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1、10申请公布号CN104059138A43申请公布日20140924CN104059138A21申请号201410175682X22申请日20140428C07K14/415200601C12N15/29200601C12N15/84200601A01H5/0020060171申请人中国农业大学地址100193北京市海淀区圆明园西路2号72发明人于静娟李丛岳静74专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人王文君54发明名称调节谷子抗逆能力的转录因子SIARDP及其编码基因与应用57摘要本发明提供了一种调节谷子抗逆能力的转录因子SIARDP及其编码基因与应用。所述转录因子的氨基酸序。
2、列如SEQIDNO1所示，编码基因如SEQIDNO2所示。利用所述调节谷子抗逆能力的转录因子SIARDP及其编码基因，本发明提供了增强植物抗非生物胁迫的新方法，有利于农业生产。51INTCL权利要求书1页说明书4页序列表3页附图5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页序列表3页附图5页10申请公布号CN104059138ACN104059138A1/1页21一种调节谷子抗逆能力的转录因子SIARDP，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO1所示。2编码权利要求1所述转录因子SIARDP的基因。3根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID。
3、NO2所示。4含有权利要求2或3所述基因的载体。5权利要求1所述的转录因子在提高植物抗逆性上的应用。6根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述转录因子通过调控干旱胁迫相关基因的表达来提高植株耐旱能力。7权利要求2或3所述基因在提高植物耐旱能力上的应用。8根据权利要求7所述的应用，其特征在于，超表达所述基因能够提高植物对干旱和高盐的耐受力。权利要求书CN104059138A1/4页3调节谷子抗逆能力的转录因子SIARDP及其编码基因与应用技术领域0001本发明涉及植物基因，具体地说，涉及一种调节谷子抗逆能力的转录因子SIARDP及其编码基因与应用。背景技术0002自然界中植物的生长和发育会受到。
4、许多不良自然灾害的影响，其中干旱、高温、低温、盐碱和病虫害是限制作物产量的主要因素。我国正处在快速工业化进程中，随着工业化的加剧，环境所承受的压力越来越大，各种极端的气候频频出现，严重威胁着我国的粮食安全。干旱是我们国家面临的严重环境威胁之一。据统计，我国大约有1/2的国土面积处在干旱和半干旱状态，并且我国的水资源呈现南多北少、东多西少分布不均的现象。因此，研究植物本身的抗旱机制，提高植物对干旱胁迫的耐受力，从而获得适宜干旱半干旱地区种植且具有优良农艺性状的作物品种，在实际的农业生产中具有非常重要的意义。0003在植物逆境胁迫信号转导通路中，DREB和AREB类转录因子是两类起调控作用重要因子。
5、，它们分别属于不依赖ABA和依赖ABA的信号转导通路。从1997年利用酵母单杂首次克隆到DREB类转录因子到目前，对DREB类转录因子的研究已经有十多年的时间。DREB类转录因子主要参与植物抵御非生物胁迫的信号调控。在植物中不同的DREB类转录因子有着不同的功能，有的对植物中胁迫应答下游基因起到激活作用，有的起到抑制作用，有的在植物中超表达会影响转基因植株正常生长，有的则不会影响。对DREB类转录因子下游靶基因的研究发现，不同的转录因子对所结合的DRE元件碱基偏好性不同，所以它们下游所选择的靶基因也不同。对DREB转录因子上游调控基因的研究，首先被报道的是ICE1，可以调控与低温胁迫相关的DR。
