一种双黄连液体制剂及其含量测定方法.pdf

本发明主要涉及一种双黄连液体制剂及其含量测定方法。双黄连液体制剂主要含有黄芩苷、连翘苷、绿原酸等，其不良反应主要表现在过敏性休克、皮肤潮红、皮疹等。本发明提供了一种双黄连液体制剂，其中含有适量的绿原酸、黄芩苷和连翘苷等有效成分，不仅具有理想的治疗效果，同时还降低了过敏反应的发生。本发明还提供了一种双黄连液体制剂有效成分的检测方法。使用本发明的检测方法，只需要使用一种流动相，就可以同时检测黄芩苷、连翘苷、绿原酸、木犀草苷和汉黄芩素等五种有效成分的含量。该方法不仅显著提高了检测效率，而且还有效地降低了检测成本。

1.一种双黄连液体制剂，其中含有连翘苷0.3-1.0mg/ml、黄芩苷10.0-12.0mg/ml、绿原酸0.6-1.0mg/ml。 2.如权利要求1所述的双黄连液体制剂，其中还含有木犀草苷0.005-0.05mg/ml、汉黄芩素0.05-0.2mg/ml。 3.一种双黄连液体制剂的含量测定方法，使用高效液相色谱作为检测系统，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，理论塔板数按绿原酸峰计算，应不低于2000，以乙腈-0.2％磷酸溶液为流动相，其中乙腈为流动相A，0.2％磷酸溶液为流动相B，检测波长为270-290nm，其中包括柱平衡、上样、洗脱等步骤，在洗脱步骤中，流动相A的体积百分比逐渐递增，先用体积百分比为27％的A相和73％的B相作为流动相洗脱2-4个柱体积；然后用体积百分比为30％的A相和70％的B相作为流动相洗脱1-3个柱体积；接着用体积百分比为60％的A相和40％的B相作为流动相洗脱2-4个柱体积；再用体积百分比为90％的A相和10％的B相作为流动相洗脱3-5个柱体积；其中检测对象为连翘苷、黄芩苷、绿原酸、木犀草苷和汉黄芩素的含量。

技术领域

本发明属于中药领域，具体涉及一种双黄连液体制剂及其含量测 定方法。

背景技术

双黄连液体制剂为金银花、连翘和黄芩经提取精制而得，主要含 有黄芩苷、连翘苷、绿原酸、木犀草苷、汉黄芩素等。现代药理研 究证明，双黄连液体制剂具有抗菌、抗病毒、解热等作用，可以清 热解毒，清宣风热，适用于外感风热引起的发热、咳嗽、咽痛等病 症。临床上被广泛用于治疗病毒及细菌感染的上呼吸道感染、肺炎、 扁桃体炎、咽炎等。然而，随着双黄连液体制剂在临床上的广泛应 用，其不良反应的报道也屡见不鲜。双黄连液体制剂的不良反应主 要表现在过敏性休克、皮肤潮红、皮疹等。

因此，需要研究解决双黄连液体制剂在使用过程中引起的过敏问 题，从而确定更加安全的双黄连液体制剂的配方。

另外，为了保证双黄连液体制剂的质量，还需要提供更加高效的 有效成分含量检测方法。目前广泛使用的方法是《中国药典》2005 年版一部记载的方法。该方法采用高效液相色谱法分别测定绿原酸、 连翘苷和黄芩苷含量，且在每一种成分的测定中，使用不同的色谱 条件。例如，在检测黄芩苷时，使用的流动相是甲醇-水-冰醋酸 (50∶50∶1)；使用的检测波长为274nm；并要求按黄芩苷峰计算， 色谱柱的理论塔板数不低于1500。再如在检测绿原酸时，使用的流 动相是甲醇-水-冰醋酸(20∶80∶1)；使用的检测波长为324nm；并要 求按绿原酸峰计算，色谱柱的理论塔板数不低于6000。另外，在检 测连翘苷时，使用的流动相是乙腈-水(25∶75)；使用的检测波长为 278nm；并要求按连翘苷峰计算，色谱柱的理论塔板数不低于6000。

