《转录因子YY1在制备治疗糖尿病靶向药物中的用途.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《转录因子YY1在制备治疗糖尿病靶向药物中的用途.pdf（18页完整版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811473083.0 (22)申请日 2018.12.04 (71)申请人 上海交通大学医学院附属瑞金医院 地址 200025 上海市黄浦区瑞金二路197号 申请人 上海市内分泌代谢病研究所 (72)发明人 宁光 曹亚南 姜秀丽 山爱景 宋大龙 杨齐 (74)专利代理机构 上海伯瑞杰知识产权代理有 限公司 31227 代理人 曹莉 (51)Int.Cl. A61K 38/17(2006.01) A61P 3/10(2006.01) (54)发明名称 转录因子YY1在制备治。
2、疗糖尿病靶向药物中 的用途 (57)摘要 本发明公开了转录因子YY1在制备治疗糖尿 病靶向药物中的用途， 还进一步公开了转录因子 YY1在制备调控胰岛细胞发育的药物中的用 途； 通过转录因子YY1调控胰岛细胞的发育， 用 于制备治疗糖尿病靶向药物； 通过调控核编码的 线粒体基因细胞色素C氧化酶亚单位5、 异柠檬 酸脱氢酶亚单位和细胞色素C的表达实现调控 胰岛细胞的发育， 进而影响胰岛细胞分泌胰 岛素， 为治疗糖尿病特别是2型糖尿病提供了新 途径。 权利要求书1页 说明书6页 附图10页 CN 109289039 A 2019.02.01 CN 109289039 A 1.转录因子YY1在制备治。
3、疗糖尿病靶向药物中的用途。 2.如权利要求1所述的用途， 其特征在于， 转录因子YY1通过调控胰岛 细胞的发育实 现。 3.转录因子YY1在制备调控胰岛 细胞发育的药物中的用途。 4.如权利要求3所述的用途， 其特征在于， 转录因子YY1通过调控核编码的线粒体基因 表达实现。 5.如权利要求4所述的用途， 其特征在于， 所述核编码的线粒体基因为细胞色素C氧化 酶亚单位5 、 异柠檬酸脱氢酶亚单位 和细胞色素C。 6.如权利要求3所述的用途， 其特征在于， 所述药物以转录因子YY1为活性成分， 还包括 药学上可接受的辅料或辅助性成分。 7.如权利要求6所述的用途， 其特征在于， 所述药物中转录因。
4、子YY1的质量百分比含量 为98， 其应用剂量为15000mg/kg。 8.如权利要求3或7所述的用途， 其特征在于， 所述药物剂型为片剂、 粉剂、 颗粒剂、 针 剂、 胶囊、 口服液或缓释剂。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 109289039 A 2 转录因子YY1在制备治疗糖尿病靶向药物中的用途 技术领域 0001 本发明涉及基因的功能与应用技术领域， 具体涉及一种转录因子YY1在制备治疗 糖尿病靶向药物中的用途， 进一步涉及转录因子YY1在制备调控胰岛 细胞发育的药物中的 用途。 背景技术 0002 近年来， 随着社会经济的发展和人民生活水平的提高， 糖尿病的患病率也在逐年 。
5、上升， 其中2型糖尿病(T2DM)占到了95以上。 2型糖尿病已成为一种严重影响人类健康的 全球性公共卫生问题。 中国人群研究数据表明， 中国成人糖尿病患病率已达11.6， 糖尿病 前期患病率更是高达50.1， 2型糖尿病是一种复杂疾病， 其确切发病机制仍不清楚， 目前 研究表明2型糖尿病的发生是遗传、 环境等多因素造成的结果。 0003 胰岛 细胞分泌的胰岛素是全身唯一可以降血糖的激素， 维持 细胞正常的数量和 功能是保持机体血糖稳定的必要条件。 2型糖尿病发生发展最关键的环节就是胰岛 细胞功 能障碍， 不能分泌满足机体需要的胰岛素。 因此胰岛 细胞成为了寻找糖尿病发病机制及治 疗靶点的关键。
