类病毒基因药物共传递纳米载体及其制备方法和应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710547692.5 (22)申请日 2017.07.06 (71)申请人 天津大学 地址 300072 天津市南开区卫津路92号 (72)发明人 贾慧珍 孙雪檀 刘文广 王玮 (74)专利代理机构 天津创智天诚知识产权代理 事务所(普通合伙) 12214 代理人 王秀奎 (51)Int.Cl. A61K 48/00(2006.01) A61K 31/704(2006.01) A61K 9/14(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 。

2、类病毒基因药物共传递纳米载体及其制 备方法和应用 (57)摘要 本发明公开类病毒基因药物共传递纳米 载体及其制备方法和应用， 采用聚阳离子聚乙烯 亚胺与DNA复合形成纳米复合物， 通过静电作用 力将DOX纳米粒子修饰在PEI/DNA复合物的表面， 构建一种具有病毒粗糙表面的纳米载体。 在治疗 癌症时， 单一疗法存在许多不可避免的缺陷， 该 纳米载体可以同时装载化疗药物和治疗基因， 最 终实现药物和基因的联合治疗。 本发明可用于抗 肿瘤制剂的制备， 且其具有生物毒性低、 转染效 率高、 治疗能力强和操作简便等优点。 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 109200294 A 2019.0。

3、1.15 CN 109200294 A 1.类病毒基因药物共传递纳米载体， 其特征在于， 将药物自组装为药物纳米粒子， 通 过静电作用力将基因与阳离子聚合物复合形成纳米复合物， 再利用静电作用力将药物纳米 粒子复合在纳米复合物表面， 形成同时装载有基因和药物的具有类病毒粗糙表面的纳米载 体。 2.根据权利要求1所述的类病毒基因药物共传递纳米载体， 其特征在于， 药物为阿霉 素； 基因为鱼精DNA， 或者p53基因； 阳离子聚合物为PEI， Mw1800。 3.根据权利要求1所述的类病毒基因药物共传递纳米载体， 其特征在于， 类病毒基 因药物共传递纳米载体的大小为140150nm， 整体呈现负电。

4、势。 4.类病毒基因药物共传递纳米载体的制备方法， 其特征在于， 按照下述步骤进行： 步骤1， 将药物自组装为药物纳米粒子； 步骤2， 通过静电作用力将基因与阳离子聚合物复合形成纳米复合物， 基因和阳离子聚 合物体系中的氮磷比为2030； 步骤3， 利用静电作用力将药物纳米粒子复合在纳米复合物表面， 先分别测定药物纳米 粒子与纳米复合物的电势， 再根据两者电势进行不同比例的匹配和混合， 得到电中性粒子。 5.根据权利要求4所述的类病毒基因药物共传递纳米载体的制备方法， 其特征在于， 在步骤1中， 药物为阿霉素， 将盐酸阿霉素进行脱盐处理， 再通过再沉淀法得到自组装阿霉 素纳米粒子： 采用微型注。

5、射器在避光条件下， 向超纯水中边搅拌边缓慢滴加脱盐阿霉素， 搅 拌5h， 搅拌速度为1000rpm/5min， 递交速度为每分钟15ml， 温度为室温2025摄氏度。 6.根据权利要求4所述的类病毒基因药物共传递纳米载体的制备方法， 其特征在于， 在步骤2中， 基因为鱼精DNA， 或者p53基因； 阳离子聚合物为PEI， Mw1800； 采用浓度为1mg/ mL PEI水溶液和浓度为200ng/ L的DNA水溶液进行复合， 两者复合时间为1040min， 优选 3040min， 温度为室温2025摄氏度。 7.根据权利要求4所述的类病毒基因药物共传递纳米载体的制备方法， 其特征在于， 在步骤3。

6、中， 阿霉素纳米粒子加入含有纳米复合物PEI/DNA的水溶液中， 通过静电力作用， 以 使阿霉素纳米粒子与PEI/DNA进行复合， 复合时间为1015min， 温度为室温2025摄氏度。 8.如权利要求1所述的类病毒基因药物共传递纳米载体在制备基因治疗和/或化学 治疗药物中的应用。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 109200294 A 2 类病毒基因药物共传递纳米载体及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及一种新型的具有肿瘤选择性多功能纳米制剂的制备方法， 属于生物医 药领域。 背景技术 0002 癌症， 也称恶性肿瘤， 如今己经成为人类身体健康和生存寿命的重大威胁。 目。

