本发明涉及4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺或其药学上可接受的盐或水合物(化合物A)和N-[5-(4-乙基-哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基]-[5-氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-3H-苯并咪唑-5-基)-嘧啶-2-基]-胺或其药学上可接受的盐(化合物B)的组合癌症疗法和使用组合治疗急性髓性白血病、慢性髓性白血病、乳腺癌、卵巢癌、恶性黑素瘤、肺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、肉瘤、硬纤维瘤 、腺样囊性癌(ACC)、结直肠癌、前列腺癌或成神经管细胞瘤的方法。
4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺，或其药学上可接受的盐或水合物是Notch途径信号传导抑制剂化合物。Notch信号传导在发育和组织稳态期间起重要作用。由于配体和/或受体的突变、扩增或过表达导致的Notch信号传导的失调涉及许多恶性肿瘤。抑制Notch信号传导是癌症治疗学发展的潜在目标。化合物A及制备和使用该化合物的方法，包括使用该化合物治疗T细胞急性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、红白血病、乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、结直肠癌、头颈癌、宫颈癌、前列腺癌、肝癌、鳞状细胞癌(口腔)、皮肤癌和成神经管细胞瘤的方法公开在WO 2013/016081中。正在1期临床试验和具有明确分子途径改变或基于组织的恶性肿瘤的扩展队列中，以及T细胞急性淋巴细胞白血病或T细胞淋巴母细胞淋巴瘤(T-ALL/T-LBL)患者的临床试验中研究化合物A。
N-[5-(4-乙基-哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基]-[5-氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-3H-苯并咪唑-5-基)-嘧啶-2-基]-胺 (阿贝环利)是细胞周期蛋白依赖性激酶4和6(CDK4/6)的抑制剂。许多哺乳动物肿瘤，包括人类肿瘤，都会发生改变，这可能导致细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)CDK4和CDK6的激活。这些改变包括直接激活CDK4和CDK6的突变，增加各种蛋白激活剂如细胞周期蛋白D的表达的基因扩增，以及降低蛋白抑制剂如p16的表达的基因损失。这些各种机制以及视网膜母细胞瘤(Rb)的丧失可以通过减少对在正常条件下刺激生长所需的外部生长因子和促有丝分裂信号传导途径的依赖性而导致增强的增殖潜力。阿贝环利及制备和使用该化合物的方法，包括使用该化合物治疗结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、尤其是非小细胞肺癌(NSCLC)、前列腺癌、黑素瘤(包括恶性黑素瘤和转移性恶性黑素瘤)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、成神经管细胞瘤、套细胞淋巴瘤、慢性髓细胞性白血病(CML)和急性髓细胞性白血病(AML)的方法公开在WO2010/075074中。正在治疗转移性乳腺癌，与氟维司群组合治疗转移性乳腺癌，治疗KRAS突变型非小细胞肺癌(NSCLC)，与来曲唑或阿那曲唑组合治疗转移性乳腺癌，以及治疗套细胞淋巴瘤的临床试验中研究化合物B。
本领域已经考虑了CDK4和CDK6抑制剂与Notch信号传导途径抑制剂的组合，Joshi等人, Blood, 2009, 113(8): 1689-1698；Rao等人, Cancer Res., 2009, 69(7): 3060-3068。
尽管存在针对癌症患者的治疗选择，但仍然需要在治疗方案中提供增强功效和较低毒性中的一种或两种的新的和不同的疗法。
据信，与单独的任一种药剂提供的治疗效果相比，本发明提供了来自化合物A和化合物B的组合活性的有益治疗效果。
