技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种结合IGF-1C结构域多肽的活性可注射壳聚糖水凝胶的制备方法，还涉及这类材料作为干细胞载体材料应用于组织损伤修复，增强干细胞的治疗效果.
背景技术
以干细胞为基础的细胞疗法可以为组织损伤治疗提供前景。干细胞具有自我更新和多向分化能力，可以通过转分化、旁分泌等方式参与肾脏修复。相比于药物，干细胞治疗组织损伤的一大优势在于其多样化的治疗作用可以靶向肾脏损伤病理生理学的多种机制；内源性动员或外源性输注的干细胞归巢到受损肾脏，一方面转分化为肾脏细胞直接补充丢失的小管上皮细胞，另一方面可以发挥促进增殖、减少凋亡、促进血管新生、减少炎症和调节免疫反应等作用。但是，使用外源性干细胞治疗组织损伤的过程中，递送形式是一个挑战。直接将细胞注射到组织损伤部位，很难发生整体的整合。经脉管系统注射细胞需要避免其被其他器官俘获，而且需要细胞具有定向迁移的能力。但在之前的研究中，我们发现将干细胞直接注射到缺血损伤部位，1周后仅有～1％的细胞存活。这可能与细胞处于局部恶劣(缺血缺氧、炎症、缺乏基质保护)的损伤环境有关。最近的研究显示生物支架材料作为细胞载体在调节移植细胞在受损肾脏中的细胞命运方面体现出优势。利用生物材料释放的细胞外基质与移植细胞相互作用可以改善局部微环境，增强细胞的生物学作用，并加快组织的修复和再生。壳聚糖(CS)作为一种天然大分子化合物，具有较好的组织相容性、生物可降解性及丰富的生物学活性。以CS为基础的多种类型支架材料已经在组织工程领域显示出重要的应用价值。同时，许多研究人员重视利用递送生长因子来增加组织工程化基质的生物活性。由于蛋白具有免疫原性和生物活性丢失快的缺陷，越来越多的研究支持 使用具有生物学功能的模拟活性多肽(如RGD，QK，QHREDGS)来替代生长因子(如纤维粘连蛋白、血管内皮生长因子、血管生成素-1)的功能。胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是一种强大的促有丝分裂和细胞存活的生长因子，其被认为在调控临床肾病恢复中发挥关键作用。有趣的是，最近的研究发现C结构域(IGF-1C)是IGF-1蛋白的活性区域，并且已经证明这一多肽可以促进角膜上皮伤口愈合。从这一点上来看，将活性多肽IGF-1C修饰于大分子生物支架材料可能实现载体对移植细胞特定功能的增强，从而为组织损伤修复提供新的视角。
发明内容
本发明提供了一种壳聚糖水凝胶，其特征在于，所述壳聚糖水凝胶结合了胰岛素样生长因子C结构域多肽(IGF-1C)。
本发明的壳聚糖水凝胶既具备壳聚糖生物材料的物理和化学性能，也具有胰岛素样生长因子C结构域多肽的生物活性。
本发明提供了上述壳聚糖水凝胶的制备方法，其包括：(1)胰岛素样生长因子C结构域多肽通过化学反应共价键结合到壳聚糖分子上；或者，(2)胰岛素样生长因子C结构域多肽通过物理混合结合到壳聚糖中。
在本发明的制备方法中，所述化学反应是点击化学反应和/或缩合反应。
本发明的壳聚糖水凝胶具有不同的释放胰岛素样生长因子C结构域多肽的行为。
本发明的壳聚糖水凝胶通过结合胰岛素样生长因子C结构域多肽方式来调控所述胰岛素样生长因子C结构域多肽的释放行为。
本发明的壳聚糖水凝胶具有可注射性。
本发明的壳聚糖水凝胶在制备治疗组织损伤的干细胞载体中的应用。
干细胞包括：脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、尿液来源干细胞、内皮祖细胞、心脏干细胞。
组织损伤包括肾脏损伤、心肌梗死以及皮肤缺损。
本发明提供一种结合IGF-1C多肽的生物活性壳聚糖水凝胶的制备方法。
1.IGF-1C结构域多肽的制备方法：
(1)第一个氨基酸的C端接枝在树脂上，接载率为0.6毫摩尔/克。20％的哌啶溶于N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)用于脱除氨基的Fmoc保护基团；
(2)在缩合剂O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(BTU)和催化剂N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)的共同作用下，下一个氨基酸的羧基与游离的氨基结合；重复以上步骤，多肽链会不断增长；
(3)最后将分别将叠氮化的己酸或二元酸(丁二酸、己二酸、癸二酸)连接到多肽的氨基上；
(4)用一定体积的DMF反复冲洗连有多肽的树脂(5分钟，5次)，之后再用DCM冲洗(1分钟，3次)；用三氟乙酸(TFA)处理干燥的树脂，将多肽从树脂上脱离，转移进入TFA溶液；