6、。 0004 胰腺中转录因子在调控胰岛 细胞发育和功能方面发挥着重要作用。 近年来， Pdx- 1， Ngn3， Pax4， Nkx2.2， Nkx6.1， MafA和NueroD等一些对 细胞起决定性作用的转录因子相继 被发现。 2013年， 上海瑞金医院曹亚南等通过对散发的胰岛素瘤全外显子组学测序， 发现转 录因子YY1出现高频体细胞T372R基因突变， T372R基因突变改变了YY1靶基因的表达， 这项 研究提示了转录因子YY1在胰岛 细胞可能发挥着重要作用。 0005 YY1是锌指类转录因子GLI-Krppel家族成员， 也是多梳蛋白家族(PcG)中的一员。 不同种属间YY1基因高度同。
7、源， YY1的DNA结合结构域可以形成锌指结构模体， 识别特定的 DNA序列。 YY1是一种多功能蛋白， 通过与不同的蛋白辅助因子相互作用而调控靶基因的表 达， 参与调控细胞发育、 分化、 复制和增殖等正常的生理过程。 YY1具有抑制转录和激活转录 的双重功能， 正因为此， YY1被称为阴阳因子。 0006 目前已有大量有关YY1在淋巴瘤、 白血病、 前列腺癌、 乳腺癌、 宫颈癌、 结肠癌等肿 瘤组织中表达及调控机制的研究， 结果表明YY1在绝大多数肿瘤中异常高表达， 并且与其肿 瘤的形成、 进展及预后有关。 在肝脏、 肌肉、 脂肪等代谢器官， YY1已被证实参与调控线粒体 功能和胰岛素/胰岛。
8、素样生长因子信号通路， 这些对于胰岛 细胞的生存和胰岛素的分泌同 样具有重要意义。 然而到目前为止， 还没有转录因子YY1在胰岛 细胞中的作用相关的研究。 发明内容 0007 本发明的目的在于提供一种转录因子YY1用于制备调控胰岛 细胞发育的药物。 0008 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的： 0009 第一方面， 转录因子YY1在制备治疗糖尿病靶向药物中的用途。 0010 优选的， 转录因子YY1通过调控胰岛 细胞的发育实现。 说 明 书 1/6 页 3 CN 109289039 A 3 0011 第二方面， 转录因子YY1在制备调控胰岛 细胞发育的药物中的用途。 0012 优选的， 。
9、转录因子YY1通过调控核编码的线粒体基因表达实现。 0013 更优选的， 所述核编码的线粒体基因为细胞色素C氧化酶亚单位5 、 异柠檬酸脱氢 酶亚单位 和细胞色素C。 0014 优选的， 所述药物中， 以转录因子YY1为活性成分， 还包括药学上可接受的辅料或 辅助性成分； 更优选的， 所述转录因子YY1的质量百分比含量为98， 其应用剂量为1 5000mg/kg。 0015 优选的， 所述药物剂型为片剂、 粉剂、 颗粒剂、 针剂、 胶囊、 口服液或缓释剂。 0016 与现有技术相比， 本发明的有益效果在于： 0017 本发明发现， 转录因子YY1通过调控胰岛 细胞的发育， 可以用于制备治疗糖尿。
10、病 靶向药物； 通过调控核编码的线粒体基因细胞色素C氧化酶亚单位5 、 异柠檬酸脱氢酶亚单 位 和细胞色素C的表达实现调控胰岛 细胞的发育， 进而影响胰岛 细胞分泌胰岛素， 为治 疗糖尿病特别是2型糖尿病提供了新途径。 附图说明 0018 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述， 本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显： 0019 图1是YY1 KO转基因小鼠的构建模式及鉴定示意图； 其中， (A)YY1flox小鼠和Mip- cre小鼠(或Rip-cre小鼠)的构建模式及交配策略模式图； (B)转基因小鼠的基因型鉴定， M 代表DNA marker(DL2000， Taka。