本发明的一个方面提供治疗患者的急性髓性白血病、慢性髓性白血病、乳腺癌、卵巢癌、恶性黑素瘤、肺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、肉瘤、硬纤维瘤、腺样囊性癌(ACC)、结直肠癌、前列腺癌或成神经管细胞瘤的方法，所述方法包括向需要治疗的患者施用有效量的4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺，或其药学上可接受的盐或水合物，和有效量的N-[5-(4-乙基-哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基]-[5-氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-3H-苯并咪唑-5-基)-嘧啶-2-基]-胺，或其药学上可接受的盐。
本发明的另一个方面提供治疗患者的肺癌的方法，所述方法包括向需要治疗的患者施用有效量的4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺，或其药学上可接受的盐或水合物，和有效量的N-[5-(4-乙基-哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基]-[5-氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-3H-苯并咪唑-5-基)-嘧啶-2-基]-胺，或其药学上可接受的盐。
本发明的另一方面提供治疗患者的急性髓性白血病、慢性髓性白血病、乳腺癌、卵巢癌、恶性黑素瘤、肺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、肉瘤、硬纤维瘤 、腺样囊性癌(ACC)、结直肠癌、前列腺癌或成神经管细胞瘤的方法，所述方法包括向需要治疗的患者同时、分别或相继施用有效量的4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺，或其药学上可接受的盐或水合物，和有效量的 N-[5-(4-乙基-哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基]-[5-氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-3H-苯并咪唑-5-基)-嘧啶-2-基]-胺，或其药学上可接受的盐。
本发明的另一个方面提供治疗患者的肺癌的方法，所述方法包括向需要治疗的患者同时、分别或相继施用有效量的4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺，或其药学上可接受的盐或水合物，和有效量的N-[5-(4-乙基-哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基]-[5-氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-3H-苯并咪唑-5-基)-嘧啶-2-基]-胺，或其药学上可接受的盐。
本发明的另一方面提供化合物 4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺，或其药学上可接受的盐或水合物；和化合物N-[5-(4-乙基-哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基]-[5-氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-3H-苯并咪唑-5-基)-嘧啶-2-基]-胺，或其药学上可接受的盐；其同时、分别或相继用于治疗急性髓性白血病、慢性髓性白血病、乳腺癌、卵巢癌、恶性黑素瘤、肺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、肉瘤、硬纤维瘤 、腺样囊性癌(ACC)、结直肠癌、前列腺癌或成神经管细胞瘤。
本发明的另一个方面提供化合物4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺，或其药学上可接受的盐或水合物；和化合物N-[5-(4-乙基-哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基]-[5-氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-3H-苯并咪唑-5-基)-嘧啶-2-基]-胺，或其药学上可接受的盐；其同时、分别或相继用于治疗肺癌。
本发明的另一个方面提供：4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺，或其药学上可接受的盐或水合物用于制备药物的用途；和N-[5-(4-乙基-哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基]-[5-氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-3H-苯并咪唑-5-基)-嘧啶-2-基]-胺或其药学上可接受的盐用于制备药物的用途；