(5)收集溶液旋干，得到浓缩溶液；用冰冻乙醚处理，离心，得到沉淀；
(6)将沉淀溶于二甲基亚砜(DMSO)，使用高效液相色谱纯化得到IGF-1C，及末端带有叠氮或羧基的多肽产物IGF-1C-N3或IGF-1C-COOH。
2.通过点击化学反应共价结合IGF-1C多肽的壳聚糖的制备方法：
碳二亚胺碳二亚胺盐酸盐催化下冰浴中反应24小时，从而通过酰胺化反应将炔基接枝到壳聚糖分子侧基上，产物经透析纯化。第二步是通过点击化学反应将碳二亚胺盐酸盐催化下冰浴中反应24小时，从而通过酰胺化反应将炔基接枝到壳聚糖分子侧基上，产物经透析纯化。第二步是通过点击化学反应将IGF-1C-N3与炔基化壳聚糖反应，采用无水硫酸铜、抗坏血酸钠做催化剂，恒温37℃搅拌反应24小时，产物经水透析3天，冷冻干燥得CS-IGF-1C。
3.通过缩合反应共价结合IGF-1C多肽的壳聚糖的制备方法：
碳二亚胺碳二亚胺盐酸盐催化下冰浴中反应24小时，从而通过酰胺化反应将炔基接枝到壳聚糖分子侧基上，产物经透析纯化。碳二亚胺盐酸盐催化下冰浴中反应24小时，从而通过酰胺化反应将炔基接枝到壳聚糖分子侧基上，产物经透析纯化。
4.共价结合IGF-1C的壳聚糖水凝胶的制备：
(1)将CS-IGF-1C以一定浓度(质量体积分数1-5％)溶解在水中；
(2)β-甘油磷酸钠(β-GP)溶液滴加到壳聚糖溶液中，冰水浴条件下搅拌0.5小时；
(3)混合溶液转移至37℃恒温箱中，即可见凝胶化；
(4)混合溶液中β-GP终浓度为0.005-0.05M。
5.物理混合IGF-1C的壳聚糖水凝胶的制备：
(1)将壳聚糖以一定浓度(质量体积分数1-5％)溶解到醋酸(1-3％)溶液中，室温，过夜；
(2)调节溶液pH值至中性，加入一定比例的IGF-1C多肽(多肽质量分数1-5％)，混合均匀；
(3)将β-甘油磷酸钠(β-GP)溶液滴加到壳聚糖溶液中，冰水浴条件下搅拌0.5小时；
(5)混合溶液转移至37℃恒温箱中，5分钟即可见凝胶化；
(6)混合溶液中β-GP终浓度为0.005-0.05摩尔/升。
本发明提供了利用结合IGF-1C多肽的活性水凝胶负载干细胞及细胞示踪的方法。
1.脂肪间充质干细胞(ADSCs)提取与培养
(1)准备：将手术器械(弯头镊子2把，眼科剪2把)用纱布包好灭菌，后置于烘箱中烘干；无血清培养基(PS)一管；
(2)选取3～4只10周龄雄性小鼠，体重20克以上最佳，利用脱颈的方法将小鼠处死；
(3)用酒精均匀喷洒小鼠腿部以及腹部毛发，用无菌的弯镊 提起小鼠表皮，用无菌眼科剪小心分离小鼠皮肤和皮下肌肉组织；
(4)在小鼠大腿的根部有淡粉色的脂肪组织，用剪刀仔细剥离并剪下，置于无血清培养基中暂时保存；
(5)沿小鼠腹中线剪开小鼠的腹部肌肉层，打开其腹腔，在小鼠附睾附近，分布有两大块白色脂肪组织，轻轻剥离去其它组织并将脂肪组织剪下暂时保存在无血清培养基中；
(6)将盛有脂肪组织的离心管喷匀酒精充分消毒后，移入超净台中，将脂肪组织倒入无菌培养皿中，轻轻摇晃以洗涤脂肪组织；
(7)用无菌弯头镊将脂肪组织转移至一个新的盛有无菌PBS的培养皿中，轻轻转动培养皿洗涤脂肪组织。如此反复再洗涤脂肪组织3次。本步骤意在尽量去除小鼠毛发以及组织内的细菌；
(8)最后一遍洗涤后，将脂肪组织转移至新培养皿中(无PBS)，用无菌眼科剪将脂肪组织尽量剪碎(本步骤利于后期酶的消化)；
(9)用无血清培养基重悬剪碎了的脂肪组织，转移至50毫升离心管中，不加培养基使总体积达到35毫升，在1500转/分的条件下离心5分钟；
(10)离心后，将液体用离心管小心吸弃，保留漂浮在液面上及沉淀在底部的脂肪组织，后加入无菌的20毫升0.075％的Ⅰ型胶原酶溶液，用封口膜密封离心管，在37℃水浴摇床上消化1小时；
(11)消化结束后，补加培养基至总体积为45毫升，在1000转/分钟条件下离心5分钟；
(12)弃掉上清，用45毫升的培养基再次洗涤细胞沉淀，后弃上清；
(13)用10毫升ADSCs培养基重悬细胞沉淀，并铺于10厘米细胞培养盘中；
(14)铺盘后第三天给细胞换半液，第四天换全液，以后每三天换一次全液，直至细胞长满，此时的ADSCs即为原代(P0)细胞；
(15)ADSCs长至90％以上时可以传代，传代时先吸弃培养基，后用PBS清洗残余的培养基，然后再加入2毫升胰酶-乙二胺四乙酸溶 液，细胞培养箱孵育4分钟，用AD-MSCs培养基中和胰酶，于1000转/分钟离心，重悬沉淀后分盘。通常的传代比例为1:3。
