技术领域
本发明公开一种赫赛汀修饰的载多西他赛的三重靶向纳米粒载体系统，同时还提供了该靶向纳米粒载体系统的制备方法，涉及医药技术领域。
背景技术
多西他赛（Docetaxel，DTX），是第二代紫杉烷类抗肿瘤药物，属于植物类抗肿瘤药微管抑制剂，其抗肿瘤活性是紫杉醇的2 ~ 4倍，已被FDA批准用于卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌以及前列腺癌的临床治疗。目前已上市的剂型只有多西他赛注射液（Taxotere），但由于DTX水溶性差，其生物利用度较低，增溶剂吐温-80带来严重的超敏反应，改变药物体内行为。因此选择合适的载体系统提高DTX生物利用度，降低不良反应，实现药物缓控释、靶向性，成为当前的研究热点。
纳米给药系统，在实现提高难溶性药物生物利用度、缓控释给药、靶向性给药、降低药物不良反应等方面展现了良好的应用前景。其中，聚合物纳米粒作为抗肿瘤药物载体，具有众多独特的优势：稳定性高，毒性低；延长药物体内循环时间，静脉注射后，更易到达肿瘤部位；表面化学修饰改变电荷分布、亲疏水性等理化性质从而实现被动靶向；表面偶联靶向分子实现主动靶向；采用有特殊敏感性的材料例如酸度、温度敏感性也可以实现主动靶向。此外，纳米给药系统以其粒径的优势（<200 nm）可以在肿瘤组织中选择性滞留，即EPR效应。
赫赛汀（Herceptin），靶向HER2的单抗，已被FDA批准用于治疗HER2过表达的转移性乳腺癌。此外，赫赛汀与某些化疗药物联用时，还具有协同抗肿瘤作用。因此，赫赛汀偶联在纳米粒表面后，纳米粒既可将药物带到HER2过表达的肿瘤细胞上，又可实现与多西他赛的协同作用，从而产生更强的细胞毒性。赫赛汀修饰的载多西他赛的纳米粒对治疗HER2过表达的实体瘤具有潜在的应用价值。
环己烷-1,4-二基二亚甲基丙酮缩酮（聚缩酮，PCADK），一种新型高分子材料，具有良好的生物相容性、生物降解性和特殊酸敏感性。聚缩酮在正常的碱性或中性生理环境中基本不降解，在酸性环境中快速分解为无毒的中性降解产物，不改变周围环境pH，不影响所包载药物的活性。聚缩酮载体携带药物到达具有酸性环境的肿瘤部位后，被细胞摄取，在溶酶体内迅速分解释放药物分子，从而实现靶向治疗。目前市场上尚无聚缩酮产品上市，但聚缩酮极具潜力成为未来靶向药物研究的热点。
聚乙酰亚胺（PEI），目前最高效的基因传递载体，携带高密度的正电荷，有较强的细胞黏附能力。进入细胞后的PEI能够通过质子海绵效应引发溶酶体破裂，释放药物。高分子量的PEI（25 kD）转染效率高，但细胞毒性大。但与其它载体材料联用，可降低其细胞毒性。此外，PEI（25 kD），呈分枝状结构，分子内有大量高反应活性伯氨，可与富含羧基的靶向分子相偶联。赋予纳米粒靶向性。
聚乳酸羟基乙酸共聚物（PLGA），是缓控释制剂领域应用最广泛的注射用制剂的缓控释基质骨架。其中，德国柏林格殷格翰低黏度的RG 5050系列，分子量小，降解周期短，其释放行为学对于维持肿瘤治疗所需的药物治疗窗有理想的效果。
发明内容
本发明提供一种赫赛汀修饰的载多西他赛的三重靶向纳米粒载体系统，实现了药物的三重靶向性，即生物靶向性、理化靶向性、静电吸附靶向：纳米粒通过表面的修饰分子赫赛汀抗体主动靶向癌细胞表面的抗原；纳米粒基质中的PCADK能够在肿瘤的酸性环境中加速纳米粒的降解，并释放药物；纳米粒基质中的PEI阳离子通过静电吸附作用靶向癌细胞的带负电荷的细胞膜表面。
本发明进一步公开了赫赛汀修饰的载多西他赛的三重靶向纳米粒载体系统，其特征在于：
由生物可降解性材料PLGA、阳离子材料PEI和酸敏感性材料PCADK三种聚合物为载体材料制备的具有核壳结构的纳米粒、包载于纳米粒疏水核心的多西他赛以及纳米粒亲水表面的修饰配体赫赛汀单抗构成。
