夫西地酸或其药用盐在制备抗手足口病药物中的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201610008433.0 (22)申请日 2016.01.04 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105582015 A (43)申请公布日 2016.05.18 (73)专利权人 中山大学 地址 510275 广东省广州市海珠区新港西 路135号 (72)发明人 曾施暖 郭学敏 (74)专利代理机构 北京正理专利代理有限公司 11257 代理人 赵晓丹 张文祎 (51)Int.Cl. A61K 31/56(2006.01) A61P 31/14(2006.01。

2、) (56)对比文件 Jennifer E. Acornley et al “Antiviral activity of sodium fusidate and related compounds” . Br.J.Pharmac.Chemother .1967, Jorgen Slots. “Oral viral infections of adults” . Periodontology .2000,第49卷 审查员 江涵 (54)发明名称 夫西地酸或其药用盐在制备抗手足口病药 物中的应用 (57)摘要 本发明公开了夫西地酸或其药用盐在制备 抗手足口病药物中的应用。 夫西地酸或其药用盐 临床。

3、副反应较少、 毒性低、 安全性高， 且具有抗肠 病毒EV71和柯萨奇病毒CAV16活性， 具有开发为 治疗手足口病的药物或先导化合物的潜在应用 价值。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图2页 CN 105582015 B 2018.03.27 CN 105582015 B 1.夫西地酸或其药用盐在制备抗柯萨奇病毒A16和肠道病毒71药物中的应用。 2.根据权利要求1所述的夫西地酸或其药用盐在制备抗柯萨奇病毒A16和肠道病毒71 药物中的应用， 其特征在于， 所述药物是以夫西地酸或其药用盐为有效成分与药学可接受 的辅料组合制成。 3.根据权利要求2所述的夫西地酸或其药用盐在制备抗柯萨奇。

4、病毒A16和肠道病毒71 药物中的应用， 其特征在于， 所述药物为口服制剂、 注射制剂或局部施用制剂。 4.根据权利要求1所述的夫西地酸或其药用盐在制备抗柯萨奇病毒A16和肠道病毒71 药物中的应用， 其特征在于， 所述药用盐为钠盐。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105582015 B 2 夫西地酸或其药用盐在制备抗手足口病药物中的应用 技术领域 0001 本发明属于医药新用途领域。 更具体地， 涉及一系列夫西地酸或其药用盐在制备 抗手足口病药物中的新用途。 背景技术 0002 手足口病(hand-foot-and-mouth disease， HFMD)是由肠道病毒引起的急性传。

5、染 病， 主要在5岁以下儿童中发病。 HFMD主要临床症状为手、 足、 口腔等部位斑丘疹、 疱疹， 重症 患者可出现严重的神经系统疾病， 甚至死亡。 引发HFMD的肠道病毒有20多种(型)， 其中以柯 萨奇病毒A16型(CVA16)和肠道病毒71型(EV71)最为常见， 其它不同型的肠道病毒和柯萨奇 病毒也可致病。 EV71和CVA16具有高度传染性， 感染呈全球性分布， 特别是在亚太地区， 所引 起的手足口病已成为一种严重危害社会公众健康的疾病。 由于缺乏特异、 高效的抗病毒药 物， 根据手足口病诊疗指南(2013年版)， 目前主要采取隔离和对症治疗。 因此， 急需抗EV71 和CVA16等。

6、肠病毒药物的研制与开发。 0003 新药研发时间长、 研发成本高昂， 从现有药物中筛选抗病毒药物则是一种快速、 经 济的有效策略。 夫西地酸由梭链孢酸脂球菌产生， 属于梭链孢酸类抗生素， 临床上用其钠盐 (夫西地酸钠)进行抗感染治疗。 夫西地酸是一类窄谱抗生素， 主要用于G+菌感染治疗， 包括 金黄色葡萄球菌、 表皮葡萄球菌、 梭状芽孢菌属、 棒状杆菌等， 尤其在控制耐药金黄色葡萄 球菌感染方面起了重要的作用； 同时， 该药也可抗多种厌氧菌。 夫西地酸是通过抑制细菌延 长因子G(FE-G)的功能而影响核糖体转位、 阻碍细菌蛋白合成而发挥抗菌机制的。 此外， 研 究表明夫西地酸还具有抗HIV和J。