(16)ADSCs的冻存:将生长良好的P1代细胞，经消化后，用PBS液洗涤2次，用冻存液(含90％的全血清+10％DMSO)重悬细胞，逐滴加入冻存管中，放入4℃冰箱预冷l0分钟，随后转移至冻存盒中放置于-80℃冰箱冻存48小时以上，最后沉入液氮中长期保存。冻存细胞浓度为l-5×106/毫升。
(17)ADSCs的复苏:将冻存细胞从液氮取出，置入37℃水浴中1-3分钟，待细胞完全解冻，用DMEM培养液稀释离心，弃上清，使沉淀重新悬浮于培养液中，按2×105/毫升接种于T75细胞培养瓶。
(18)ADSCs的表型鉴定：将P3的ADSCs按上述方法消化，离心后用PBS重悬计数，后向每个炮弹管中分装含有约15万个细胞的细胞悬液；再次离心细胞(1000转/分钟)，收集沉淀，用30微升的含有1％FBS的PBS重悬细胞沉淀，向各管中加入1微升的相应的流式抗体(CD45、CD31、CD44、CD29、CD90.2以及Sca-1)，冰上孵育30分钟，期间经常轻晃炮弹管，以防细胞沉淀；染色结束后，每管中加入1毫升的PBS溶液充分混匀后离心；离心结束后弃上清，再次重复洗涤3次；最后一次洗涤结束弃上清后，用300微升的PBS重悬细胞，用流式网过滤后转移至流式管中避光保存，24小时内上机分析；以进行任何染色的ADSCs进行空白对照，利用流式细胞仪分析各抗体的阳性百分率。
2.体内化学发光成像评价
(1)经腹腔注射水合氯醛(4％，350毫克/千克)麻醉小鼠；
(2)向小鼠经腹腔注射萤火虫荧光素酶底物D-Luciferin(150毫克/千克)；
(3)底物注射5分钟后，将小鼠放入小动物活体成像系统暗箱内，摆放好体位(俯卧位)，将其头部对准暗箱内出气孔；
(4)根据荧光信号强度调整曝光时间，一般为0.5-2分钟，连续采集图像直到信号强度开始下降；
(5)数据分析：使用Living Image软件测定每只小鼠的荧光信号 强度，进行统计学分析。
本发明提供了一种利用活性水凝胶负载脂肪间充质干细胞治疗缺血性肾脏损伤、心肌梗死以及皮肤缺损的方法。
1.急性肾脏损伤及细胞治疗
(1)高压消毒手术器械，使用医用酒精消毒手术台区域；
(2)经腹腔注射水合氯醛(4％，350毫克/千克)麻醉小鼠，于背部中部、脊柱左侧0.2厘米处纵行切开皮肤(0.8-1厘米)，分离皮下结缔组织，离断背部肌肉进入腹腔，探查并暴露左肾，可见正常肾脏呈现鲜红色；
(4)用尖镊游离肾周脂肪及筋膜，向左侧轻轻牵拉肾脏暴露肾蒂，使用微型血管夹略靠近肾脏夹闭肾蒂，约1分钟可见肾脏出现淤血呈紫黑色；
(5)肾脏缺血期间，使用浸沾温生理盐水的纱布覆盖切口并保持纱布湿润，小鼠上方暖灯照射并保持加热垫温度(37℃)恒定；
(6)缺血40分钟后移除血管夹，肉眼可见肾脏颜色即刻变为红色，使用4-0丝线逐层缝合肌层和皮肤关闭背部切口；
(7)将小鼠置于加热垫上复温，待苏醒后放回饲养笼。
在肾脏缺血再灌注后(对于重度损伤模型，在对侧肾脏切除术后)，即刻行左肾内递送细胞或水凝胶。
(8)使用镊子将肾脏轻轻提拉到体外，用细棉条或纱布条包裹并固定肾脏，防止其掉回腹腔内；
(9)使用胰岛素注射器(300微升规格)吸取输送介质(PBS或水凝胶，30微升)负载的细胞(106ADSCs)，于肾脏上极、中部和下极三个部位轻轻刺入肾脏实质(深度约3毫米)，缓慢轻推注射器(10微升/部位)，同时观察小鼠的呼吸频率；
(10)注射完成后，缓慢拔除注射器，同时使用棉球按压进针处肾脏组织止血1分钟。
2.治疗心肌梗死模型(冠状动脉左前降支永久结扎)建立及细胞-水凝胶移植：
(1)小鼠麻醉：用5％的异氟烷气体预麻小鼠，用医用胶带固定小鼠的四肢和头部于手术板上，剪开颈部气管，气管插管后接通麻醉呼吸机正压通气，调节异氟烷的含量约为1％-1.5％，呼吸频率为120次/分钟；
(2)胸部备皮，用医用酒精和碘伏进行消毒；
(3)行胸廓切开术，于第四肋间处开胸并暴露心脏，仔细撕开心包膜暴露小鼠左心室前壁；
(4)左冠状动脉起始端的下方距离左心耳约1毫米处，用7-0的缝合线结扎冠状动脉左前降支(以结扎点下方心肌的颜色变浅发白或出现紫黑色且心电图(electrocardiogram，ECG)检测显示心肌电ST段抬高为结扎成功的标志；
(5)结扎成功后于结扎位点左下、右下各1毫米处分别注射10微升生理盐水、细胞生理盐水悬液、水凝胶或凝胶-ADSCs复合物；
(6)关胸，缝合肌肉和皮肤，伤口用碘伏再次消毒，妥善饲养。
(7)假手术对照组：开胸，穿线不接扎不移植任何细胞或溶液，后关胸缝合肌肉。
3.真皮层全层皮肤损伤模型的建立及细胞-水凝胶移植：
(1)裸鼠腹腔内注射4％水合氯醛进行全身麻醉。
(2)麻醉效果满意后，75％酒精消毒裸鼠背部皮肤3遍。
(3)用眼科剪剪除全层裸鼠皮肤及肉膜，暴露肌肉层，制备出面积为l.0平方厘米的皮肤缺损区域。