所述药物用于同时、分别或相继治疗急性髓性白血病、慢性髓性白血病、乳腺癌、卵巢癌、恶性黑素瘤、肺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、肉瘤、硬纤维瘤 、腺样囊性癌(ACC)、结直肠癌、前列腺癌或成神经管细胞瘤。
本发明的另一方面提供：4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺，或其药学上可接受的盐或水合物用于制备药物的用途；和N-[5-(4-乙基-哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基]-[5-氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-3H-苯并咪唑-5-基)-嘧啶-2-基]-胺或其药学上可接受的盐用于制备药物的用途；所述药物用于同时、分别或相继治疗肺癌。
本发明的另一个方面是商业包装，其包含每种治疗剂的单独组合物，或本发明治疗剂的组合，以及用于同时、分别或相继施用以用于治疗急性髓性白血病、慢性髓性白血病、乳腺癌、卵巢癌、恶性黑素瘤、肺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、肉瘤、硬纤维瘤 、腺样囊性癌(ACC)、结直肠癌、前列腺癌或成神经管细胞瘤的说明书。
本发明的仍另一个方面是商业包装，其包含每种治疗剂的单独组合物，或本发明治疗剂的组合，以及用于同时、分别或相继施用以用于治疗肺癌的说明书。
化合物4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺，或其药学上可接受的盐或水合物(化合物A)具有CAS登录号142138-81-4。或者，该化合物可以被命名为：N-[(1S)-2-[[(7S)-6,7-二氢-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-5H-吡啶并[3,2-a][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代乙基]-4,4,4-三氟丁酰胺。可使用其他名称来明确识别化合物A。
化合物N-[5-(4-乙基-哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基]-[5-氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-3H-苯并咪唑-5-基)-嘧啶-2-基]-胺或其药学上可接受的盐(化合物B)具有CAS 登录号1231929-97-7。该化合物的通用名称是阿贝环利。可替代的化合物名称包括2-嘧啶胺、N-[5-[(4-乙基-1-哌嗪基)甲基]-2-吡啶基]-5-氟-4[4-氟-2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-苯并咪唑-6-基]-、1-[5-(4-乙基-哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基]-[5-氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-3H- 苯并咪唑-5-基)-嘧啶-2-基]-胺和[5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基]-5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-胺。可使用其他名称来明确识别化合物B。
如本文所用，术语“患者”是指哺乳动物，优选人。