本发明所述的一种赫赛汀修饰的载多西他赛的PEI/PCADK/PLGA三重靶向纳米粒传递系统的制备方法，包括：
1）分别称取5 mg多西他赛，9 mg PCADK，36 mg PLGA溶解于2 mL二氯甲烷中，作为有机相（O相），称取1.08 mg PEI超声溶解于30 mL, 2% PVA水溶液，作为水相（W相），混合O相和W相，冰浴间断超声分散制备O/W乳剂，室温低速搅拌，挥发除去二氯甲烷，过膜去除大颗粒纳米粒，离心收集，冷冻干燥；
2）上述冻干纳米粒超声分散溶解在PBS（0.1 M，pH 7.4）中，加入EDC/NHS（5：1，w/w）试剂，加入5 mg赫赛汀，三乙胺调节pH值到8.0，25℃反应4 h，离心洗涤，去除未连接的赫赛汀，冷冻干燥，4℃保存；即得赫赛汀修饰的载多西他赛的PEI/PCADK/PLGA三重靶向纳米粒传递系统。
本发明所述的制备方法，其特征在于：PLGA为羧基封端，型号为RG 502H，黏度为0.16 ~ 0.24 dl/g。
本发明所述的制备方法，其特征在于：PCADK为环己烷-1,4-二基二亚甲基丙酮缩酮，分子量范围9000 ~ 10000。
本发明所述的制备方法，其特征在于：乙酰亚胺（PEI）为分支结构聚乙酰亚胺（bPEI），分子量为25 kD。
本发明所述的制备方法，其特征在于：多西他赛理论载药量为10%，PCADK：PLGA=2：8。
本发明所述的制备方法，其特征在于：PEI在2% PVA水溶液中比例为3.6%（w/v）。
本发明所述的制备方法，其特征在于：冰浴间断超声功率为100W，超声时间120s。
本发明所述的制备方法，其特征在于：O相与W相的体积比为1：15。
本发明的积极效果在于：制备的纳米粒实现了药物的三重靶向性：（1）生物靶向性，利用连接在纳米粒表面的赫赛汀单抗分子；（2）理化靶向性，利用纳米粒载体中的聚缩酮对肿瘤酸性环境敏感的特点，而且其中性降解产物不改变环境pH；（3）静电吸附作用，利用纳米粒载体中的PEI的氨基基团，偶联单抗分子，同时富余的正电荷增加与肿瘤细胞间的黏附性，增加了细胞摄取。
附图说明
图1为纳米粒的示意图；
图2为纳米粒的粒径电位分布图；
图3为纳米粒的SEM图；
图4为纳米粒的体外释药曲线；
图5为纳米粒的细胞毒实验；
图6为SKBR3和A549细胞对纳米粒摄取的激光共聚焦结果；
图7为SKBR3和A549细胞对纳米粒摄取的流式细胞仪结果。
具体实施方式
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例1
注：DTX-Ps为载多西他赛的PLGA纳米粒；DTX-PPs为载多西他赛的PCADK/PLGA纳米粒；DTX-PPPs为载多西他赛的PEI/PCADK/PLGA纳米粒；HER-DTX-PPPs为赫赛汀修饰的载多西他赛的PEI/PCADK/PLGA纳米粒。
HER-DTX-PPPs处方
O相：多西他赛，5 mg；PCADK，9 mg；PLGA，36 mg；二氯甲烷，2 mL。
W相：PEI，1.08 mg；2% PVA水溶液，30 mL。
HER-DTX-PPPs制备工艺
多西他赛，PCADK，PLGA溶解于二氯甲烷中，作为有机相（O相），PEI超声溶解于2% PVA水溶液，作为水相（W相），混合O相和W相，冰浴间断超声分散制备O/W乳剂，室温低速搅拌，挥发除去二氯甲烷，过膜去除大颗粒纳米粒，离心收集，冷冻干燥；取上述10 mg冻干纳米粒超声分散溶解在2 mL PBS（0.1 M，pH 7.4）中，加入50 mg EDC和10 mg NHS试剂，加入5 mg赫赛汀，三乙胺调节pH值到8.0，25℃反应4 h，离心洗涤，去除未连接的赫赛汀，冷冻干燥，4℃保存。