(4)IV3000无菌不透水伤口敷料覆盖创面，贴膜边缘用伤口粘合剂點附于裸鼠背部皮肤。
(5)术后裸鼠单笼饲养，自第3天起每隔2天更换创面敷料。
(6)水凝胶-ADSCs以1×106/毫升的密度接种于水凝胶中，各个实验组每只裸鼠注射200微升生理盐水(不治疗组)、细胞生理盐水悬液(单纯细胞组)、水凝胶-ADSCs(对照水凝胶与细胞组)、水凝胶。
(7)术后大体观测及愈合曲线测定，每天观察并记录各组裸鼠的精神状态、进食饮水情况、活动力、大小便情况。
(8)术后每隔2天(术后第3、6、9、l2天)麻醉后首先行活体成像检测，然后去除伤口敷料、仔细清除创面渗出物、痂皮，观察创面有无感染、创面愈合情况，并进行创面拍照同时以透明薄膜描印创面。
(9)拍照后，创面重新用IV3000无菌不透水伤口敷料贴膜覆盖，贴膜边缘用伤口粘合剂點附于裸鼠背部皮肤。使用Image J软件分析各组术后第3、6、9、l2天残留创面面积，并绘制愈合曲线。
本发明的优点和积极效果：
我们使用IGF-1C修饰的水凝胶负载ADSCs通过直接注射的方式移植到损伤组织，观察到组织学和功能学的恢复。这种治疗手段可以在早期显著增强存活的组织细胞增殖，并在晚期通过结合IGF-1C的水凝胶与ADSCs的相互作用增加水凝胶注射区域和临近部位的细胞增殖而建立有益的局部微环境；水凝胶和细胞的联合移植还能够通过抑制Bax表达而减少损伤后早期肾脏细胞凋亡。该水凝胶具有有效的治疗作用、无毒副作用、损伤小、适合长期应用。
附图说明
图1表示天然人源胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的氨基酸序列以及本发明合成的C结构域多肽；
图2表示通过点击化学反应合成共价结合IGF-1C的壳聚糖(CS-IGF-1C)的步骤；
图3表示不同浓度CS-IGF-1C水凝胶对于脂肪间充质干细胞体外活性的影响；
图4A和B表示生物发光成像检测CS-IGF-1C水凝胶对脂肪间充质干细胞体外增殖能力的影响；
本发明结合附图和具体实施方式做进一步详细说明。这些实施例用来更具体地阐述本发明，并且如所附权利要求书提出的本发明的范围不限于实施例或受实施例的限制。
具体实施方式
实施例1：IGF-1C修饰壳聚糖(CS)获得CS-IGF-1C的制备
IGF-1C多肽的固相合成
IGF-1C多肽通过成熟的固相合成(SPPS)步骤，使用2-chlorotrityl chloride树脂和侧链被tert-buty基团保护且氨基被Fmoc保护的氨基酸合成。步骤为：
1.第一个氨基酸的C端接枝在树脂上，接载率为0.6毫摩尔/克。20％的哌啶溶于N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)用于脱除氨基的Fmoc保护基团；
2.在缩合剂小时BTU和催化剂DIPEA的共同作用下，下一个氨基酸的羧基与游离的氨基结合；重复以上步骤，多肽链会不断增长；
3.叠氮化己酸的合成：6-溴己酸乙酯与叠氮化纳在DMF中反应，之后用氢氧化钠处理，得到叠氮化的己酸；
4.最后将上一步的叠氮化己酸用同样的步骤连接到多肽的氨基上；
5.用一定体积的DMF反复冲洗连有多肽的树脂(5分钟，5次)，之后再用DCM冲洗(1分钟，3次)；
6.用TFA处理干燥的树脂，将多肽从树脂上脱离，转移进入TFA溶液；
7.收集溶液旋干，得到浓缩溶液；用冰冻乙醚处理，离心，得到沉淀；
8.将沉淀溶于DMSO，使用高效液相色谱纯化得到带叠氮的多肽产物。
炔基取代的壳聚糖(alkynyl-CS)的合成
1.将CS溶解于蒸馏水中，向其中加入戊炔酸，利用1摩尔/升盐酸(HCL)和1摩尔/升氢氧化钠(NaOH)溶液调节pH值使CS完全溶解；
2.将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，按照EDC:戊炔酸＝3:1的比例)加入CS溶液中(每半个小时加1次，共3次)，期间冰浴；
3.在室温中反应24小时；
4.对产物进行透析(5毫摩尔/升HCl和1wt％NaCl，2天；3毫摩尔/升HCl，1天；1毫摩尔/升HCl，2天；去离子水，3天，4℃)；
5.冻干获得终产物。
CS-IGF-1C的合成
利用点击化学(“click”反应)合成CS-IGF-1C，步骤如下：
1.在氮气保护条件下，用去离子水(10毫升)溶解炔基取代-CS。
2.点击反应条件：IGF-1-N3:CuSO4:抗坏血酸钠的进料摩尔比为1:0.2:0.4。
3.在37℃条件下，反应24小时；
4.使用去离子水透析3天；
5.通过冻干获得CS-IGF-1C材料；