“治疗有效量”或“有效量”是指化合物A或其药学上可接受的盐或水合物，或含有化合物A或其药学上可接受的盐或水合物的药物组合物的剂量，以及化合物B或其药学上可接受的盐，或含有化合物B或其药学上可接受的盐的药物组合物的剂量，所述剂量是在患者中抑制肿瘤细胞生长和消除或减缓或阻止癌症进展所必需的。化合物A或其药学上可接受的盐的预期剂量范围为2.5 mg/患者至75 mg/患者，T.I.W.。化合物B或其药学上可接受的盐或水合物的预期剂量范围为75 mg至200 mg，每天两次(B.I.D.)给药。化合物A或其药学上可接受的盐或水合物的预期优选剂量范围为5 mg至50 mg T.I.W，并且化合物B或其药学上可接受的盐的预期优选剂量范围为100 mg至150 mg，每天两次。治疗患者所需的确切剂量和治疗时长将由医生根据疾病的阶段和严重程度以及个体患者的具体需要和反应来确定。可以调整给药管理(dosing administration)以向患者提供更优的治疗益处并控制或改善任何药物相关的毒性。替代给药方案，例如每天一次(QD)、每天两次(B.I.D.)、每天三次(T.I.D.)；每隔一天给药一次(dosing once per day every other day, Q2D)；在5天时段内每隔一天一次(once per day every other day)，然后两天不给药(T.I.W.)；或每三天一次(Q3D)，可适用于化合物A和化合物B中的每一个。
本发明的组合疗法通过向需要治疗的肺癌患者或其他指定的癌症患者施用有效量的化合物A，或其药学上可接受的盐或水合物(在14-28天周期内，每周(7天)在5天内每隔一天一次(once per day every other day)和两天不给药)，和化合物 B，或其药学上可接受的盐(在14-28天周期内每天两次)来进行。
术语“治疗(treatment、treat和treating)”意味着包括对患者所患癌症的全方位干预，例如施用化合物A和B以缓解、减缓、停止或逆转一种或多种症状，和延迟、停止或逆转癌症的进展，即使癌症实际上没有被消除。
优选使用药学上可接受的载体将化合物A或其药学上可接受的盐或水合物配制成药物组合物，并通过各种途径施用。优选地，这种组合物用于口服施用。优选使用药学上可接受的载体将化合物B或其药学上可接受的盐配制成药物组合物，并通过各种途径施用。优选地，这种组合物用于口服施用。这种药物组合物及其制备工艺是本领域熟知的。参见，例如，HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS, 第5版, Rowe等人, Eds., Pharmaceutical Press (2006)；和REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY，Troy等人, Eds., 第21版，Lippincott Williams & Wilkins (2006)。
化合物A和化合物B中的每一个都能够与许多无机和有机抗衡离子反应形成药学上可接受的盐。这种药学上可接受的盐和制备它们的常用方法是本领域熟知的。参见，例如P. Stahl等人, HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS:PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002)；S.M. Berge等人, “Pharmaceutical Salts, “ Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, 1977年1月。
本发明的组合治疗的功效可以通过评价癌症治疗中常用的各种终点来测量，包括但不限于肿瘤消退，肿瘤重量或大小缩小，进展时间，总生存，无进展生存，总反应率，反应持续时间，以及无肿瘤消退下转移扩散的抑制。
术语“组合”和“药物组合”是指：1)一种剂量单位形式的固定剂量组合；或2)非固定剂量组合，任选地包装在一起用于组合施用。
术语“同时”施用是指以单一行为向患者施用化合物A和化合物B中的每一个，例如其中将两种药剂掺入用于施用的单一剂型(固定剂量组合)，和其中独立地基本上同时或在允许化合物A和B显示协同治疗效果的时间间隔内分别施用化合物A 和化合物B中的每一个。
术语“分别”施用是指从非固定剂量组合剂型同时、基本同时或以任何顺序相继向患者施用化合物A和化合物B中的每一个。可能存在施用每种化合物的指定时间间隔。
术语“相继”施用是指以分开行为从非固定(分开)剂型向患者施用化合物A和化合物B中的每一个。两个施用行为可以由指定时间间隔联系。例如，每天施用化合物A和每隔一天施用化合物B。
短语“与…组合”包括向需要治疗的癌症患者同时、分别和相继施用化合物A和化合物B中的每一个。
术语“共同施用”或“组合施用”包括向单一患者施用治疗剂，并且包括其中可以通过不同施用途径或在不同时间施用药剂的治疗方案。