由此可见，现有技术中为了检测绿原酸、连翘苷和黄芩苷的含量， 使用了3套不同的色谱条件，这显然增加了检测工作量，延长了检 测时间，增加了检测成本。另外，现有技术中的检测方法通常只检 测黄芩苷、连翘苷和绿原酸的含量，而不检测另外两种有效成分木 犀草苷和汉黄芩素的含量。

发明内容

在双黄连液体制剂所含的有效成分中，绿原酸既是抗病毒、抗菌 的有效成分，也是可疑的致敏原性物质，进入机体后可能会导致过 敏反应。另外，黄芩和连翘提取物中的皂苷成分在大剂量应用的情 况下，也易引起过敏反应。为了尽量避免和减少双黄连液体制剂引 起的过敏反应，需要控制其中的绿原酸、黄芩苷和连翘苷的含量。

因此，本发明的一个目的是提供一种有效成分配比更加合理的双 黄连液体制剂。

本发明的另一个目的是提供一种可以同时检测双黄连液体制剂 中多种有效成分含量的方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

一种双黄连液体制剂，其中含有连翘苷0.1-1.0mg/ml、黄芩苷 6.0-12.0mg/ml、绿原酸0.4-1.0mg/ml。

根据本发明的一种优选实施方案，本发明的双黄连液体制剂中含 有连翘苷0.1-0.8mg/ml、黄芩苷6.0-10.0mg/ml、绿原酸0.4-1.0mg/ml。 该实施方案提供的双黄连液体制剂为一种注射液。

根据本发明的另一种优选实施方案，本发明的双黄连液体制剂中 含有连翘苷0.3-1.0mg/ml、黄芩苷8.0-12.0mg/ml、绿原酸 0.6-1.0mg/ml。该实施方案提供的双黄连液体制剂为一种口服液。

根据本发明的又一种优选实施方案，本发明的双黄连液体制剂中 还含有木犀草苷0.005-0.05mg/ml、汉黄芩素0.05-0.2mg/ml。

一种双黄连液体制剂的含量测定方法，该方法使用高效液相色谱 作为检测系统，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，理论塔板数按 绿原酸峰计算，应不低于2000，以乙腈-0.2％磷酸溶液为流动相，其 中乙腈为流动相A，0.2％磷酸溶液为流动相B，检测波长为 270-290nm，其中包括柱平衡、上样、洗脱等步骤，在洗脱步骤中， 流动相A的体积百分比逐渐递增，先用体积百分比为27％的A相和 73％的B相作为流动相洗脱2-4个柱体积；然后用体积百分比为30％ 的A相和70％的B相作为流动相洗脱1-3个柱体积；接着用体积百 分比为60％的A相和40％的B相作为流动相洗脱2-4个柱体积；再 用体积百分比为90％的A相和10％的B相作为流动相洗脱3-5个柱 体积。

本发明提供的双黄连液体制剂含有适量的绿原酸、黄芩苷和连翘 苷，不仅具有理想的治疗效果，而且还同时降低了过敏反应的发生。 根据本发明的检测方法，只需要使用一种流动相，就可以同时检测 黄芩苷、连翘苷、绿原酸、木犀草苷和汉黄芩素等五种有效成分的 含量。该方法不仅显著提高了检测效率，而且还有效地降低了检测 成本。

具体实施方式

实施例1

1)金银花提取物的制备

称取金银花，加水温浸2-3次，过滤，浓缩，醇沉，过滤，滤液 回收乙醇至无乙醇味，加入膏重2-6倍量的纯化水，轻轻搅拌，静置， 取上清液过滤，滤液浓缩后再次进行醇沉，静置，取上清液过滤， 浓缩，得金银花提取物。

采用高效液相色谱法检测，测得提取物中含绿原酸15.22mg/g， 木犀草苷0.38mg/g。

2)连翘提取物的制备

称取连翘，加水煎煮3次，合并药液，后续步骤同金银花温浸后 步骤，得连翘提取物。

采用高效液相色谱法检测，测得提取物中含连翘苷4.05mg/g。

3)黄芩提取物的制备

取黄芩饮片，加水煎煮2次，每次2小时，过滤，合并滤液，调pH 值，静置，滤过，沉淀加水调pH值溶解，再加等量乙醇，搅拌，过 滤，调pH值，滤过，沉淀用乙醇洗至中性，回收乙醇，离心，精制 得黄芩提取物。