IGF-1是70个氨基酸组成的单链多肽，含A、B、C和D 4个结构域(图1)。CS-IGF-1C是通过对IGF-1C-N3的叠氮和炔基化壳聚糖的炔烃进行点击反应而合成的。首先，使用固相Fmoc-氨基酸化学法合成IGF-1的C结构域的序列(GYGSSSRRAPQT)。然后，利用缩合反应将6-叠氮基己酸连到C结构域的N-端获得IGF-1C-N3(N3-GYGSSSRRAPQT)。而后，通过CS和4-戊炔酸的缩合反应合成炔基化壳聚糖。最后，利用点击反应合成CS-IGF-1C复合物(图2)。向CS-IGF-1C溶液中加入β-GP制备成可注射的水凝胶。利用FT-IR光谱仪检测证明CS-IGF-1C复合物化学结构中具有alkynyl-CS所不具备的官能团结构。
实施例2：CS-IGF-1C水凝胶的制备及性能评价
CS-IGF-1C水凝胶的制备
(1)使用醋酸(0.1摩尔/升)溶解CS-IGF-1C(1.5％，w/v)，室温，过夜；
(2)使用蒸馏水在透析膜(截留分子量为8kDa–10kDa)中对CS溶液进行透析，1周，去除残余的醋酸；
(3)通过冻干获得CS-IGF-1C盐酸盐；
(4)将冰浴的β-GP溶液(2.29摩尔/升)滴加到CS溶液中，冰浴条件下搅拌0.5小时；
(5)混合溶液转移至37℃恒温箱中，5分钟即可见凝胶化；
(6)混合溶液中β-GP终浓度为0.023摩尔/升，经透析CS-IGF-1C/β-GP溶液的pH值为7.2。
扫描电子显微镜观察水凝胶形貌
将水凝胶冻干后，放入干燥机中干燥24小时，使用场致发射扫描电子显微镜观察CS和CS-IGF-1C水凝胶的表面形态和多孔结构(加速电压为10千伏，观察前材料表面喷金处理)。
水凝胶流变学特性测试
(1)流变测试使用AR 2000ex(TA instrument)流变仪完成，使用25毫米不锈钢平板圆盘夹具，夹具间隙400微米，温度设定为25℃。每个样品每次测试需要1毫升溶液。
(2)将CS溶液(含有0.023Mβ-GP，p小时值为7.2)和CS-IGF-1C溶液(含有0.023摩尔/升β-GP，p小时值为7.12)加入到流变仪中，在10℃-50℃的温度范围内测量样品的流变学特性。
(3)测试并记录水凝胶弹性模量(储能模量)(G’)和粘性模量(损耗模量)(G”)随温度变化的改变情况，频率为1弧度/秒。
(4)使用相位滞后(δ)来确定G’和G”相等时的成胶温度。在恒定加热速率(1℃/分钟)的情况下改变温度。
利用SEM观察冻干水凝胶的形态特征，发现两种水凝胶均具有均质互通的多孔网状结构，孔径大小为50微米-100微米，足够用于干细胞递送。比较两种生物材料随温度变化的流变学性质。随着温度从10℃增至50℃，CS-IGF-1C/β-GP和CS/β-GP均显示出储能模量(G’)的显著增加，提示从溶液状态向凝胶状态转变的相变过程。CS-IGF-1C/β-GP的成胶温度为35℃-36℃，与CS/β-GP相似，提示CS-IGF-1C/β-GP也适合于在正常体温条件下，在体内原位成胶。
实施例3：CS-IGF-1C的生物相容性
CCK-8染色
我们将材料或水凝胶涂布于96孔板(5微升/孔)，将孔板放置于温箱(37℃)孵育30分钟(而后直接使用或于4℃储存)。一方面，为了评价不同浓度CS-IGF-1C材料对于细胞活性的影响，将材料按照1％、1.5％、3％、5％和10％的梯度涂布于孔板培养ADSCs，24小时后进行CCK-8染色。另一方面，为了比较CS-IGF-1C和CS水凝胶对于细胞增殖的影响，将两种水凝胶(浓度为3％)涂布于孔板培养ADSCs，24小时后进行CCK-8染色。细胞均按照3×104/孔的浓度铺盘(4孔/组)。具体染色方法如下：
1.配制CCK-8染色液(按照CCK-8原液:完全培养基＝1:9进行稀释)；
2.吸出培养基；
3.每孔加入100微升染色液，将孔板放入温箱(37℃)孵育4小时；
4.吸出上清(100微升)并转移到新的孔板中；
5.使用酶标仪检测(吸光度)OD 450值；
细胞活死染色
如前述方法在96孔板中涂布CS或CS-IGF-1C水凝胶，将ADSCs按照3×104/孔的浓度铺盘(4孔/组)。在培养后不同时间点，进行活死染色评价细胞的活力。具体步骤为：
1.配制染色剂(按照1:1000稀释)：乙锭二聚体-1(Etidium Homodimer-1)和钙绿素-AM(calcein-AM)各取1微升加入到1毫升基本培养基或PBS中。
2.吸去培养基，轻轻加入PBS洗涤(100微升，2次)。
3.每孔加入100微升染色剂，将孔板放入温箱(37℃)孵育30分钟。
4.直接置于倒置荧光显微镜下观察，活细胞被钙绿素-AM染成绿色，死细胞被乙锭二聚体-1染成红色。拍照、计数活细胞所占比例并进行统计分析。