可以例如使用本领域已知的合适方法例如Sigmoid-Emax方程(Holford和Scheiner, Clin. Pharmacokinet., 1981, 6: 429-453)、Loewe相加方程(Loewe和Muischenk, Arch. Exp. Pathol. Pharmacol., 1926, 114: 313-326)、中效方程 (Chou和Talalay, Adv. Enzyme Regul., 1984, 22: 27-55)或Bliss独立方法来计算在单一患者中产生效应的两种治疗剂的有益作用，其大于单独施用的每种药剂的简单累加效应。每个方程或分析可以应用于实验数据产生相应的图，以帮助评估药物组合的效应。与方程相关的相应图包括浓度-效应曲线、等效线图解曲线(isobologram curve)和组合指数曲线。
癌症越来越被认为是一种疾病的异质集合，其起始和进展是由一个或多个基因的异常功能诱导的，所述基因调节细胞和组织微环境中的DNA修复、基因组稳定性、细胞增殖、细胞死亡、粘附、血管生成、侵袭和转移。“癌症”基因的变体或异常功能可能是由于天然存在的DNA多态性，基因组拷贝数改变(通过扩增、删除、染色体缺少或重复)，基因和染色体结构改变(通过导致基因表达失调的染色体易位、倒转或其他重排)和点突变导致的。癌性肿瘤可由一个异常基因功能诱导，并由相同的异常基因功能维持，或由其他异常基因功能加剧维持和进展。
除了上述遗传染色体畸变之外，每种癌症还可以包括基因组的表观遗传修饰，包括DNA甲基化，基因组印记和通过乙酰化、甲基化或磷酸化进行的组蛋白修饰。表观遗传修饰可能在诱导和/或维持恶性肿瘤中起作用。
正如所指出的，癌症的性质是多因素的。在适当的情况下，可以组合具有不同作用机制的治疗剂。然而，仅考虑具有不同作用模式的治疗剂的组合不一定导致具有有利效果的组合。独立地，与各治疗剂的单一疗法相比，提供已证明的有益效果(治疗效果，例如增强的功效和/或较低的毒性)的具体治疗剂是优选的。
本发明的组合特别适合于治疗标准治疗已失败的肺癌患者。这包括患有显示出对单一疗法的抗性或显示出对不同于本发明的组合的抗性的肺癌的患者。
与根据RECIST v1.1, Eisenhauer等人, European Journal of Cancer, 2009, 45, 228-247的定义一致使用术语“完全反应”(CR)、“部分反应”(PR)、“病情进展”(PD)、“病情稳定”(SD)、“客观反应”(OR)。
术语“疾病进展时间”(TTP)是指从初始治疗时到癌症进展的时间，通常以周或月衡量(参见RECIST v1.1病情进展的定义)，其是目标病灶直径总和增加至少20％，参照研究中的最小总和(这包括基线总和，如果这是研究中最小的)。除了相对增加20％之外，总和还必须证明绝对增加至少5 mm。一个或多个新病灶的出现也被认为是进展。这种进展由临床医生评价。
术语“延长TTP”是指相对于i)未治疗患者，或ii)用少于化合物A和化合物B两者治疗的患者，增加治疗患者的疾病进展时间。
术语“生存”是指患者保持活着，并且包括总生存以及无进展生存。
术语“总生存”是指患者从诊断或治疗时起保持活着一段规定的时段，例如1年、5年等。
术语“无进展生存”是指患者在没有癌症进展的情况下保持活着。
如本文所用，术语“延长生存”是指相对于i)未治疗患者，ii)用少于化合物A和化合物B两者治疗的患者，或iii)对照治疗方案，增加治疗患者的总或无进展生存。在开始治疗后或在开始诊断癌症后，监测生存一段规定的时段，例如一个月、六个月、一年、五年或十年等。
术语“原发性肿瘤”或“原发性病灶”是指原始癌症，而不是位于患者体内另一组织、器官或位置的转移性肿瘤或病灶。
在一个实施方案中，化合物A的剂量逐渐增加直至达到最大耐受剂量，并且以固定剂量施用本发明的化合物B。或者，化合物A可以固定剂量施用，并且化合物B的剂量可以逐渐增加。每个患者可以每天或间歇地接受化合物A和/或化合物B的剂量。在这种研究中，可以例如在12、18或24周后，通过每6周评价症状评分确定治疗功效。
4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺，或其药学上可接受的盐或水合物可以通过WO 2013/016081描述的程序制备。
N-[5-(4-乙基-哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基]-[5-氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-3H-苯并咪唑-5-基)-嘧啶-2-基]-胺或其药学上可接受的盐可以通过WO2010/075074公开的程序制备。
以下生物实施例说明单独的化合物A，单独的化合物B和化合物A和化合物B的组合中的每一个的活性。
生物实施例1