7、前, 临床上常用的癌症治疗手段主要包括有外科手术、 放射治疗、 化学治疗和基因治疗。 然而传 统的化疗药物毒副作用大， 肿瘤靶向性差， 还容易产生多药耐药性。 随着分子生物学的迅猛 发展和纳米技术的日渐成熟， 基因治疗已然成为根治癌症的强有力手段。 目前基因治疗面 临的一个亟待解决的问题仍是如何使治疗基因高效的输送进入宿主细胞， 为此， 需要一个 合适的载体作为协助。 聚阳离子载体一直是最具前景的非病毒基因载体之一， 但是他们的 转染效率还有待提高。 DNA与载体的复合物进入细胞的能力是影响基因转染效率的主要因 素之一， 所以人们高度期望能够有一种策略可以促进DNA纳米复合物的细胞摄取能力。 。

8、近年 来， 随着人们对病毒结构与功能关系的深化理解， 为我们进行人工载体的设计提供了有用 的信息， 使得通过提高跨膜转运能力来实现高水平转染成为了可能。 研究表明， 许多病毒， 如流感病毒， 单纯疱疹病毒(HSV)和人类免疫缺陷病毒(HIV)等均含有一个被尖锋糖蛋白覆 盖的粗糙表面， 而这种尖锋糖蛋白组成的纳米级粗糙病毒表面对细胞膜是 “友好的” ， 有利 于细胞内吞。 为此构建一个类病毒表面的纳米基因载体将有可能实现高转染， 最终提高癌 症的治疗效率。 0003 近年来随着人们对病毒结构与功能关系的深入了解， 人们意识到病毒的粗糙表面 有利于其进入细胞， 目前已有许多类病毒纳米载体相继被设计。

9、。 例如， Yu等模拟病毒的粗糙 表面， 将小粒径硅球修饰在大硅球表面以增加其粗糙程度， 制备了一个类病毒表面的纳米 载药系统。 研究表明具有粗糙表面的纳米硅球更容易进入细胞。 冯俊课题组将金纳米粒子 通过静电作用复合在负载有DNA的纳米复合物表面， 形成了一种类病毒表面的有机无机杂 化纳米载药系统， 提高了聚阳离子基因载体进入细胞的能力， 同时实现了癌症的基因治疗 和光热治疗的协同治疗。 纵观所有载体的设计多是通过硬质材料来实现类病毒表面纳米载 体的设计， 很少有人利用软质材料来进行类病毒表面纳米载体的设计。 0004 阿霉素(DOX)作为一种常用的临床癌症化疗药物， 由于其疏水性强， 毒副。

10、作用大以 及载药量低等缺陷， 极大的限制了其在临床上的应用。 近年来许多研究表明， 自由的DOX可 以自组装成纳米粒子， 粒径约10nm左右， 且带负电。 例如有人利用DOX自组装形成一种无载 体的纳米载体。 实验表明该纳米载体有90.47的载药量， 而且具有良好的肿瘤治疗效果。 同时， 已有研究和临床数据表明单一疗法(化疗和基因治疗)不可避免的存在固有的不足， 多种治疗手段的联合使用因此近年成为肿瘤治疗手段的重要发展方向。 将多种不同治疗机 制的治疗因子， 装载在同一纳米载体中运载到疾病部位， 实现定点同时给药， 可以互补机制 缺陷或者实现治疗增效。 但药物与基因的装载和传递机制截然不同， 。

11、构建高效低毒且具有 良好生物相容性的共传递体系成为目前有关协同治疗研究的突出挑战之一。 说 明 书 1/5 页 3 CN 109200294 A 3 发明内容 0005 本发明的目的在于克服现有技术的不足， 要解决的技术问题是提供一种具有类病 毒粗糙表面的、 可实现基因/药物共传递、 高效低毒无载体纳米制剂及其制备方法， 将DOX自 组装纳米载体通过静电作用力引入到DNA与聚乙烯亚胺(PEI)复合物的表面， 一方面改变了 DNA/PEI复合物的光滑表面， 以促进其进入细胞的能力， 提高其转染效率； 另一方面DOX的介 入， 使得该纳米载体实现了基因与药物的同时装载， 有望实现肿瘤的基因治疗与化。