为了评价CS-IGF-1C材料的细胞相容性，按照浓度梯度将其涂布于孔板培养ADSCs，24小时后行CCK-8染色。发现3％浓度的材料组细胞的活性最优，且为普通培养条件下的3倍(p<0.05)。(图3)。体外培养7天、14天、21天，各组活细胞比例均>80％。这说明体外长期培养情况下，CS-IGF-1C和CS水凝胶没有细胞毒性。
实施例4：CS-IGF-1C水凝胶促进ADSCs体外增殖并增强其抗凋亡能力
体外细胞生物发光成像
1.使用P3代生长状态良好的ADSCs，胰酶消化后使用α-MEM完全培养基重悬。
2.向不同条件(未处理、CS涂布、CS-IGF-1C涂布)预处理的96孔板的每个孔中分别加入一定浓度的(3000细胞/孔)细胞悬液。
3.将细胞置于培养箱中进行培养，24小时后，弃上清，PBS洗1次。
4.向每个孔加入预先使用PBS溶液1:100稀释的Fluc的底物(D-Luciferin)20微升覆盖孔板底部。立即将孔板置入小动物活体成像系统暗箱内，曝光1秒钟。
5.数据分析：使用Living Image软件测定每孔细胞的荧光信号强度。
利用BLI技术评价水凝胶对于ADSCs增殖的影响，当ADSCs培养于CS-IGF-1C处理的孔板时，细胞增殖速度明显高于其他培养条件(p<0.05)(图4)。此外，使用实时定量RT-PCR检测增殖相关基因表达情况，结果显示相比于其他培养条件，在CS-IGF-1C涂布孔板上培养的ADSCs中IGF-1、HGF和EGF基因表达急剧上升(p<0.05)。在体外利用H2O2对在不同条件下(未涂布材料组、CS涂布组和CS-IGF-1C涂布组)培养的ADSCs诱导损伤，评价CS-IGF-1C水凝胶是否对凋亡细胞具有保护作用。使用BLI技术检测细胞存活情况使用实时定量RT-PCR评价凋亡相关基因(Bax/Bad、Caspase-9/-3和Fas/Fasl)的表达水平。结果显示，CS-IGF-1C水凝胶涂布组细胞凋亡明显减轻，且凋亡基因的表达急剧降低(p<0.05)。
实施例5：CS-IGF-1C水凝胶促进ADSCs体内存活和增殖
对8-10周龄FVB雄性小鼠诱导单侧急性肾脏缺血再灌注损伤。根据动物接受治疗类型进行分组(每组30只)：Sham组(假手术组，仅进行肾脏探查，不经受损伤和治疗)；PBS组(经受肾脏损伤+肾内注射30微升PBS)；CS组(经受肾脏损伤+肾内注射30微升CS水凝胶)；ADSCs组(经受肾脏损伤+肾内注射溶于30微升PBS的106ADSCs)；ADSCs/CS组(经受肾脏损伤+肾内注射溶于30微升CS水凝胶的106ADSCs)；ADSCs/CS-IGF-1C组(经受肾脏损伤+肾内注射溶于30微升CS-IGF-1C水凝胶的106ADSCs)。
急性肾脏损伤模型
急性肾脏损伤及细胞治疗
(1)经腹腔注射水合氯醛(4％，350毫克/千克)麻醉小鼠，于背部中部、脊柱左侧0.2厘米处纵行切开皮肤(0.8-1厘米)，分离皮下结缔组织，离断背部肌肉进入腹腔，探查并暴露左肾，可见正常肾脏呈现鲜红色；
(2)用尖镊游离肾周脂肪及筋膜，向左侧轻轻牵拉肾脏暴露肾蒂，使用微型血管夹略靠近肾脏夹闭肾蒂，约1分钟可见肾脏出现淤血呈紫黑色；
(3)肾脏缺血期间，使用浸沾温生理盐水的纱布覆盖切口并保持纱布湿润，小鼠上方暖灯照射并保持加热垫温度(37℃)恒定；
(4)缺血40分钟后移除血管夹，肉眼可见肾脏颜色即刻变为红色，使用4-0丝线逐层缝合肌层和皮肤关闭背部切口；
(5)将小鼠置于加热垫上复温，待苏醒后放回饲养笼。
重度肾脏损伤模型
(1)麻醉小鼠，并行左侧肾脏缺血再灌注损伤，方法同上；
(2)缺血损伤期间，用同样方式切开右侧背部皮肤，分离皮下组织和肌肉，探查并暴露右肾；
(3)游离肾周组织后，使用尖镊分离出右输尿管，使用6- 0丝线(靠近肾脏)双结结扎肾蒂，同时注意保护输尿管，并切除肾脏；
(4)必要时，使用棉签吸净腹腔内血性渗出物，查无明显出血逐层缝合。
在肾脏缺血再灌注后(对于重度损伤模型，在对侧肾脏切除术后)，即刻行左肾内递送细胞或水凝胶。
细胞/水凝胶/PBS递送方法
在肾脏缺血再灌注后(对于重度损伤模型，在对侧肾脏切除术后)，即刻行左肾内递送细胞或水凝胶。
(1)使用镊子将肾脏轻轻提拉到体外，用细棉条或纱布条包裹并固定肾脏；
(2)使用胰岛素注射器(300微升规格)吸取输送介质(PBS或水凝胶，30微升)负载的细胞(106ADSCs)，于肾脏上极、中部和下极三个部位轻轻刺入肾脏实质(深度约3毫米)，缓慢轻推注射器(10微升/部位)，同时观察小鼠的呼吸频率；
(3)注射完成后，缓慢拔除注射器，同时使用棉球按压进针处肾脏组织止血1分钟。