使非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系NCI-H441 (ATCC®为HTB-174)和NCI-H2122 (ATCC®为CRL-5985)在补充有2 mM L-谷氨酰胺、10 mM HEPS、1 mM丙酮酸钠、4500 mg/L葡萄糖、1500 mg/L碳酸氢钠和10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基中于37℃，5％CO2和大气湿度下生长。根据ATCC程序对细胞进行传代培养，并在存在或不存在1μM化合物A的情况下，用增加浓度的甲磺酸阿贝环利(化合物B)进行治疗。48小时后通过CellTiter-Glo测定(Promega)定量细胞的生长。计算每种浓度下的生长抑制，并从4-参数浓度-响应曲线确定IC50值。生长曲线表明，该组合适度地增强了一种(H2122)但不是两种细胞系中的生长抑制。NCI-H4441：化合物B IC50 = 0.97 µM；化合物B + 化合物A IC50 = 0.78 µM。NCI-H2122：化合物B IC50 = 0.45 µM；化合物B + 化合物A IC50 = 0.14 µM。
时间过程研究：用1μM化合物A治疗NCI-H441和NCI-H2122 NSCLC细胞系4或24小时，并收获所述细胞系以评价对细胞周期生物标志物表达的影响，其包括细胞周期抑制剂p21和p27，以及细胞周期进展的标志物，包括磷酸化组蛋白H3(pHH3)(M-期标志物)、Topo 2A(S期标志物)、phospho_ser780-RB(G1以及CDK4/6抑制标志物)和细胞周期蛋白D1。在治疗24小时后在H2122细胞中观察到pHH3、Topo2A、pRB和总RB的微小减少，这表明可能抑制细胞周期。这些数据与H2122细胞中对生长抑制的观察相关，其中该组合对细胞生长具有适度影响。
浓度-响应研究：在存在或不存在1μM化合物A的情况下，用各种浓度(0.05、0.1、0.2、0.4和0.8 µM)的化合物B治疗H2122细胞，其中将两种化合物同时加入培养物中。治疗24小时后收获细胞，并通过免疫印迹评价各种细胞周期生物标志物的表达。作为选择性CDK4/6抑制剂，化合物B显示pRB(phospho-ser780-Rb)、总RB、Topo IIa和pHH3的浓度依赖性抑制。RB是CDK4/6的直接激酶靶标，因此pRB的抑制提供了CDK4/6抑制的直接量度。Topo IIA和pHH3的抑制分别指示通过细胞周期的S期和M期对细胞周期进展的抑制。结果表明，化合物A略微增加了这些生物标志物对化合物B的抑制的敏感性。1μM单独的化合物A对这些生物标志物的表达没有影响。在H441细胞系中进行相同的研究。在该细胞系中，当将化合物B单一疗法与和化合物A的组合治疗进行比较时，细胞周期生物标志物表达没有变化。这与细胞生长研究一致，其显示化合物A的组合不会增强化合物B的生长抑制。
浓度-响应研究：在存在或不存在1μM化合物A的情况下，用各种浓度(0.05、0.1、0.2、0.4和0.8 µM)的化合物B治疗H2122细胞，其中在加入化合物B之前1天将化合物A加入培养物中。加入后24小时收获细胞，并通过免疫印迹评价各种细胞周期生物标志物的表达。作为选择性CDK4/6抑制剂，化合物B显示pRB(phospho-ser780-Rb)、总RB、Topo IIa和pHH3的浓度依赖性抑制。RB是CDK4/6的直接激酶靶标，因此pRB的抑制提供了CDK4/6抑制的直接量度。Topo IIA和pHH3的抑制分别指示通过细胞周期的S期和M期对细胞周期进展的抑制。结果表明，化合物A略微增加了这些生物标志物对化合物B的抑制的敏感性。1μM单独的化合物A对这些生物标志物的表达没有影响。这些数据与同时添加两种化合物的研究没有不同。
生物实施例2
NCI-H2122是人腺癌非小细胞肺癌细胞系(ATCC®为CRL-5985)。使细胞在培养基中于37℃，5％CO2和大气湿度下生长。NCI-H2122的细胞培养基是RPMI-1640，其含有2 mM L-谷氨酰胺、10 mM 2-[4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)、1 mM丙酮酸钠、4500 mg/L葡萄糖、1500 mg/L碳酸氢钠和10％胎牛血清(FBS)。
为了评价体内功效，将在1:1 Matrigel®混合物(0.2 mL体积)中的5 x 106个NCI-H2122细胞通过皮下注射植入6-8周龄无胸腺雌性裸小鼠(Harlan Laboratories)的后腿。刚好在植入之前，照射(450全身照射)动物。小鼠自由采食正常食物。当肿瘤大小达到150 ± 50 mm3时，通过口服施用(管饲)0.2 mL体积的在1％羧甲基纤维素钠(Na-CMC)/0.25％Tween®-80中的化合物A或在1％羟乙基纤维素(HEC)/磷酸盐缓冲液pH 2.0中的化合物B或其各自的媒介物开始治疗。以5或8 mg/kg按照周三、周五和周一的时间表(TIW)施用化合物A 2周，并且以25或50 mg/kg每天施用化合物B 14天。