6、EB1的转录。但对于DREB2类转录因子的调控报道较少。目前，大部分DREB类转录因子属于不依赖ABA的信号通路，但已有很多报道显示部分DREB类转录因子的转录水平会受外源ABA的诱导。这些DREB类转录因子在受到非生物胁迫时很可能参与到依赖和不依赖ABA的两种信号通路中，这说明非生物胁迫调控网络中两种信号通路并不是相对孤立的，而是相互联系，相互补充的。发明内容0004本发明的目的是提供一种调节谷子抗逆能力的转录因子SIARDP及其编码基因与应用。0005为了实现本发明目的，本发明首先提供一种调节谷子抗逆能力的转录因子SIARDP，其氨基酸序列如SEQIDNO1所示。0006本发明还提供了编码。
7、所述转录因子SIARDP的基因。0007进一步地，所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO2所示。0008本发明还提供了含有前述基因的载体。0009本发明还进一步提供了前述转录因子在提高植物抗逆性上的应用，所述转录因子说明书CN104059138A2/4页4通过调控干旱胁迫相关基因的表达来提高植株耐旱能力。0010本发明还进一步提供了前述基因在提高植物耐旱能力上的应用，超表达所述基因能够提高植物对干旱和高盐的耐受力。0011本发明的有益效果在于0012本发明首次通过酵母单杂技术从谷子非生物胁迫CDNA文库中筛选到了一个编码DREB类转录因子的CDNA，称之为SIARDP。QRTPCRQUANT。
8、ITATIVEREALTIMEPCR和NORTHERNBLOT结果显示SIARDP受干旱、高盐、脱落酸ABSCISICACID，ABA和低温诱导表达图2。SIARDP基因在谷子的根、茎、叶和花序中都有表达，并且在叶中表达量较高。谷子原生质体亚细胞定位显示SIARDP蛋白定位于细胞核；凝胶阻滞ELECTROPHORETICMOBILITYSHIFTASSAY,EMSA实验表明原核表达的SIARDPHIS融合蛋白能与DRE元件结合；酵母转录激活实验证明SIARDP蛋白具有转录激活活性。在拟南芥中异源表达SIARDP基因能够提高植物对干旱和高盐的耐受力，干旱胁迫下转基因植株比野生型植株积累更多的脯氨。
9、酸，高盐胁迫下转基因植株的离子渗透率低于野生型植株。在谷子中超表达SIARDP提高了转基因谷子的耐旱性，并且干旱胁迫下转基因谷子比野生型谷子积累了更多的脯氨酸。超表达转基因谷子中多个启动子区存在DRE元件与干旱胁迫相关基因的表达量升高，说明超表达谷子植株中SIARDP通过调控干旱胁迫相关基因的表达来提高植株耐旱能力。0013本发明利用所述的调节谷子抗逆能力的转录因子SIARDP及其编码基因，提供了增强植物抗非生物胁迫的新方法，有利于农业生产。附图说明0014图1为本发明所述基因SIARDP的核甘酸序列。0015图2为本发明所述基因SIARDP胁迫处理下的表达模式分析。0016图3为本发明所述基。
10、因SIARDP在谷子原生质体中的亚细胞定位；A红色荧光；B绿色荧光；C绿色荧光与红色荧光叠加；D明场；BAR10M。0017图4为本发明所述基因SIARDP转录活性检测。0018图5为T3代SIARDP转基因拟南芥RTPCR检测。0019图6为SIARDP转基因拟南芥种子抗旱与抗盐分析。0020图7为SIARDP转基因拟南芥幼苗抗盐分析。0021图8为SIARDP转基因拟南芥植株盐胁迫下离子渗漏分析。0022图9为野生型和SIARDP转基因植株干旱胁迫下的表型分析。0023野生型和转基因拟南芥干旱处理表型分析。正常条件下生长3周的拟南芥停止浇水两周，复水5天，结果重复三次。0024图10为野生。