7、CV病毒活性， 但抗病毒作用机制并不清楚。 除此之外， 未见 夫西地酸抗其它病毒活性的报道。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种夫西地酸或其药用盐的新用途， 即抗肠病毒EV71和柯萨 奇病毒CVA16等病毒， 从而用于制备治疗手足口病的药物。 同时为手足口病药物研发提供可 能的作用靶位和先导化合物， 为进一步结构改造、 获得更强的抗病毒化合物提供工作基础。 0005 为达到上述目的， 本发明采取的技术方案为： 0006 本发明涉及夫西地酸或其药用盐在制备抗手足口病药物中的新用途。 夫西地酸又 称梭链孢酸、 褐霉素或甾酸霉素。 由真菌中的球形梭链孢菌(Fusidium coccineum。

8、)或某些 头孢霉(Cephalosporium spp)产生。 临床实践表明夫西地酸的毒副反应小， 儿童亦适合使 用。 其药用盐多选用钠盐， 即夫西地酸钠。 对夫西地酸或其药用盐进行结构改造， 生成衍生 物， 这些衍生物只要具有抗肠病毒EV71和柯萨奇病毒CAV16等病毒的能力， 也都属于本发明 的保护范围。 0007 本发明所述药物是以夫西地酸或其药用盐为有效成分与药学可接受的辅料组合 制成。 所述药学可接受的辅料包括： 淀粉、 微晶纤维素、 蔗糖、 糊精、 乳糖、 糖粉、 葡萄糖、 氯化 钠、 羧甲基纤维素钠、 交联聚乙烯吡咯烷酮、 硬脂酸镁、 微粉硅胶、 维生素C、 半胱氨酸、 柠檬 说。

9、 明 书 1/5 页 3 CN 105582015 B 3 酸和亚硫酸钠、 木糖醇、 麦芽糖、 聚乙二醇、 单糖浆、 乙醇、 丙二醇、 植物油、 甘露糖中的一种 或几种。 0008 进一步地， 所述药物可以是口服制剂、 注射制剂或局部施用制剂。 剂型的选择和辅 料的用量均为本领域的常规选择。 为了达到更好的疗效， 针对婴幼儿患者， 优先采用注射制 剂。 0009 本发明的有益效果： 0010 本发明表明夫西地酸具有显著的体外抗EV71和CVA16的活性， 当MOI为0.01时， 抑 制EV71和CVA16产毒量的EC50分别为3.56 M和5.41 M。 进一步的作用机制研究提示， 夫西地 酸。

10、可能通过阻断病毒RNA合成或病毒蛋白的合成或加工而发挥抗肠病毒作用的。 目前临床 表明夫西地酸的临床副反应少、 毒性低、 安全性高， 是一类可用于儿童的抗感染用药。 鉴于 手足口病患者群主要为婴幼儿， 因此， 夫西地酸具有开发为治疗手足口病的药物或先导化 合物的潜在应用价值。 附图说明 0011 图1流式分析夫西地酸对EV71-GFP所携带报告基因GFP表达的影响及抗病毒活性。 将EV71-GFP按MOI1PFU/cell感染Vero细胞后， 去除感染液， 加入含有不同浓度夫西地酸 的培养基。 37培养18-20h后用流式细胞仪分析细胞的GFP荧光表达情况， 以未加药物的 GFP阳性细胞率作为。