采用高效液相色谱法检测，测得提取物中含黄芩苷72.16mg/g， 含汉黄芩素1.07mg/g。

实施例2

用实施例1中得到的3种提取物配制如下配方：

注射液的配制(每支注射液的装量为10ml)

1)配方1：绿原酸0.4mg/ml，黄芩苷6.0mg/ml，连翘苷0.1mg/ml， 汉黄芩素0.09mg/ml，木犀草苷0.01mg/ml。

2)配方2：绿原酸1.0mg/ml，黄芩苷10.0mg/ml，连翘苷0.8mg/ml， 汉黄芩素0.15mg/ml，木犀草苷0.024mg/ml。

3)配方3：绿原酸1.5mg/ml，黄芩苷9.0mg/ml，连翘苷0.3mg/ml， 汉黄芩素0.13mg/ml，木犀草苷0.04mg/ml。

4)配方4：绿原酸2.0mg/ml，黄芩苷8.0mg/ml，连翘苷0.5mg/ml， 汉黄芩素0.12mg/ml，木犀草苷0.05mg/ml。

口服液的配制(每支口服液的装量为10ml)

5)配方5：绿原酸0.6mg/ml，黄芩苷8.0mg/ml，连翘苷0.3mg/ml， 汉黄芩素0.12mg/ml，木犀草苷0.015mg/ml。

6)配方6：绿原酸1.0mg/ml，黄芩苷12.0mg/ml，连翘苷1.0mg/ml， 汉黄芩素0.18mg/ml，木犀草苷0.024mg/ml。

7)配方7：绿原酸1.5mg/ml，黄芩苷11.0mg/ml，连翘苷0.5mg/ml， 汉黄芩素0.16mg/ml，木犀草苷0.04mg/ml。

8)配方8：绿原酸2.0mg/ml，黄芩苷9.0mg/ml，连翘苷0.8mg/ml， 汉黄芩素0.13mg/ml，木犀草苷0.05mg/ml。

实施例3

双黄连液体制剂对小鼠流感病毒感染的保护作用

药物：本发明的双黄连注射液(配方1，新双黄连1)：绿原酸 0.4mg/ml，黄芩苷6.0mg/ml，连翘苷0.1mg/ml，汉黄芩素0.09mg/ml， 木犀草苷0.01mg/ml。

本发明的双黄连口服液(配方5，新双黄连2)：绿原酸0.6mg/ml， 黄芩苷8.0mg/ml，连翘苷0.3mg/ml，汉黄芩素0.12mg/ml，木犀草苷 0.015mg/ml。

市售双黄连注射液：绿原酸1.3mg/ml，黄芩苷7.2mg/ml，连翘 苷0.04mg/ml，汉黄芩素0.02mg/ml，木犀草苷0.003mg/ml。。

市售双黄连口服液：绿原酸1.1mg/ml，黄芩苷8.4mg/ml，连翘 苷0.4mg/ml，汉黄芩素0.04mg/ml，木犀草苷0.002mg/ml。

动物：ICR封闭群小鼠，体重(20±2)g，雌雄各半

病毒株：甲型流行性感冒病毒鼠肺适应株FM1

方法：1)病毒滴度测定

将FM1接种于9-11d胚龄鸡胚尿囊腔，0.2ml/胚，35℃孵育72h， 连续传代2次，收获鸡胚尿囊液。用血凝实验测定混合的尿囊液中 FM1的血凝效价。混合尿囊液病毒滴度为1280Hμ/ml。病毒液分装， 保存-80℃备用。

2)病毒毒力(LD50)测定

ICR小鼠60只，随机分为6组，每组10只，雌雄各半。用Hank’s 液将FM1病毒液自原液浓度起做10倍梯度稀释，稀释倍数分别为1、 10、102、103、104，用乙醚对小鼠进行浅麻醉。每一稀释度病毒滴 鼻感染一组小鼠，0.03ml/只，正常对照组用生理盐水滴鼻，0.03ml/ 只。小鼠感染病毒后连续饲养观察7d，逐日记录小鼠死亡数及活动 情况。当正常对照组小鼠无异常，全部存活时，按Bliss法计算FM1 对ICR小鼠的LD50及其95％可信区间。