11、型和SIARDP转基因植株干旱胁迫下存活率和脯氨酸含量分析。0025A干旱胁迫下存活率统计；B干旱胁迫下拟南芥植株的游离脯氨酸含量测定。0026图11为谷子抗性愈伤的筛选和再生植株的获得；0027A转化前幼穗诱导的愈伤组织；B抗性筛选后的潮霉素抗性愈伤组织；C抗性愈伤分化出苗；D瓶中的谷子再生植株；E花盆中的谷子再生植株；F温室中的谷子再生植株。0028图12为SIARDP超表达转基因谷子在干旱胁迫下的表型分析说明书CN104059138A3/4页50029A野生型和转基因谷子干旱胁迫下表型分析；B干旱处理后，存活率统计；C干旱胁迫下野生型和转基因植株脯氨酸含量分析。具体实施方式0030以下实。
12、施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。0031实施例1受非生物胁迫诱导基因SIARDP的克隆0032将受干旱、盐和低温胁迫的谷子材料混合后，提取总RNA，构建CDNA文库。以RD29A启动子区DRE元件序列ATACTACCGACATGAGC为诱饵，利用CLONTECH公司酵母单杂试剂盒，从谷子非生物胁迫CDNA文库中克隆到了SIARDP，其全长序列见图1。NORTHERN和QRTPCR分析显示，该基因受ABA处理和干旱等非生物胁迫的诱导图2。0033实施例2SIARDP具有转录因子功能0034为了研究SIARDP在细胞中的定位情况，构建了带有GFP标签的质粒35SSIARDPGFP。另。
13、外，以已知核定位的AHL22为正对照，构建带有RFP标签的质粒35SAHL22RFP。将两个质粒共转化谷子黄化苗的原生质体，避光培养16小时后在激光共聚焦显微镜下观察SIARDP蛋白定位。结果显示，SIARDP定位位置与AHL22相同，定位于细胞核中图3，这与预测SIARDP为转录因子的性质相吻合。利用酵母转录激活系统对SIARDP的转录活性进行了分析。将SIARDP构建到PBDGAL4质粒中，转化酵母YRG2。将转化得到的阳性酵母用无菌水稀释至OD600为05，点10L至相应营养缺陷培养基上，培养3天观察。结果显示转SIARDP酵母与转正对照的酵母在双缺培养基上能生长，并且能激活LACZ表达。
14、，而转负对照酵母不能在双缺培养基上生长并且不能激活LACZ表达。这说明SIARDP作为转录因子具有转录激活活性图4。0035实施例3SIARDP异源表达拟南芥植株的获得0036为了研究SIARDP的功能，构建了35S启动子驱动的SIARDP表达载体P35SSIARDP，并通过农杆菌介导转化法将P35SSIARDP转入野生型拟南芥植株中。通过潮霉素筛选共得到48株阳性植株，经过两代筛选，在T3代得到的纯合单拷贝植株中选出3株作为进一步研究的材料，分别命名为L4、L15和L22。分别提取野生型和转基因拟南芥总RNA进行PCR检测和RTPCR检测，引物为RTSIARDPS和RTSIARDPR，转基因。
15、植株均有SIARDP插入并且转录表达图5。0037实施例4异源表达拟南芥植株的抗旱和抗盐性分析0038为了研究SIARDP在逆境胁迫中的作用和功能，首先观察了野生型拟南芥和转基因拟南芥萌发阶段对干旱胁迫和盐胁迫的响应。将春化处理后的拟南芥种子分别点种于含有200MM、300MM甘露醇和100MM、150MM、175MMNACL的MS培养基中，萌发生长8天观察并测定胁迫处理材料的生物量。结果显示，在不同胁迫处理条件下，转基因拟南芥的萌发和生长状态都好于野生型拟南芥图6。这说明异源表达SIARDP的拟南芥在萌发阶段的抗旱和抗盐能力要强于野生型植株。为了进一步验证SIARDP在盐胁迫下的功能，将MS。
16、培养基上萌发生长5天的野生型和转基因拟南芥幼苗转移至含有0、150、200、250MMNACL的MS培养基中处理4天并观察结果。实验结果显示，转基因拟南芥和野生型拟南芥在无NACL胁迫MS培养基中生长无差别，但在NACL胁迫下尤其是在250MMNACL处理下，野生型拟南芥叶子完全白化，而转基因拟南芥植株生长状态相对较好图7。离子渗漏率分析显示在NACL说明书CN104059138A4/4页6胁迫处理下，转基因植株与野生型相比具有更低的离子渗漏率图8，说明转基因植株在抵御NACL胁迫方面要强于野生型植株。为了验证SIARDP在干旱胁迫下的功能，我们将在土中正常生长3周的野生型和转基因拟南芥幼苗停。