11、ra)， 编号为1-7的小鼠， 1代表YY1flox/flox小鼠， 2代表 YY1-/-小鼠， 3代表YY1flox/-小鼠， 4代表Mip-Cre-小鼠， 5代表Mip-Cre+小鼠， 6代表Rip- Cre+小鼠， 7代表Rip-Cre-小鼠； (C)Mip-YY1 KO小鼠胰岛YY1的mRNA表达水平(n3)； (D) Rip-YY1 KO小鼠胰岛YY1的mRNA表达水平(n3)； (E)Mip-YY1 KO小鼠胰岛YY1的蛋白表达 水平(n2)， 与对照组相比p8000 个/小鼠(n3)； (F)6周龄Rip-YY1 KO小鼠和对照小鼠胰腺组织切片免疫荧光染色， 绿色表 示胰岛素， 。
12、红色表示胰高血糖素， 蓝色表示Dapi； (G)统计F图中胰高血糖素阳性细胞与胰岛 素阳性的细胞的比例， 胰岛素阳性细胞3000个/小鼠(n3)； (H)统计16周龄Mip-YY1 KO 小鼠和对照小鼠胰腺组织切片免疫荧光染色中胰高血糖素阳性细胞与胰岛素阳性的细胞 的比例， 胰岛素阳性细胞3000个/小鼠(n3)； (I)6周龄Rip-YY1 KO小鼠和对照小鼠的胰 岛 细胞质量(n3)； (J)16周龄Mip-YY1 KO小鼠和对照小鼠的胰岛 细胞质量(n4)； (K) 统计16周龄Mip-YY1 KO小鼠和对照小鼠每张胰腺组织切片上胰岛个数(n4)； 0026 图8是胰岛 细胞中敲除YY1。
13、可抑制胰岛素的转录示意图； 其中， (A)Rip-YY1 KO小 鼠， (B)Mip-YY1 KO小鼠和相应对照小鼠的胰岛中Ins1、 Ins2的mRNA表达水平(n4)； 0027 图9是胰岛 细胞中敲除YY1可减少细胞ATP含量示意图； 其中， (A)Mip-YY1 KO小鼠 和对照小鼠的胰岛中ATP含量(n4)； (B)将YY1的siRNA(si-YY1)或者对照(si-NC)转染进 入MIN6细胞中， 48小时后检测ATP的含量(n3)； 0028 图10是胰岛 细胞中敲除YY1可使细胞线粒体发生功能障碍示意图； 其中， (A)流式 细胞仪检测Mip-YY1 KO小鼠和对照小鼠的胰岛原。
14、代细胞中TMRE阳性细胞(n3)； (B) Seahorse检测Mip-YY1 KO小鼠和对照小鼠的胰岛原代细胞氧化呼吸能力曲线(n5:7)； (C)Seahorse检测Mip-YY1 KO小鼠和对照小鼠的胰岛原代细胞在高糖低糖情况下平均耗氧 量(n5:7)； 0029 图11是YY1调控核编码的线粒体基因转录示意图； 其中， (A)ChIP分析将YY1的 siRNA(si-YY1)或者对照(si-NC)转染进入MIN6细胞中， 48小时后转录水平检测Cox5a、 IDH3a和CytC启动子结合(n3)； (B)凝胶电泳检测YY1蛋白结合的DNA(n3)； (C)将YY1的 过表达质粒或者对照。
15、质粒转染进入MIN6细胞中， 48小时后检测细胞色素C的荧光素酶报告 基因活性(n3)； (D)将YY1的siRNA(si-YY1)或者对照(si-NC)转染进入MIN6细胞中， 48小 说 明 书 3/6 页 5 CN 109289039 A 5 时后检测细胞色素C的荧光素酶报告基因活性(n3)； (E)胰岛线粒体蛋白免疫印迹(n 3)。 具体实施方式 0030 下面结合实施例对本发明进行详细说明。 以下实施例将有助于本领域的技术人员 进一步理解本发明， 但不以任何形式限制本发明。 应当指出的是， 对本领域的普通技术人员 来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干调整和改进。 这些。