随时间监测肿瘤生长和体重以评价功效和毒性迹象。每周两次进行肿瘤的二维测量，并基于下式计算肿瘤体积：(肿瘤体积) = [(L) x (W2) x (Π/6)]，其中L是中轴长度，W是中轴宽度。将肿瘤体积数据转换为对数标度以均衡跨时间和治疗组的方差。使用SAS™软件(版本8.2)中的MIXED™程序，通过时间和治疗的双因素重复测量方差分析来分析对数量数据(log volume data)。重复测量的相关模型是空间力(spatial power)。来自重复测量分析，反对数至肿瘤体积标度的最小二乘平均值显示在表1中。用于比较第27研究日每对组的P值显示在表2中。测试组为：
1:1% HEC/25 mM磷酸盐缓冲液, pH 2, QD x14, PO / 1% CMC/0.25% Tween 80/0.05%消泡剂,/ W-F-M x2, PO
3:化合物B, 50 mg/kg, QD x 14, PO
4:化合物A, 5 mg/kg, W-F-M x2, PO
5:化合物A, 8 mg/kg, W-F-M x2, PO
7:化合物B, 50 mg/kg, QD x 14, PO / 化合物A, 5 mg/kg, W-F-M x2, PO
8:化合物B, 50 mg/kg, QD x 14, PO / 化合物A, 8 mg/kg, W-F-M x2, PO。
将第7组和第9组合并并标记为第7组，因为它们接受与测试程序相反的相同治疗方案。第6组因感染而提前终止，并且未提供可评价的结果。未显示第2组，因为其是化合物B单一治疗，治疗方案与第6组组合治疗中的化合物B相同。
表2 组间P值(重复测量ANOVA)
组 3 4 5 7 8 研究日 1 <0.001 0.212 0.005 <0.001 <0.001 27 3 0.017 0.415 <0.001 0.006 27 4 0.113 <0.001 <0.001 27 5 <0.001 <0.001 27 7 0.141 27
表2显示了在该测试中，50 mg/kg的化合物B和5 mg/kg的化合物A的组合(第7组)证明了统计学显著的肿瘤生长抑制结果，相对于单独的50 mg/kg的化合物B(第3组)和单独的5 mg/kg的化合物A(第4组)中的每一个。表5还显示了在该测试中，50 mg/kg的化合物B和8 mg/kg的化合物A的组合(第8组)证明了统计学显著的肿瘤生长抑制结果，相对于单独的50 mg/kg的化合物B(第3组)和单独的8 mg/kg的化合物A(第5组)中的每一个。
组合分析
使用先前描述的重复测量分析，使用组合的两种具体治疗(第7组)，使用对比语句(contrast statement)来测试第27研究日的相互作用效应。对于第7组，该测试是统计学显著的，p = 0.026，证明优于累加或协同活性，因为组合组中估计的平均肿瘤体积(212 mm3)小于依照Bliss独立方法的预期累加肿瘤体积(492 x 761 / 955 = 392 mm3)。
临床评价
在患有晚期或转移性实体癌肿瘤的患者中的4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺水合物与N-[5-(4-乙基-哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基]-[5-氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-3H-苯并咪唑-5-基)-嘧啶-2-基]-胺的组合的研究。
研究设计
该研究是一项多中心、非随机、开放标签研究，由在患有来自各种实体瘤的晚期/转移性癌症的患者中的剂量递增阶段，随后是在具体肿瘤类型中的剂量确认阶段组成。在剂量递增阶段，合格的患者将在28天周期接受T.I.W.口服给予的化合物A与每12小时一次口服给予的细胞周期蛋白依赖性激酶4和6(CDK4/6)抑制剂(阿贝环利；化合物B)的组合。单剂量的阿贝环利也将在3天导入期的第1天给予(仅剂量递增阶段)用于PK评价。在剂量确认阶段，将治疗大约15名转移性乳腺癌患者，所述患者具有与Notch途径信号传导相关的突变、扩增或基因表达改变。
研究目的
该研究的主要目的是确定与阿贝环利 (化合物B)抗癌剂组合的化合物A的推荐2期剂量。