为了评价肾脏功能学变化，我们对雄性FVB小鼠(每组10只)诱导重度肾脏损伤模型，即单侧肾脏缺血再灌注损伤加对侧肾脏切除术。
小动物活体生物发光成像
1.经腹腔注射水合氯醛(4％，350毫克/千克)麻醉小鼠；
2.向小鼠经腹腔注射萤火虫荧光素酶底物D-Luciferin(150毫克/千克)；
3.底物注射5分钟后，将小鼠放入小动物活体成像系统暗箱内，摆放好体位(俯卧位)，将其头部对准暗箱内出气孔；
4.根据荧光信号强度调整曝光时间，一般为0.5-2分钟，连续采集图像直到信号强度开始下降；
5.数据分析：使用Living Image软件测定每只小鼠的荧光信号强度，进行统计学分析。
肾脏冰冻切片免疫染色
1.将切片从-20℃冰箱中取出，室温放置30分钟；
2.将切片放入(-20℃预冷30分钟的)丙酮原液中固定10分钟；
3.将切片置于空气中干燥30分钟；
4.使用PBS洗涤切片(5分钟，2次)；
5.破膜：0.1％Triton X-100，室温，10分钟；PBS洗涤，5分钟，2次；
6.血清封闭，4℃，45分钟；
7.加一抗，4℃，过夜；
8.次晨复温，1小时；PBS洗涤，5分钟，4次；
9.加二抗(避光)，室温，2小时；PBS洗涤，5分钟，5次；
10.DAPI封片，荧光显微镜下观察，拍照。
为了评价CS-IGF-1C促进细胞存活的作用，在损伤后不同时间点，利用BLI技术纵向追踪注射到受损肾脏中ADSCsFluc-GFP的存活情况。结果显示，在全部时间点，ADSCs/CS-IGF-1C组的信号显著高于ADSCs/CS组(p<0.05)这说明与未修饰的CS水凝胶相比，CS-IGF-1C水凝胶更有利于改善局部递送的细胞存活。此外，免疫染色的结果也证实了CS-IGF-1C水凝胶对移植细胞的保护作用。同时，免疫染色发现CS-IGF-1C水凝胶能够促进ADSCs的增殖。
实施例6：CS-IGF-1C水凝胶增强ADSCs促血管新生作用
VEGF-R2转基因小鼠评价血管新生
为了评价水凝胶能否增强细胞在体内促进血管新生作用，我们对VEGF-R2转基因小鼠诱导急性缺血再灌注损伤并进行细胞治疗(方法如前所述)。分组(每组6只)：S小时am组(假手术组，仅进行肾脏探查，不经受损伤和治疗)；PBS组(经受肾脏损伤+肾内注射30微升PBS)；CS组(经受肾脏损伤+肾内注射30微升CS水凝胶)；ADSCs组(经受肾脏损伤+肾内注射溶于30微升PBS的106ADSCs)；ADSCs/CS组 (经受肾脏损伤+肾内注射溶于30微升CS水凝胶的106ADSCs)；ADSCs/CS-IGF-1C组(经受肾脏损伤+肾内注射溶于30微升CS-IGF-1C水凝胶的106ADSCs)。移植的细胞为：从同品系野生型C57BL/6J分离培养的ADSCs。在损伤后不同时间点，使用BLI技术(方法如前所述)评价VEGF-R2基因的表达。
免疫染色方法见实施例5
为了阐明CS-IGF-1C水凝胶增强ADSCs促血管新生效应的机制，对表达VEGF-R2-Fluc转基因小鼠诱导肾脏缺血损伤模型，接受同品系小鼠来源的ADSCs的移植治疗(并根据治疗方式进行分组)。损伤后不同时间点，使用BLI技术实时监测血管生成，比较各种治疗方式促进VEGF-R2基因表达的情况。结果显示，接受ADSCs/CS-IGF-1C共同移植的小鼠肾脏VEGF-R2的表达显著高于接受其他治疗的动物(p<0.05)。细胞移植后3天，利用CD31染色评价肾脏血管新生情况，发现ADSCs/CS-IGF-1C组毛细血管数量显著高于其他组(p<0.05)。此外，评价体外培养不同条件下，ADSCs中血管新生相关基因表达情况，发现CS-IGF-1C水凝胶处理能显著上调基因的表达(p<0.05)。
实施例7：CS-IGF-1C和ADSCs共同移植增强肾脏细胞增殖并减少凋亡
免疫染色方法见实施例5
在损伤后3天，使用PCNA和TUNEL染色评价细胞联合水凝胶治疗对肾小管上皮细胞增殖和凋亡的影响。结果显示，ADSCs/CS-IGF-1C共同移植能最大程度地增加肾脏小管上皮增殖细胞的数量并减少细胞凋亡(p<0.05)。
实施例8：CS-IGF-1C和ADSCs共同移植加速肾脏组织和功能学修复
过碘酸希夫(PAS)染色
1.脱蜡：二甲苯I、II，各10分钟；风干，10分钟；
2.至水：99％乙醇I、II，各5分钟；95％、90％、80％乙醇，各5分钟；
3.清水洗涤，5分钟；
4.滴加高碘酸，氧化10分钟。清水洗涤，5分钟；
5.滴加Schiff液(1分钟)，目测变红即终止；清水洗，2-3分钟；
6.Harris苏木素染核，2-3分钟；清水洗，5分钟；
7.盐酸-乙醇分化1秒；清水洗，5分钟；
8.脱水：70％、80％、90％、95％乙醇3秒，99％乙醇5分钟，2次；风干5分钟；