11、100， 计算经药物处理后的细胞GFP相对阳性率， 数值为三次重复实验 的平均值SD。 流式图为三次独立重复实验中的一次。 0012 图2通过产毒量减少(virus titer reduction assay)分析夫西地酸的抗病毒活 性。 将EV71-MZ201405和CVA16-MZ201509(MOI0.01PFU/cell)分别与RD细胞孵育1h后去除 病毒上清， 添加含有不同浓度夫西地酸的培养基， 药物浓度呈倍比稀释； 以未加药物的感染 细胞为对照。 感染后48h后收集上清， 采用空斑法测定病毒滴度。 将对照细胞上清测得的病 毒滴度设定为100， 经药物处理的细胞上清中的相对病毒滴度(。

12、)(对照组病毒滴度- 药物处理组病毒滴度)/对照组病毒滴度100。 每种药物浓度下的相对病毒滴度百分比 为三次重复实验的平均值SD。 0013 图3夫西地酸加入时间对产毒量的影响。 将EV71-MZ感染RD细胞(MOI5)， 分别在 感染前1h(-1h)及感染后0h、 1h、 2h、 4h、 6h及8h加入100 M夫西地酸， 以未加药物的感染细胞 为对照， 于感染后10h收集上清并通过空斑法测定病毒滴度， 将对照组上清的病毒滴度设定 为100， 计算药物处理组的相对产毒量。 每种加药时间下的相对病毒量百分比为三次重复 实验的平均值SD。 0014 图4夫西地酸对肠病毒RNA合成的影响。 将E。

13、V71-MZ201405感染RD细胞(MOI5)后 立即加入100 M夫西地酸， 以未加药物的细胞作为对照， 分别于感染后2h、 4h、 6h及8h提取总 RNA， 通过反转录-定量PCR(RT-QPCR)测定病毒RNA水平。 以GAPDH mRNA水平为内参， 将2h时 对照细胞的病毒RNA相对丰度设定为1。 实验重复三次。 具体实施方式 0015 为了更清楚地说明本发明， 下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。 本领 域技术人员应当理解， 下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的， 不应以此限制本 说 明 书 2/5 页 4 CN 105582015 B 4 发明的保护范围。 001。

14、6 药品与试剂 0017 本发明所测试的夫西地酸购自大连美仑生物技术有限公司； 用DMSO配制成浓度为 25.6mM的药物贮存液； 使用时用含10血清的DMEM培养基依次进行2倍稀释， 使用终浓度分 别为256、 128、 64、 32、 16、 8、 4、 2、 1、 0.5和0.25 M。 试剂包括： 1PBS(NaCl 8g/L,KCl 0.2g/ L,Na2HPO42.72g/L,NaH2PO424g/L,pH 7.2)， DMEM(Gibco) ,胎牛血清(Sigma)， 0.05 Trypsin-EDTA(GIbco)， 多聚甲醛(生工生物)， 结晶紫(珠海贝索生物技术有限公司)，。

15、 MTT (Sigma)， DMSO(Sigma) ,Trizol reagent(Invitrogen)， PrimeScript RT reagent Kit (Takara)， TransStart Tip Green qPCR SuperMix(全式金)。 0018 细胞及病毒株 0019 293A-SCARB2细胞稳定组成型表达EV71的天然受体SCARB2(human scavenger receptor class B,member 2， 清道夫受体B2)； 横纹肌肉瘤RD细胞和非洲绿猴肾Vero细胞 对EV71高度敏感， 广泛用来分离、 扩增EV71和CVA16。 EV71-G。

16、FP为携带报告基因GFP的从北京 地区分离的毒株； EV71-MZ210405是从广东地区重症手足口病患儿分离得到的高致病性肠 病毒EV71毒株； CAV16-MZ210509是从广东地区重症手足口病患儿分离得到的高致病性柯萨 奇病毒16毒株。 0020 仪器 0021 细胞培养箱(Thermo)， 倒置显微镜(Leica)， 倒置荧光显微镜(Leica)， 流式细胞仪 (BD AccuriTMC6)， 定量PCR仪(BioRad)。 0022 实施例1 0023 将EV71-MZ201405和CVA16-MZ201509分别感染Vero或RD细胞， 在不同药物浓度下， 发明人通过流式分析病毒。