12、学治疗 的协同治疗， 最终实现癌症的高效治疗。 0006 类病毒基因药物共传递纳米载体， 将药物自组装为药物纳米粒子， 通过静电作 用力将基因与阳离子聚合物复合形成纳米复合物， 再利用静电作用力将药物纳米粒子复合 在纳米复合物表面， 形成同时装载有基因和药物的具有类病毒粗糙表面的纳米载体。 0007 在上述技术方案中， 药物为阿霉素。 0008 在上述技术方案中， 基因为鱼精DNA， 或者p53基因。 0009 在上述技术方案中， 阳离子聚合物为PEI， Mw1800。 0010 在上述技术方案中， 类病毒基因药物共传递纳米载体的大小为140150nm， 整 体呈现负电势。 0011 在进行制。

13、备时， 按照下述步骤进行： 0012 步骤1， 将药物自组装为药物纳米粒子 0013 在步骤1中， 药物为阿霉素， 将盐酸阿霉素进行脱盐处理， 再通过再沉淀法得到自 组装阿霉素纳米粒子： 采用微型注射器在避光条件下， 向超纯水中边搅拌边缓慢滴加脱盐 阿霉素， 搅拌5h， 搅拌速度为1000rpm/5min， 递交速度为每分钟15ml， 温度为室温2025 摄氏度。 0014 步骤2， 通过静电作用力将基因与阳离子聚合物复合形成纳米复合物 0015 在步骤2中， 基因为鱼精DNA， 或者p53基因； 阳离子聚合物为PEI， Mw1800； 采用浓 度为1mg/mL PEI水溶液和浓度为200ng。

14、/ L的DNA水溶液进行复合， 两者复合时间为10 40min， 优选3040min， 温度为室温2025摄氏度。 0016 在步骤2中， 基因和阳离子聚合物体系中的氮磷比为2030， 即N/P比是指载体材 料所含N的摩尔数与DNA所含P的摩尔数之比。 0017 步骤3， 利用静电作用力将药物纳米粒子复合在纳米复合物表面 0018 阿霉素纳米粒子(DOX NPs)加入含有纳米复合物PEI/DNA的水溶液中， 通过静电力 作用， 以使阿霉素纳米粒子与PEI/DNA进行复合， 复合时间为1015min， 温度为室温2025 摄氏度。 0019 在步骤3中， 先分别测定DOX与PEI/DNA的电势，。

15、 再根据两者电势进行不同比例的匹 配和混合， 得到电中性粒子。 0020 本发明的类病毒基因药物共传递纳米载体在制备基因治疗和/或化学治疗药物 中的应用。 0021 本发明所制备的具有类病毒表面的基因药物共传递载体选用的是低分子量聚乙 烯亚胺， 毒性低， 生物相容性好。 DOX NPs纳米粒子通过静电力作用复合在PEI/DNA的表面增 加了PEI/DNA纳米复合物的表面粗糙度， 使得载体更易进行细胞内吞， 提高转染效率。 同时， 说 明 书 2/5 页 4 CN 109200294 A 4 本发明所制备的共传递体系可以实现基因与药物的共传递， 在癌症治疗领域实现基因治疗 与化疗的协同治疗。 本。

16、发明制备方法简单， 毒性低转染效率高， 并且可提高药物和基因的利 用率， 进一步提高对肿瘤细胞的杀伤效果。 附图说明 0022 图1是本发明中使用的PEI1800的化学结构式。 0023 图2是本发明制备的类病毒粗糙表面基因药物共传递纳米载体PEI/DNADOX的DLS 图像(粒径分布图)。 0024 图3是本发明制备的类病毒粗糙表面基因药物共传递纳米载体PEI/DNADOX的TEM 图像， 其中A为DOX NPs、 B为PEI/DNA、 C为PEI/DNADOX。 0025 图4是本发明制备的类病毒粗糙表面基因药物共传递纳米载体PEI/DNADOX的 HeLa细胞毒性图像， 分别为PEI/D。

17、NA、 DOX NPs和PEI/DNADOX的细胞毒性示意图。 0026 图5是本发明实施例中PEI/DNA在HeLa细胞中培养4小时后的激光共聚焦图像， 其 中绿色为YoYo-1标记的DNA， 蓝色为细胞核。 0027 图6是本发明实施例中类病毒粗糙表面基因药物共传递纳米载体PEI/DNADOX的 在HeLa细胞中培养4小时后的激光共聚焦图像， 其中绿色为YoYo-1标记的DNA， 蓝色为细胞 核， 红色为DOX。 具体实施方式 0028 下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。 0029 阿霉素纳米粒子的制备(DOX NPs) 0030 将10mg的DOXHCl加入到9mL二甲基亚砜。