DTX-PPPs处方
O相：多西他赛，5 mg；PCADK，9 mg；PLGA，36 mg；二氯甲烷，2 mL。
W相：PEI，1.08 mg；2% PVA水溶液，30 mL。
DTX-PPPs制备工艺
多西他赛，PCADK，PLGA溶解于二氯甲烷中，作为有机相（O相），PEI超声溶解于2% PVA水溶液，作为水相（W相），混合O相和W相，冰浴间断超声分散制备O/W乳剂，室温低速搅拌，挥发除去二氯甲烷，过膜去除大颗粒纳米粒，离心收集，冷冻干燥，4℃保存。
DTX-PPs处方
O相：多西他赛，5 mg；PCADK，9 mg；PLGA，36 mg；二氯甲烷，2 mL。
W相：2% PVA水溶液，30 mL。
DTX-PPs制备工艺
多西他赛，PCADK，PLGA溶解于二氯甲烷中，作为有机相（O相），2% PVA水溶液作为水相（W相），混合O相和W相，冰浴间断超声分散制备O/W乳剂，室温低速搅拌，挥发除去二氯甲烷，过膜去除大颗粒纳米粒，离心收集，冷冻干燥，4℃保存。
DTX-Ps处方
O相：多西他赛，5 mg；PLGA，36 mg；二氯甲烷，2 mL。
W相：2% PVA水溶液，30 mL。
DTX-Ps制备工艺
多西他赛，PLGA溶解于二氯甲烷中，作为有机相（O相），2% PVA水溶液作为水相（W相），混合O相和W相，冰浴间断超声分散制备O/W乳剂，室温低速搅拌，挥发除去二氯甲烷，过膜去除大颗粒纳米粒，离心收集，冷冻干燥，4℃保存。
表1. 纳米粒处方表（平均值±SD）
实施例2
纳米粒的表征：粒径、电位、形态、包封率及载药量。
采用激光粒度仪分析纳米粒粒径及电位分布，结果如图2所示。纳米粒的平均粒径在180 nm左右，电位在 20 mV左右（表2）。
采用扫描电子显微镜观测纳米粒的形貌，结果如图3所示。纳米粒粒径在200 nm以下，呈圆整球形，表面粗糙，粒度均一，有少量团聚现象，这是由于纳米粒表面连接了赫赛汀分子。
采用高效液相色谱（HPLC）测定纳米粒的包封率和载药量。HPLC条件：XDB C18柱 5μm，4.5mm×250mm，柱温30℃，检测波长230 nm，流动相70%甲醇，流速1 mL/min，进样量20 μL（表2）。
如表2所示，四种纳米粒包封率从高到低依次为：DTX-PPPs > HER-DTX-PPPs > DTX-Ps > DTX-PPs。这是由于材料本身的性质所导致，PCADK能够降低药物的包封率，PEI能够增加药物的包封率。具体增加或降低的程度取决于添加的聚合物的水平。
表2. 纳米粒表征参数（平均值±SD）
Group Szie (nm) PDI Zeta potential (mV) EE (%) DL (%) DTX-Ps 156.8 ± 6.7 0.32 ± 0.022 -20.9 ± 1.25 73.4 ± 3.3 7.34 ± 0.33 DTX-PPs 132.2 ± 5.2 0.18 ± 0.023 -17.6 ± 1.59 62.1 ± 6.8 6.21 ± 0.68 DTX-PPPs 160.7 ± 4.5 0.14 ± 0.041 23.5 ± 2.31 81.2 ± 5.9 8.12 ± 0.59 HER-DTX-PPPs 183.4 ± 8.9 0.45 ± 0.024 20.6 ± 0.87 78.2 ± 5.9 6.23 ± 0.45
注：包封率(EE) =实测多西他赛的含量/投入多西他赛的含量×100%；载药量（DL）=实测多西他赛的含量/纳米粒的质量×100%。
实施例3
纳米粒的体外释放