17、基因组携带的报告基因GFP的表达情况、 观察病毒感染引起的细 胞病变效应(CPE)、 以及空斑分析子代病毒的产生情况， 评价了夫西地酸钠对病毒EV71和 CAV16的复制是否具有抑制作用、 对宿主细胞是否具有保护作用。 0024 1.1药物的细胞毒效应： 将293A-SCARB、 RD以及Vero细胞按1x104/每孔分别接种于 96孔中， 在5CO2、 37条件下培养过夜， 经一系列倍比稀释的夫西地酸处理细胞48h后， 用 MTT法检测药物对细胞的毒性； 以相同条件下培养、 未经药物处理的细胞为对照； 每组细胞 三个重复孔， 计算各组细胞的生长抑制率。 生长抑制率(对照组平均OD值-实验组平。

18、均OD 值)/对照组平均0D值100。 结果显示夫西地酸钠对293A-SCARB2、 RD和Vero细胞的CC50 均大于256 M。 0025 1.2通过显微镜观察细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)， 检测夫西地酸抗 EV71和CVA16、 保护细胞的效果： 病毒介导的CPE指病毒在细胞内增殖引起的细胞退形性病 变， 表现为细胞皱缩、 变圆、 出现空泡、 死亡和脱落等， 是判断病毒增殖的最常用指标之一。 将RD细胞接种于96孔中， 在5CO2、 37条件下培养18-20h后， 分别将1000TCID50的EV71- MZ201405和CVA16-MZ201509病毒感。

19、染1h， 更换含有不同浓度夫西地酸钠的培养基， 置于37 ， 5CO2培养箱中培养， 每天在显微镜下观察细胞病变状态,当未加药物的对照细胞出现 75以上病变时， 终止实验， 观察并记录加药组的CPE程度， CPE的记录方法为:无CPE为 “-” ， 25细胞出现病变为 “+” ； 2550细胞病变为 “+” ； 5075细胞病变为 “+” ； 75 100的细胞病变为 “+” ， 结果见表1。 夫西地酸具有CPE抑制效应， 随着药物浓度升高 说 明 书 3/5 页 5 CN 105582015 B 5 CPE效应逐步减轻、 细胞状态变好。 0026 表1.夫西地酸对EV71(MZ201405)。

20、和CVA16(MZ201509)引起的CPE的拮抗作用 0027 0.250.51248163264128256 EV71-MZ201405+- CVA16-MZ201509+- 0028 1.3流式分析GFP检测夫西地酸对EV71-GFP的抗病毒效果： 将Vero细胞接种于96孔 板中过夜培养， 按MOI1PFU/cell接种EV71-GFP病毒， 感染1h后更换为含有高(100 M)、 中 (20 M)、 低(1 M)三种浓度的夫西地酸钠培养基， 在5CO2、 37培养18-20h后， 经胰酶消 化、 PBS清洗、 多聚甲醛固定， 用流式细胞仪分析细胞的GFP荧光表达情况， 以未加药物的G。

21、FP 阳性细胞率作为100， 计算药物处理后的GFP阳性细胞相对百分比， 数值为三次重复实验 的平均值SD。 夫西地酸抑制EV71-GFP表达的效果明显， 结果见图1。 0029 1.4产毒量减少分析夫西地酸对EV71和CVA16的抗病毒活性： 将EV71-MZ201405和 CVA16-MZ201509(MOI0.01PFU/cell)分别与RD细胞孵育1h后去除病毒上清， 分别添加含 有不同浓度夫西地酸钠的培养基， 药物浓度呈倍比稀释， 分别为0.25、 0.5、 1、 2、 4、 8、 16、 32、 64、 128和256 M； 以未加药物的感染细胞为对照。 感染后48h后收集上清， 。