18、(DMSO)中， 再向溶液中加入1mL三乙胺 (TEA)， 避光条件下搅拌12h， 制备1mg/mL的DOX脱盐溶液。 0031 取200 L的1mg/mL的DOX脱盐溶液， 在1000rpm/5min的剧烈搅拌下， 用微型注射器 缓慢滴加到10mL水中， 避光条件下搅拌12h， 使用之前用220nm滤头对其进行过滤。 具体制备 详见参考文献Wang C ,Cheng L ,Liu Z .Drug delivery with upconversion nanoparticles for multi-functional targeted cancer cell imaging and ther。

19、apy. J.Biomaterials,2011,32(4):1110-20。 0032 PEI/DNA纳米复合物的制备 0033 配制分子量为1800的PEI水溶液(1mg/mL)， 浓度为200ng/ L的DNA水溶液(鱼精 DNA， 购买自： 天津市凯通试剂化学有限公司， 规格： 5g)。 然后按照PEI与DNA的氮磷比(N/P) 为20的纳米复合物。 即： 将2.6 gPEI加入到5.0 g的DNA溶液中， 加入92.4mL超纯水， 将复合 物涡旋30s并置于37的环境中孵育30min。 之后用含有超纯水将复合物稀释至1mL。 0034 PEI/DNADOX纳米载体的制备 0035 向。

20、1mL的DNA/PEI纳米复合物溶液中加入80 L的DOX NPs溶液， 涡旋30s， 然后将该 复合物置于37恒温箱中孵育15min， 使其通过静电力复合。 0036 PEI/DNADOX纳米载体的粒径和电势分析 0037 使用动态光散射粒度仪(DLS)测试纳米粒子的粒径和电势。 DOX NPs的DOX的粒径 为10nm， PDI为0.384， 电势为-34.1mV。 PEI/DNA的粒径为140nm左右， 电势为+22.0mV。 不同浓 说 明 书 3/5 页 5 CN 109200294 A 5 度DOX与PEI/DNA复合物复合后的粒径和电势， 以使最终PEI/DNADOX纳米载体为电。

21、中性粒 子， 即先分别测定DOX与PEI/DNA的电势， 再根据两者电势进行不同比例的匹配和混合， 得到 电中性粒子。 随着加入DOX NPs溶液体积的不断增加， PEI/DNADOX的粒径有一个增大的趋 势， 电势不断的降低。 粒径的增大和电势的降低说明DOX NPs成功的复合到了PEI/DNA上， 增 加了PEI/DNA的体积且中和了其正电性。 当DOX NPs加入体积为80 L时， 纳米粒子的电势为- 5.58mV， 接近电中性， 生物相容性最好。 同时其平均粒径为152.4nm， 也符合纳米粒子的尺寸 要求。 考虑到电势与粒径对纳米粒子进入细胞的影响， 以及DOX的载药量， 选择DOX。

22、体积为80 L的复合物作为样品模型， 并做进一步的研究。 0038 PEI/DNADOX纳米载体对HeLa细胞毒性的研究 0039 PEI/DNA在复合DOX NP前后的细胞毒性通过MTT法检测， 同时加上阿霉素纳米粒 子， 共计三组样品PEI/DNA、 DOX NPs和PEI/DNADOX。 HeLa细胞以6.0103个细胞每孔的密 度接种在96孔板中在加入复合物溶液之前， 在100 L含有10FBS的DMEM培养基中培养24小 时。 采用在DLS实验部分所描述的方法将聚合物与1 g的鱼精DNA在N/P比为20的不同的条件 下复合。 并加入不同浓度的DOX(10 L、 30 L、 50 L、。

23、 70 L、 80 L)， 在37恒温箱中复合15min 后， 将其与细胞共培养48小时后， 用200 L新鲜的含有10FBS的DMEM培养基替代原来的培 养基， 并在每孔中加入20 L MTT(5mg/mL in PBS buffer)溶液， 在37培养箱中继续培养4 小时， 弃去培养基， 每孔中加入150 L DMSO， 在酶标仪(Bio-Red,Model 550,USA)上检测该 溶液在570nm处的吸光强度。 细胞的相对存活率按如下公式计算： Cell viability() (OD570(smple)/OD570(control)100， 其中OD570(sample)和OD570。