17、止浇水两周后，再恢复浇水4天，重复三次图9，统计存活率。数据为三次实验的平均值SD，P005，P001TTEST。存活率显示，约5的野生型拟南芥干旱处理后能存活，而转基因拟南芥的存活率可达58。游离脯氨酸是重要的渗透调节物，干旱胁迫下可以对细胞进行保护。游离脯氨酸含量检测显示，转基因拟南芥中游离脯氨酸的积累量要高于野生型拟南芥图10。0039实施例5SIARDP超表达谷子的获得0040为了进一步明确SIARDP功能，构建了UBIQUTIN启动子驱动的SIARDP超表达载体PUBISIARDPHPT，用于谷子转化。选取生长状态良好的冀谷11号幼穗幼穗长度小于15CM为宜为材料，切成长度约为05C。
18、M的小段，放置在诱导培养基上28黑暗培养，诱导愈伤，每两周继代一次，继代培养23次后，挑选生长状态较好、质地紧密、颜色鲜黄的谷子愈伤作为外植体，通过农杆菌介导将构建好的超表达载体进行转化。转化后的谷子愈伤在恢复培养基上黑暗恢复培养一周，然后将愈伤转到含有潮霉素的筛选培养基上进行抗性筛选。每两周继代一次，两次筛选潮霉素浓度分别为5MG/L和8MG/L。两轮筛选后的愈伤组织已经大部分褐化，少部分愈伤仍为黄色，为抗性愈伤。将抗性愈伤转移至分化培养基见光分化光周期为16H光照/8H黑暗，28，每两周继代一次。抗性愈伤见光分化两周之内在愈伤表面出现绿色芽点。当再生幼苗长出主茎后，除去周围多余的叶子，移入。
19、生根培养基进行生根，生根培养基中含有5MG/L的潮霉素进一步筛选谷子阳性幼苗。大部分谷子幼苗不能在含有潮霉素的生根培养基中生长，不能长出根系，叶子褐化死亡。少部分谷子在含有潮霉素的生根培养基中能够长出根系，根系发达后，将谷子幼苗移至温室炼苗3天，洗净根上残留的培养基后，将谷子再生苗移栽至小花盆中，一至两周后，再将成活的谷子小苗移栽至温室土壤中继续生长图11。0041实施例6SIARDP超表达谷子的抗旱性分析0042为了研究SIARDP在谷子干旱胁迫下的功能，选取了两个SIARDP超表达转基因株系L7和L15的T2代植株进行研究。为了验证SIARDP是否在干旱胁迫下发挥作用，我们对野生型谷子和S。
20、IARDP超表达转基因谷子进行了干旱胁迫处理。将吸胀1天后的野生型和转基因谷子种子每盆12棵种于土中，在28正常生长条件下生长2周，停止浇水，干旱处理2周，再恢复浇水，4天后观察。存活率统计结果显示，干旱处理条件下野生型植株存活率低于10，而SIARDP超表达转基因植株存活率在50以上。对干旱胁迫10天和12天时野生型和转基因谷子中游离脯氨酸含量进行分析，结果在转基因植株中脯氨酸含量积累较多，尤其胁迫处理12天时转基因植株中脯氨酸积累要明显高于野生型植株图12。这些结果说明，SIARDP超表达植株对干旱胁迫表现出较强的耐受力。0043虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的。
21、描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。说明书CN104059138A1/3页700010002序列表CN104059138A2/3页80003序列表CN104059138A3/3页9序列表CN104059138A1/5页10图1图2说明书附图CN104059138A102/5页11图3图4图5图6说明书附图CN104059138A113/5页12图7图8说明书附图CN104059138A124/5页13图9图10说明书附图CN104059138A135/5页14图11图12说明书附图CN104059138A14。