9.透明：二甲苯I、II，各5分钟；风干，5钟；
10.中性树胶封片后显微镜下观察，染色阳性物质呈紫红色，细胞核为蓝色。
肾脏功能学检测
在肾脏重度损伤(单侧40分钟缺血再灌注损伤+对侧肾脏切除)后，于不同时间点(2、4、7、10、14和28天)采集小鼠外周血行肾功能检测(每组10只)。外周血的采集主要使用球后静脉丛采血法，具体步骤如下：
1.使用水合氯醛(4％，350毫克/千克)经腹腔注射麻醉小鼠；
2.左手拇指、食指压迫小鼠一侧眼眶后侧皮肤暴露眼球；
3.右手持肝素化毛细吸管从眼眶侧后方轻轻刺入，深度约4毫米，待吸管触碰到眼眶骨质结构，转动毛细吸管并前后游走轻刺骨壁，血液自毛细吸管流出；
4.使用EP管在毛细吸管另一端收集血液(约200微升)。
将收集的血液标本置于37℃温箱中1小时，离心(1200转/分钟，5分钟)，收集血清标本送检(或于-20℃保存)。使用生化自动分析仪检测血清中BUN和血肌酐水平，以毫克/立方分米作为血清学指标的表示单位。
对损伤后3天的肾脏组织切片进行高碘酸-希夫(PAS)染色，并对肾小管的组织学表现进行半定量评分。结果显示，ADSCs/CS-IGF- 1C共同移植能最大程度缓解管型形成、小管坏死和扩张、刷状缘缺失等损伤表现。此外，对小鼠施加严重的AKI(左侧40分钟I/R损伤，同时行右侧肾脏切除术)。在损伤后不同时间点，检测血清尿素氮(BUN)和肌酐的水平。结果显示，ADSCs/CS-IGF-1C共同移植能显著加快肾脏功能学恢复。
实施例9：CS-IGF-1C水凝胶与ADSCs共同移植治疗心肌梗死
冠状动脉左前降支永久结扎建立及细胞-水凝胶移植：
(1)小鼠麻醉：用5％的异氟烷气体预麻小鼠，用医用胶带固定小鼠的四肢和头部于手术板上，剪开颈部气管，气管插管后接通麻醉呼吸机正压通气，调节异氟烷的含量约为1％-1.5％，呼吸频率为120/分钟；
(2)胸部备皮，用医用酒精和碘伏进行消毒；
(3)行胸廓切开术，于第四肋间处开胸并暴露心脏，仔细撕开心包膜暴露小鼠左心室前壁；
(4)左冠状动脉起始端的下方距离左心耳约1毫米处，用7-0的缝合线结扎冠状动脉左前降支(以结扎点下方心肌的颜色变浅发白或出现紫黑色且心电图(electrocardioram，ECG)检测显示心肌电ST段抬高为结扎成功的标志；
(5)结扎成功后于结扎位点左下、右下各1毫米处分别注射10微升生理盐水、细胞生理盐水悬液、水凝胶或凝胶-ADSCs复合物；
(6)关胸，缝合肌肉和皮肤，伤口用碘伏再次消毒，妥善饲养。
(7)假手术(sham)对照组：开胸，穿线不接扎不移植任何细胞或溶液，后关胸缝合肌肉。
此外，利用免疫染色、心脏超声等手段评价心肌再生情况。
使用CS-IGF-1C水凝胶负载ADSCs局部注射受损心肌组织，结果显示，CS-IGF-1C保护ADSCs的存活，增强其促进心肌细胞增殖、抗凋亡、以及刺激血管新生能力，改善心肌肥大并促进心脏功能和结构的恢 复，并减少心肌组织纤维化的发生。
实施例10：CS-IGF-1C水凝胶与ADSCs共同移植治疗皮肤损伤
真皮层全层皮肤损伤模型的建立及细胞-水凝胶移植：
(1)裸鼠腹腔内注射4％水合氯醛进行全身麻醉。
(2)麻醉效果满意后，75％酒精消毒裸鼠背部皮肤3遍。
(3)用眼科剪剪除全层裸鼠皮肤及肉膜，暴露肌肉层，制备出面积为l.0立方厘米的皮肤缺损区域。
(4)IV3000无菌不透水伤口敷料覆盖创面，贴膜边缘用伤口粘合剂點附于裸鼠背部皮肤。
(5)术后裸鼠单笼饲养，自第3天起每隔2天更换创面敷料。
(6)水凝胶-ADSCs以1×106/毫升的密度接种于水凝胶中，各个实验组每只裸鼠注射200微升生理盐水(不治疗组)、细胞生理盐水悬液(单纯细胞组)、水凝胶-ADSCs(对照水凝胶与细胞组)、水凝胶。
(7)术后大体观测及愈合曲线测定，每天观察并记录各组裸鼠的精神状态、进食饮水情况、活动力、大小便情况。
(8)术后每隔2天麻醉后首先行活体成像检测，然后去除伤口敷料、仔细清除创面渗出物、痂皮，观察创面有无感染、创面愈合情况，并进行创面拍照同时以透明薄膜描印创面。
(9)拍照后，创面重新用IV3000无菌不透水伤口敷料贴膜覆盖，贴膜边缘用伤口粘合剂點附于裸鼠背部皮肤。使用Image J软件分析各组术后第3、6、9、l2天残留创面面积，并绘制愈合曲线。
此外，利用免疫染色评价皮肤组织再生情况。
建立小鼠皮肤缺损模型，使用CS-IGF-1C水凝胶负载骨髓来源间充质干细胞(BMSCs)局部注射到皮肤缺损部位，CS-IGF-1C增强BMSCs的存活和增殖，并有利于BMSCs促进局部皮肤组织的修复，加快血管新生，并减少组织纤维化的发生。