22、采用空斑法测定病 毒滴度。 将对照细胞上清测得的病毒滴度设定为100， 经药物处理的细胞上清中的相对病 毒滴度()(对照组病毒滴度-药物处理组病毒滴度)/对照组病毒滴度100。 每种药 物浓度下的相对病毒滴度百分比为三次重复实验的平均值SD。 以药物浓度的对数值做横 坐标、 相对病毒滴度为纵坐标， 通过SPSS 20软件使用Probit回归法计算药物抑制空斑形成 的EC50(图2)， 夫西地酸对EV71和CVA16表现出明显的抗病毒活性。 0030 1.5空斑法测定病毒滴度： 将RD细胞接种于96孔板， 1x104cell/ml， 过夜培养后， 接 种按10倍比稀释的病毒上清， 每种稀释度接种。

23、10个孔， 测定TCID50。 将Vero细胞接种于6孔 板中， 在5CO2、 37条件下培养18-20h后， 将100TCID50的EV71-MZ201405或CVA16- MZ201509病毒感染1h,弃去上清,加入含1.2甲基纤维素以及不同浓度夫西地酸钠的培养 基培养4天左右， 经多聚甲醛固定、 结晶紫染色、 清水漂洗、 晾干后作空斑计数， 计算病毒滴 度。 0031 实施例2 0032 2.1检测夫西地酸加入时间对抗病毒活性的影响： 将5x104个RD细胞接种至24孔板 培养1824h后用MOI5的EV71-MZ201405感染， 于感染前1h(-1)及感染后0h、 1h、 2h、 4。

24、h、 6h、 8h加入100 M的夫西地酸钠， 感染后10h收集上清， 通过空斑分析测定病毒滴度。 作为对 照， 将病毒感染细胞后， 在不同时间点单加DMSO， 于感染后10h收集上清并测定病毒滴度， 排 除溶剂DMSO对病毒产生的影响。 如图3所示， 感染前至感染后2h加入药物具有相似的抑制病 毒产生活性， 感染4h后再加入夫西地酸钠则对病毒滴度的抑制效应明显减弱， 说明夫西地 酸在病毒复制的早期阶段(包括吸附、 进入及脱衣壳)或晚期阶段(组装及释放)并不发挥作 用， 此结果提示夫西地酸阻断EV71的复制很可能发生在RNA复制或蛋白合成阶段。 0033 2.2RT-QPCR检测夫西地酸对病毒。

25、RNA合成的影响： 将5x104Vero细胞接种于24孔 板， 培养24小时后用MOI10的EV71-MZ201405感染1h， 去除病毒上清并加入含有DMSO或100 M夫西地酸钠的培养基。 于感染后2h， 4h， 6h， 8h分别用Trizol提取细胞总RNA。 经DNase消化 说 明 书 4/5 页 6 CN 105582015 B 6 后， 根据PrimeScript RT reagent Kit说明书进行反转录； 然后以cDNA为模板进行QPCR； 针 对EV71的 引物为5-TGTATGTCTCATTATCAGGGG-3(SEQ ID No .1) 和5- CCACCTGTTGC。

26、TTGTAACCGT-3 (SEQ ID No.2)， 扩增子为EV712C片段； 以细胞的GAPDH为内参 进行校正， 引物为5 -GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3 (SEQ ID No.3)， 5 -GAAGATGGTGATGGGATTTC- 3 (SEQ ID No.4)。 PCR采用两步法： 9430sec,945sec,6030sec， 42cycles。 2h时对照 细胞的病毒RNA相对丰度设定为1， 实验重复三次。 如图4所示， 夫西地酸对病毒RNA能明显抑 制病毒RNA的合成， 阻断机制可能发生在RNA复制或病毒蛋白合成环节。 该结果与药物加入 时间对抗病毒活性的影响一。

27、致。 0034 显然， 本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例， 而并非是对 本发明的实施方式的限定， 对于所属领域的普通技术人员来说， 在上述说明的基础上还可 以做出其它不同形式的变化或变动， 这里无法对所有的实施方式予以穷举， 凡是属于本发 明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。 说 明 书 5/5 页 7 CN 105582015 B 7 0001 序 列 表 1/1 页 8 CN 105582015 B 8 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 9 CN 105582015 B 9 图3 图4 说 明 书 附 图 2/2 页 10 CN 105582015 B 10 。