16、都属于本发明的保 护范围。 0031 实施例1： 胰岛 细胞特异性敲除转录因子YY1小鼠实验 0032 实验动物和原料说明： 0033 SPF级YY1flox小鼠采购于美国Jackson Lab， 品系编号为Jax No.014649， 由南京 模式动物研究所保种。 0034 SPF级Mip-Cre小鼠由上海交通大学医学院附属瑞金医院曹亚南博士构建。 0035 SPF级Rip-Cre小鼠由法国UniversitClaudeBernardLyon张昌贤教授赠予。 0036 SPF级C57BL/6J雌性及雄性小鼠， 普通小鼠饲料采购于上海斯莱克实验动物有限 责任公司； 60kcalFat高脂饲料(。
17、D12492)采购于美国Research Diets公司。 0037 胰岛 细胞特异性敲除转录因子YY1小鼠参见附图1， 基因靶向的组织特异性敲除 (图1-A)， 将Rip-cre和Mip-cre小鼠分别与YY1flox小鼠进行交配， 两代后得到基因型为 YY1lox/lox Cre+小鼠， 即为YY1 KO小鼠， 选取同窝的基因型为YY1lox/lox Cre-的小鼠为对照小 鼠， 基因型鉴定结果如图1-B所示； 分离小鼠胰岛， 分别提取胰岛RNA和蛋白， 在转录和翻译 水平鉴定YY1的敲除效率。 可以看出Mip-YY1 KO小鼠敲除效率在40左右(图1-C)， 而Rip- YY1 KO小鼠。
18、敲除效率达到70左右(图1-D)， YY1的蛋白水平表达也明显下调(图1-E)， 两组 转基因小鼠均构建成功。 0038 胰岛 细胞特异性敲除转录因子YY1小鼠糖代谢表型参见附图2和3， Mip-YY1 KO小 鼠和Rip-YY1 KO小鼠均出现了不同程度的高血糖(图2-A， B， C， D)和葡萄糖耐量受损(图3- E， F， G， H， I， J)。 其中， Rip-YY1 KO小鼠由于血糖过高， 小鼠生存率明显受到影响(图3-M)。 机 体出现高血糖和葡萄糖耐量受损的现象， 一方面可能是胰岛 细胞质量的缺失或分泌功能 受损， 导致血清中胰岛素水平不足引起， 另一方面可能是由于外周胰岛素作。
19、用的靶器官发 生了胰岛素抵抗， 或者由两方面的原因共同作用导致。 Mip-YY1 KO小鼠胰岛素耐量试验 (ITT)表明， 与对照小鼠相比， Mip-YY1 KO小鼠胰岛素敏感性并没有出现明显改变(图3-K和 L)， 说明Mip-YY1 KO小鼠出现高血糖和葡萄糖耐量受损的表型不是由外周胰岛素抵抗引 起， 而很可能是胰岛形态或者功能缺陷导致胰岛素分泌不足引起。 0039 高脂饮食喂养的胰岛 细胞特异性敲除YY1小鼠糖代谢表型参见图4， 在给予HFD喂 养第16周时， Mip-YY1 KO小鼠的葡萄糖耐量受损现象明显(图4-A， 图4-B)； 胰岛素耐量试验 的结果表明在高脂饮食喂养16周时的M。
20、ip-YY1 KO小鼠与对照小鼠相比其外周胰岛素敏感 性并没有显著的差异(图4-C， 图4-D)， 结果表明在HFD喂养下Mip-YY1 KO小鼠的糖耐量受损 依然存在， 其主要原因并不是外周胰岛素抵抗。 0040 胰岛 细胞特异性敲除转录因子YY1小鼠葡萄糖刺激的胰岛素分泌降低参见附图 5， 葡萄糖刺激的胰岛素分泌试验(IRT)发现YY1 KO小鼠在葡萄糖刺激之后的15分钟和30分 说 明 书 4/6 页 6 CN 109289039 A 6 钟， 血清中胰岛素水平均显著低于对照组， 其中Rip-YY1 KO小鼠几乎没有胰岛素分泌高峰 出现(图5-A， B， C， D)； 将小鼠胰岛分离出来。
21、， 在体外原代胰岛水平上进行了葡萄糖刺激的胰 岛素分泌实验(GSIS)来评估YY1 KO小鼠 细胞的胰岛素分泌功能， 结果表明在用胰岛的胰 岛素含量校正后， 在低糖(2.8mM)和高糖(16.7mM)条件下， YY1 KO小鼠胰岛分泌的胰岛素水 平明显低于对照组(图5-E和F)。 0041 胰岛 细胞特异性敲除转录因子YY1小鼠胰岛素含量降低参见附图6， 16周龄Mip- YY1 KO小鼠原代胰岛中胰岛素含量明显比对照组降低(图6-C)， Mip-YY1 KO小鼠胰腺的胰 岛素含量也比对照组有所降低(图6-B)。 小鼠胰腺组织切片免疫组织化学染色结果显示， YY1 KO小鼠胰腺切片中的胰岛素着。