24、(Control)分别代表无样品处理和有 样品处理后的溶液吸光值。 0040 由图中可以看出， PEI/DNA复合物中的细胞存活率高达98以上， 证明PEI/DNA复 合物基本没有毒性。 而由于DOX纳米粒子的引入， 细胞存活率明显下降， 且随着DOX纳米粒子 浓度的增加细胞毒性明显增大。 证明PEI/DNADOX的毒性是由DOX NPs引起的。 DOXNPs的体 积为80 L时其毒性达到最大， 故进一步确定DOX NPs加入量为80 L。 PEI/DNADOX的细胞毒 性大于裸DOX NP， 从另一个角度证明DOX NPs的引入改变了纳米粒子的表面粗糙程度， 引起 了细胞内吞行为的变化， 最。

25、终增强了其对肿瘤细胞的杀伤能力。 0041 PEI/DNADOX纳米载体对HeLa细胞和COS7细胞的内吞行为的研究 0042 采用激光共聚焦(CLSM)研究纳米粒子在HeLa细胞和COS7细胞内的内吞行为。 此实 验中选择PEI与DNA的最佳转染比20来研究。 首先将细胞以1105的浓度接种在三个单独的 小培养皿中， 37条件下在含有10FBS的DMEM培养基培养24小时。 1 g的DNA在与聚合物复 合之前， 与2.5 L的浓度为110-5YoYo-1在37下作用15min以进行荧光标记， 然后将其按 照PEI/DNA复合物制备实验以及DLS测试实验中的方法将其与PEI以及DOX NPs进。

26、行复合， 并 将其在37条件下孵育30min。 随后用含有10FBS的DMEM培养基将DOX NP、 PEI/DNA、 PEI/ DNADOX复合物稀释至1mL并立即加入到接种有细胞的单个培养皿中。 培养4小时后， 弃去培 养基并用500mL PBS轻轻润洗几次， 然后在激光共聚焦显微镜(Nikon C1-si TE2000, Japan)下观察红光、 绿光和蓝光的分布情况， 绿光的激发波长为488nm,发射波长是515- 530nm； 红光的激发波长为561nm； 蓝光的激发波长为405nm。 细胞图像通过EZ-C1 3.70软件 记录。 为了避免发生荧光猝灭， 实验全程进行避光处理。 00。

27、43 如图5和6所示， 绿色代表YoYo-1标记的鱼精DNA， 红色代表DOX的荧光， 蓝色代表 说 明 书 4/5 页 6 CN 109200294 A 6 33342标记的细胞核。 图像清晰显示绿色荧光分散HeLa细胞的细胞质中， 不难发现图6绿色 荧光较图5中的绿色荧光也有一定的增强， 说明表面修饰的软质材料DOX NPs引入到PEI/ DNA纳米复合物的表面增加了其表面粗糙程度， 对PEI/DNADOX的内吞行为起到了一定的促 进作用。 同时复合纳米粒子的红色荧光强度也高于纯DOX NPs的荧光强度， 与图4结果相吻 合， 也进一步证明类病毒纳米基因/药物共载体系的设计可以有效提高进入。

28、细胞的能力， 最 终提高其抗癌能力。 图6红色荧光与绿色荧光的同时增强， 也进一步说明了该纳米载体可同 时将DNA和DOX运载进入细胞， 也从另一个侧面进一步表明DOX NPs很好的修饰在了PEI/DNA 复合物表面， 该纳米载体具有同时实现基因治疗和化学治疗的潜力。 0044 根据本发明内容记载进行工艺参数的调整， 均可实现本发明载体的制备且表现出 基本一致的性能， 如选择用作治疗的DNA： p53基因， 购买自： 北京赛业生物科技有限公司， 规 格： 20 g， 制备具有治疗功能的载体。 以上对本发明做了示例性的描述， 应该说明的是， 在不 脱离本发明的核心的情况下， 任何简单的变形、 修改或者其他本领域技术人员能够不花费 创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。 说 明 书 5/5 页 7 CN 109200294 A 7 图1 图2 图3 说 明 书 附 图 1/2 页 8 CN 109200294 A 8 图4 图5 图6 说 明 书 附 图 2/2 页 9 CN 109200294 A 9 。