采用透析方法及HPLC考察纳米粒体外释放行为。体外释放介质：pH 6.0 PBS（1% Tween-80），pH 7.4 PBS（1% Tween-80）；透析袋截留分子量（MWCO，8 kD）。取样点：0.5 h，1 h，2 h，3 h，4 h，6 h，1 d，2 d，3 d，4 d。
结果如图4所示。HER-DTX-PPPs在pH 6.0 PBS中释放明显比pH 7.0 PBS中快，这是由于PCADK在中性环境下基本不降解，肿瘤环境为弱酸性环境，加速了PCADK的降解，短时间内释放出大量的药物，以达到杀死肿瘤细胞的药物治疗窗。pH 6.0 条件下，DTX累积释放率为81.3%，而在pH 7.0条件下，DTX累积释放率为77.2%，说明在pH 7.0条件下，PCADK没有完全降解，纳米粒没有破裂，从而导致了药物释放不完全。
实施例4
细胞毒实验
人类乳腺癌细胞SKBR3及A549培养于DMEM培养基（10% 胎牛血清、1% 青霉素-链霉素）中，培养瓶置于37℃，5% CO2培养箱中。取对数生长期的细胞进行实验。其中，SKBR3细胞过表达HER2抗原，A549细胞不表达HER2抗原。
以1×104个/孔的密度将处于对数期的细胞接种于在96微孔板中，37℃培养24 h使其贴壁，第二天去除培养液，分别加入含药培养基，37℃孵育4 h后，去除含药培养基，更换新鲜培养基，继续培养72 h。加入MTT试剂，检测并计算细胞存活率。
结果如图5所示，四种纳米粒细胞毒从高到低依次为：HER-DTX-PPPs > DTX-PPPs > DTX-PPs， DTX-Ps > DTX。HER-DTX-PPPs细胞毒性最高，由于HER-DTX-PPPs具有三重靶向性。DTX-PPPs毒性其次，由于缺少了HER的生物靶向性。DTX-PPs和DTX-Ps毒性再次，由于缺少了PEI的静电吸附作用，DTX-PPs和DTX-Ps毒性基本没有显著性差异，说明在处方添加量下PCADK对纳米粒的靶向性影响并不大。
实施例5
纳米粒的细胞摄取实验
细胞摄取实验中使用Rhodamine B标记纳米粒，具体制备工艺见实施例1，其中5 mg 多西他赛被 2 mg Rhodamine B所取代。
激光共聚焦显微成像
以2×104个/孔的密度将处于对数期的细胞接种于玻底培养皿中，37℃培养24 h使其贴壁，第二天去除培养液，分别加入无血清的含药培养基（Rhodamine B标记的纳米粒），37℃孵育1 h后，去除含荧光纳米粒的培养基，PBS清洗三次，4%甲醛固定细胞，DAPI染色，激光共聚焦显微镜下成像。Rhodamine B激发波长Ex=540 nm，发射波长Em=625 nm。
流式细胞仪定量分析
以1×105个/孔的密度将处于对数期的细胞接种于在24孔板中，37℃培养24 h使其贴壁，第二天去除培养液，分别加入无血清含药培养基（Rhodamine B标记的纳米粒），37℃孵育3 h后，去除含荧光纳米粒的培养基，PBS清洗三次，胰酶消化收集细胞，PBS重悬，进行流式细胞分析。激光通道FL3检测Rhodamine B标记纳米粒的荧光。
细胞摄取实验结果如图6，7所示。Rhodamine B标记的纳米粒呈红色荧光，发光强弱取决于肿瘤细胞摄取的含量。在过表达HER2的SKBR3细胞中，红色荧光出现在细胞质区域，说明肿瘤细胞对纳米粒有较高的摄取率。相比于不表达HER2的A549细胞，红色荧光相对不明显，说明肿瘤细胞对纳米粒的摄取率主要依赖于其生物靶向性，即表面的HER分子。在流式细胞分析中，肿瘤细胞对纳米粒的摄取被定量分析。如图7所示，SKBR3细胞对纳米粒摄取显著高于A549细胞。再一次验证了赫赛汀修饰的载多西他赛的PEI/PCADK/PLGA三重靶向纳米粒载体系统对HER2过表达的乳腺癌细胞具有明显的疗效。