该研究的次要目的是表征与化合物B组合的化合物A的安全性和毒性特征，通过美国国家癌症研究所(NCI)的通用不良事件术语标准(CTCAE) v4.0评估；估计与化合物A组合的阿贝环利及其主要活性代谢物5-氟-4-[4-氟-2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-苯并咪唑-6-基]-N-[5-(哌嗪-1-基甲基)吡啶-2-基]嘧啶-2-胺和{6-[2-({5-[(4-乙基哌嗪-1-基)甲基]吡啶-2-基}氨基)-5-氟嘧啶-4-基]-4-氟-1-(丙-2-基)-1H-苯并咪唑-2-基}甲醇的PK参数；记录与阿贝环利组合的化合物A观察到的任何抗肿瘤活性；和评估反应持续时间和无进展生存(PFS)。
探索性目的是探索化合物A对指示Notch活性的生物标志物或阿贝环利的药效学(PD)效应；探索正电子发射断层成像(PET)扫描的效用，以评估与阿贝环利组合的化合物A的治疗效果；探索与诱导细胞色素P450(CYP)酶相关的预测性生物标志物，如皮质醇和6β-羟基皮质醇；和评价肿瘤组织和血液中与Notch信号传导途径和药物靶标途径相关的生物标志物，免疫功能，研究药物或疾病状态的作用机制以及它们与研究目的的潜在关联。
试验药物
4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺水合物，剂量范围25-50 mg，作为胶囊口服给予，每周三次(每周7-天)，在28-天周期期间。
N-[5-(4-乙基-哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基]-[5-氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-3H-苯并咪唑-5-基)-嘧啶-2-基]-胺，剂量50 mg，作为胶囊口服给予，QD，在28-天周期期间。
4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺水合物作为胶囊在瓶中供应用于经口食用。这些胶囊应在室温下在标签上规定的温度范围内储存。
N-[5-(4-乙基-哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基]-[5-氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-3H-苯并咪唑-5-基)-嘧啶-2-基]-胺作为50 mg羟丙甲纤维素胶囊供应。这些胶囊应在室温下在标签上规定的温度范围内储存。
治疗/给药的计划持续时间
就剂量递增研究的性质而言，将在持续基础上评价数据，直到确定组合的最大耐受剂量(MTD)。剂量递增将由3 + 3方法驱动。
每个新的剂量水平将最少有3名患者参加。如果1名患者在任何剂量水平下在化合物A的第一周期内都经历剂量限制性毒性(DLT)，则多达3名另外的患者将在该剂量水平参加。如果在任何剂量水平下在2名或更多名患者中观察到DLT，则剂量递增将停止，并且或者先前的剂量水平将被宣布为最大耐受剂量(MTD)，或者在赞助者和研究者之间的讨论之后，可以在先前的和目前的剂量水平之间的中间剂量下治疗其他患者。
在剂量递增期间，化合物A的起始剂量将为25 mg TIW，和化合物B的起始剂量将为100 mg BID。剂量递增计划根据表3进行。
表3
剂量递增方案
剂量水平 化合物A 剂量(mg) 化合物B 剂量(mg) 1 25 100 BID 2 50 100 BID 3 50 150 BID
缩写：BID =每天两次。
评价标准
安全性：NCI CTCAE, 版本4.0, 剂量限制性毒性(DLT)。
功效：将通过以下一项或多项肿瘤测量放射学测试评估每位患者：计算机断层成像(CT)扫描；磁共振成像(MRI)；和PET扫描(给药前和给药后)。也将通过以下方式评估每位患者的完整疾病程度：
通过RECIST 1.1测量肿瘤(Eisenhauer等人, Eur. J. Cancer, 2009; 45(2): 228-247)。除了RECIST 1.1外，对于软组织肉瘤患者的肿瘤测量评价，将使用Choi等人, J. Clin. Oncol., 2007; 25(13): 1753-1759反应标准。神经肿瘤学反应评估(RANO)标准将用于胶质母细胞瘤患者(Wen等人, J. Clin. Oncol., 2010; 28(11): 1963-1972)；
如果指出，评价肿瘤标志物；
评价体能状况(美国东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG); Oken等人, Am. J. Clin. Oncol., 1982; 5: 649-655)。
为了确认客观反应，应对所有病灶进行放射学评估，并且应在初始观察客观反应后至少4周使用基线时使用的抽样方法重复用于初始反应确定的相同放射学方法。如果患者停止研究，如果存在明确的病情进展的临床体征，则可以省略重复放射学评估。