22、色明显变浅(图6-A)； 取胰岛组织进行透射电镜观察， 将 胰岛素囊泡按照囊泡形态进行分类统计， 发现与对照组相比Mip-YY1 KO小鼠 细胞中空泡 状胰岛素囊泡占总囊泡数目的百分比显著增加， 成熟胰岛素囊泡的比例有所下降(图6-E)； 说明胰岛 细胞中特异性敲除转录因子YY1可以显著降低胰岛 细胞中胰岛素含量， 胰岛素 囊泡成熟过程受到影响。 0042 YY1 KO小鼠胰岛形态学分析参见附图7， 与对照小鼠相比， 16周龄的Mip-YY1 KO小 鼠胰腺切片中Ki67阳性细胞所占胰岛素阳性细胞的百分比稍有降低(图7-A和B)。 凋亡早 期， 细胞膜表面会发生一系列变化。 磷脂酰丝氨酸(PS。
23、)可从细胞膜内暴露于胞膜外， 而 Annexin V对PS具有高度的亲和性， FITC标记的AnnexinV可作为探测暴露在细胞膜表面PS 的敏感探针。 凋亡后期， 细胞膜发生损伤， DNA可被PI着染产生红色荧光， 正常细胞和处于凋 亡早期的细胞不会着染PI而产生红色荧光信号； 流式细胞仪分析生成的双变量流式分析散 点图上(图7-C)做十字门， 左下象限显示FITC-/PI-的活细胞； 右上象限为FITC+/PI+的非活 细胞， 即坏死细胞； 而右下象限为FITC+/PI-的凋亡细胞。 图7-D显示， 16周龄的Mip-YY1 KO 小鼠胰岛处于凋亡早期的细胞比例相对高于对照组。 0043 。
24、胰腺切片免疫荧光染色TUNEL实验检测 细胞凋亡， 表明16周龄的Mip-YY1 KO小鼠 胰岛素阳性细胞中TUNEL阳性细胞所占的千分比显著高于对照组(图7-E)； 对胰腺切片进行 了胰岛素(Insulin)和胰高血糖素(Glucagon)染色(图7-F)， 发现Mip-YY1 KO小鼠胰岛中 Glucagon阳性细胞与Insulin阳性细胞的比例有所上升(图7-H)， 在Rip-YY1 KO小鼠胰岛 中， 这一比例与对照组相比具有显著性差异(7-G)。 另外， 对两组小鼠的胰岛 细胞质量进行 了统计， 发现在16周龄的Mip-YY1 KO小鼠胰岛 细胞质量比对照组下降了一半(图7-I)， 。
25、而6 周龄的Rip-YY1 KO小鼠胰岛的 细胞质量与对照组相比下降了约三分之二(图7-J)， 两组间 有明显的差异。 以上实验结果表明， 在胰岛 细胞中特异性敲除YY1， 细胞凋亡增加， 细胞比 例减少， 引起了胰岛 细胞的质量减少， 且胰腺 细胞质量与胰腺胰岛素含量密切相关， 胰腺 胰岛素含量的降低可能是由于胰腺 细胞质量减少所致。 0044 实施例2： 转录因子YY1通过影响线粒体能量代谢调控胰岛 细胞的验证 0045 参见附图8， 在Rip-YY1 KO和Mip-YY1 KO小鼠胰岛中， 胰岛素基因的两个转录本 Ins1和Ins2的mRNA水平相比于对照组都有明显降低(图8-A和B)。。
26、 0046 胰岛 细胞特异性敲除YY1降低胰岛的ATP含量参见附图9， 16周龄的Mip-YY1 KO小 鼠胰岛中ATP的含量与对照组相比， 其胰岛中ATP的含量大幅降低， 说明在YY1敲除后， 胰岛 细胞ATP含量下降， 细胞处于 “饥饿” 状态， 这可能是导致 细胞胰岛素分泌减少的原因， 在 MIN6细胞特异性干扰掉YY1基因48h后， si-YY1组的ATP水平相比si-NC组显著降低。 说 明 书 5/6 页 7 CN 109289039 A 7 0047 胰岛 细胞特异性敲除YY1降低胰岛线粒体参见附图10： 分离小鼠胰岛， 恒温箱孵 育后打散获取原代细胞， 分别使用2.8mM和16。
