹腔注射，一周一次。异甘草素以灌胃方式每天一 次。
肿瘤体积测定：实验结束后，将所有小鼠脱颈处死，取肿瘤组织，计算 肿瘤体积。
免疫组化检测：切取瘤组织用4%多聚甲醛固定、梯度酒精脱水、二甲 苯透明、石蜡包埋切片。抗原修复，加一抗过夜。第二天DAB显色，苏木 紫对比染核。观察LDH-A（乳酸脱氢酶-A）,HIF-1a（缺氧诱导因子-1a）和 Ki67表达的变化。
瘤体组织的TUNEL分析：切片按常规脱蜡和脱水，加10μg/ml的蛋白 酶K后在37℃中孵育30min，按照Roche Applied Science公司TUNEL细 胞凋亡检测试剂盒说明书操作步骤进行，光镜下观察，高倍镜下随机选取10 个高倍视野，观察凋亡细胞形态及凋亡细胞。
2.2实验结果
各实验组肿瘤体积结果见表6-7。
表6异甘草素及其与阿霉素联用对MDA-MB-231体积的影响
表7异甘草素及其与阿霉素联用对7703体积的影响
表6-7结果表明,异甘草素（ISL）能显著抑制肿瘤的生长并有明显的量 效依赖关系，抑制率分别为44.36%（低剂量组）和67.92%（高剂量组）。 同时，异甘草素（ISL）能增加化疗药物阿霉素对抗肿瘤的增敏作用，其对 乳腺有效抑制率达89.37%，结果暗示异甘草素（ISL）能促进化疗药物的化 疗增敏。同样，异甘草素（ISL）也能抑制7703细胞所致的移植性肝癌.
免疫组化分析结果见图3。结果表明异甘草素（ISL）处理后的肿瘤组织 中其LDH-A,HIF-1a和Ki67的表达都降低。用TUNLE分析发现其凋亡率 增加。
实验例4异甘草素（ISL）对正常组织的副作用观察
用H＆E染色考察重要脏器的形态学改变，结果显示异甘草素对小鼠体 内正常组织（心肝脾肺肾）在最大有效剂量内无病理毒害作用(见图4A)，且 免疫组化结果表明异甘草素在最大有效剂量内对心脏和肌肉形态及其中 LDH的表达无影响(见图4B)。
实验例5异甘草素衍生物对肿瘤细胞增殖的影响
新异甘草素（NISL）是在异甘草素的基础上加多了一个糖，其活性较异 甘草素会增强，我们用新异甘草素与LDHA(乳酸脱氢酶A)进行分子对接， 发现其结合的稳定性好，明显的优于异甘草素。下述细胞与动物实验，也证 明其具有较好抗肿瘤，增敏，减少耐药性的效果。
1实验方法（同实验例1“1、MTT法检测异甘草素对肿瘤细胞增殖的 影响”）
2实验结果
实验结果见表8-9。
表8新异甘草素对肿瘤细胞增殖作用的影响
表9新异甘草素对正常细胞增殖作用的影响
实验结果表明，新异甘草素（NISL）处理后肿瘤细胞生长受到抑制，新 异甘草素（NISL）能抑制乳癌及肝癌的生存能力，并具有量效依赖的关系， 而对正常的细胞则不具有明显的抑制作用。
实验例6新异甘草素（NISL）对化疗增敏的体内外研究
1新异甘草素（NISL）对化疗增敏的体外研究
1.1实验方法（同实验例3“1、异甘草素对化疗增敏的体内外研究MTT 法检测”）
1.2实验结果
实验结果见表10-12。
表10新异甘草素分别与紫杉醇、阿霉素、5-Fu联用对肿瘤细胞的抑制作用
结果显示，新异甘草素对不同的化疗及不同的肿瘤细胞株都具有增敏作 用，且具有量效依赖的关系。
表11新异甘草素及与阿霉素联用耐药株MCF-7/ADR的抑制作用
阿霉素(ug/ml) MCF-7 MCF-7/ADR 0 2.012±0.114 0.996±0.153 2 1.032±0.189 0.623±0.078 4 0.339±0.012 0.504±0.006 6 0.351±0.01 0.612±0.081 8 0.347±0.013 0.513±0.078 10 0.345±0.009 0.509±0.096
表12新异甘草素单独及与阿霉素联用耐药株MCF-7/ADR的抑制作用
结果表明，新异甘草素（NISL）能显著抑制耐药性乳腺癌细胞系的 MCF-7/ADR的增殖。
2新异甘草素（NISL）对化疗增敏的体内研究
2.1实验方法（同实验例3“2、异甘草素（ISL）对化疗增敏的体内研 究”）
2.2实验结果
各实验组肿瘤体积结果见表13。
表13新异甘草素及其与阿霉素联用对MDA-MB-231体积的影响
实验结果表明，新异甘草素能显着地抑制肿瘤的生长并有明显的量效依 赖关系，抑制率分别为68.08%（低剂量组）和77.06%（高剂量组）。同时. 新异甘草素能增加化疗药物阿霉素对抗肿瘤的增敏作用，其对乳腺有效抑制 率达93.77%，结果显示新异甘草素能促进化疗药物的化疗增敏。与异甘草 素比较，其结果新异甘草素优于异甘草素。
具体实施方式
实施例1
原料：异甘草素50mg，紫杉醇1.5mg
制备方法：按比例取原料药，按常规制剂工艺制备成片剂。
实施例2
原料：异甘草素40mg，阿霉素3mg
制备方法：按比例取原料药，按常规制剂工艺制备成胶囊剂。
实施例3
原料：异甘草素60mg，5-氟尿嘧啶0.5mg
制备方法：按比例取原料药，按常规制剂工艺制备成注射剂。
实施例4
原料：新异甘草素45mg，阿霉素2mg
制备方法：按比例取原料药，按常规制剂工艺制备成胶囊剂。
实施例5
原料：新异甘草素55mg，紫杉醇1mg
制备方法：按比例取原料药，按常规制剂工艺制备成片剂粉针剂。
实施例6
原料：异甘草素50mg，阿霉素1.5mg
制成药剂盒，每个药剂盒含异甘草素、阿霉素各一瓶。异甘草素和阿霉 素分别口服和静脉注射，每日一次。
实施例7
原料：异甘草素50mg，紫杉醇2mg
制成药剂盒，每个药剂盒含异甘草素、紫杉醇各一瓶。异甘草素和紫杉 醇分别口服和静脉注射，每日一次。