27、.7mM的葡萄糖刺激胰岛原代细胞， 同时进行 TMRE染色， 30分钟后使用流式细胞仪检测单个细胞的TMRE着色强度和计数。 TMRE是一种带 有正电荷的橙红色荧光的染料， 选择性的定位于活细胞的线粒体内膜， 可用于线粒体膜电 位差的检测。 线粒体活性越强， 质子泵功能就越强， 膜两侧电势差就越明显， TMRE着色就越 明显。 结果显示， 在16.7mM葡萄糖刺激下， 对照组小鼠胰岛中TMRE的荧光强度细胞峰有较为 明显的右移， 说明在高糖刺激后， 胰岛 细胞中的线粒体活性增加， 而在Mip-YY1 KO组小鼠 胰岛中， 并未观察到TMRE阳性细胞峰右移的现象(图10-A)。 0048 利用S。
28、eahorse XF24线粒体氧化呼吸功能分析系统， 检测16周龄Mip-YY1 KO组小 鼠和对照组小鼠胰岛的线粒体耗氧率。 将XF24测试板水化、 平衡后， 分别测试两组小鼠胰岛 在3mM葡萄糖(基础条件)、 20mM葡萄糖(高糖刺激)以及先后加入寡霉素(oligomycin)、 FCCP、 抗霉素A(antimycin A)和鱼藤酮(Rotenone)时的细胞耗氧率(OCR)(图10-B)。 寡霉素 是ATP合成酶抑制剂， 加入此药后OCR下降， 减少的耗氧量代表着机体用于合成ATP的耗氧 量， 间接地显示了细胞的ATP产量。 解偶联剂FCCP， 作为质子载体可以使质子发生回流， 大量 。
29、耗氧， 此时OCR上升， 但是这些质子回流后不能产生ATP， 而是与氧气结合生成水， 加入FCCP 后耗氧的增加， 代表线粒体的最大耗氧能力， 间接显示出最大呼吸能力。 最后加入是抗霉素 A和鱼藤酮， 此二者是呼吸链抑制剂， 可完全阻止线粒体耗氧， 结果表明， 与对照组小鼠胰岛 相比， Mip-YY1 KO组小鼠胰岛的基础耗氧量， 高糖刺激后耗氧量(图,10-C)， ATP产生能力及 最大呼吸能力均有所降低， 这进一步说明了胰岛 细胞特异性敲除YY1后细胞中线粒体功能 减弱。 0049 转录因子YY1调控核编码的线粒体基因表达参见附图11， 在MIN6细胞特异性干扰 掉YY1基因48h后， s。
30、i-YY1组与si-NC组相比结合的Cox5a、 IDH3a和CytC启动子区基因明显减 少(图11A， B)。 细胞色素C参与线粒体的电子传递， 发现细胞色素C的转录水平明显受YY1的 调控， 当在MIN6细胞特异性过表达YY1时， 细胞色素C的转录活性明显增强(图11-C)， 而在 MIN6细胞特异性干扰掉YY1基因后， 细胞色素C的转录活性明显降低(图11-D)。 分离小鼠胰 岛进行免疫印迹实验如图11-E所示， 在Mip-YY1 KO组小鼠胰岛中线粒体呼吸链复合体代表 性蛋白表达水平降低。 0050 以上所述为本发明的较佳实施例而已， 但本发明不应该局限于该实施例所公开的 内容。 所以。
31、凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改， 都落入本发明保护的范 围。 说 明 书 6/6 页 8 CN 109289039 A 8 图1 说 明 书 附 图 1/10 页 9 CN 109289039 A 9 图2 说 明 书 附 图 2/10 页 10 CN 109289039 A 10 图3 说 明 书 附 图 3/10 页 11 CN 109289039 A 11 图4 说 明 书 附 图 4/10 页 12 CN 109289039 A 12 图5 说 明 书 附 图 5/10 页 13 CN 109289039 A 13 图6 说 明 书 附 图 6/10 页 14 CN 109289039 A 14 图7 说 明 书 附 图 7/10 页 15 CN 109289039 A 15 图8 图9 说 明 书 附 图 8/10 页 16 CN 109289039 A 16 图10 说 明 书 附 图 9/10 页 17 CN 109289039 A 17 图11 说 明 书 附 图 10/10 页 18 CN 109289039 A 18 。