3)小鼠病毒性肺炎造模

采用10×LD50的病毒量滴鼻感染ICR小鼠。

4)死亡保护率和生命延长率测定

ICR小鼠40只，随机分为4组：两组给药组(新双黄连1组、 市售双黄连注射液组)、肺炎模型组和正常对照组，每组10只，雌 雄各半。除正常对照组外，其他组小鼠浅麻醉状态下滴鼻感染 10×LD50FM1，0.03ml/只。两组给药组分别注射新的双黄连液体制 剂、市售双黄连液体制剂0.2ml/20g，肺炎模型组和正常对照组小鼠 注射0.2ml/20g生理盐水。1次/d，连续给药7d。逐日观察记录各组 小鼠发病死亡数，统计各组小鼠存活时间，计算小鼠生命延长率和 小鼠死亡保护率。

生命延长率(％)＝(实验组存活时间-模型组存活时间)/模型 组存活时间×100％

死亡保护率(％)＝(模型组死亡率-实验组死亡率)/模型组死 亡率×100％

5)肺指数测定

小鼠造模、分组同上。灌胃给予新双黄连2、市售双黄连口服液 或生理盐水。给药7d期间，立即称量死亡小鼠的体重和肺脏重量。 给药7d后，断颈处死仍然存活的小鼠，称量体重和肺脏重量。计算 肺指数和肺炎抑制率。

肺指数＝肺脏重量/体重×100％

抑制率(％)＝(模型组肺指数-实验组肺指数)/模型组肺指数 ×100％

6)病毒感染小鼠肺部组织中流感病毒含量的测定

将上述实验小鼠的肺脏称重，按每0.1g肺组织加1ml的比例加 入生理盐水，在组织匀浆器中研磨制成匀浆液，1500rpm/10min离心， 取上清液，用血凝实验测定流感病毒的滴度(血凝单位Hμ/g)。

结果：1)双黄连注射液对流感病毒性肺炎小鼠的保护作用

流感病毒FM1给小鼠滴鼻后，连续观察7d，FM1感染的肺炎小 鼠死亡发生在感染后的第3-5天。模型组小鼠在第3、4、5天分别死 亡4、4、2只，死亡率100％。两组给药组对流感病毒性肺炎小鼠的 死亡保护率均为80％，新双黄连1组的生命延长率为65.7％，市售 双黄连注射液组的生命延长率为66.2％，两组间无显著差异，但与模 型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。表明两组给药组均能降低 流感病毒性FM1肺炎小鼠的死亡率，延长存活时间，两组给药组对 流感病毒的保护作用相当。结果详见表1。

表1双黄连注射液对流感病毒性肺炎小鼠的死亡保护作用

 组别   剂量   (ml/20g)   例数   (只)   死亡数   (只)   死亡保   护率(％)   存活   时间(d)   生命延   长率(％)  正常对照组   10   10  肺炎模型组   10   10   3.6±0.3  新双黄连1组   0.2   10   10   80   5.9±0.6   65.7  市售组   0.2   10   10   80   5.9±0.8   66.2

2)双黄连口服液对流感病毒性肺炎小鼠肺部流感病毒FM1滴度 的影响

模型组的肺指数是正常组的2.5倍，新双黄连2组的肺指数是正 常组的1.77倍，市售双黄连口服液组的肺指数是正常组的1.75倍， 两组给药组与模型组比较P＜0.01；正常组小鼠的病毒滴度为0，模 型组的病毒滴度为2011Hμ/g，两组给药组的病毒滴度与模型组比较 差异有统计学意义(P＜0.01)，但两组间无显著性差异。结果详见 表2。

表2双黄连口服液对流感病毒性肺炎小鼠肺部的影响

 组别   剂量   (ml/20g)   例数   (只)   肺指数   病毒滴度   (Hμ/g)   抑制指数  正常对照组   10   1.16±0.2  肺炎模型组   10   2.9±0.3   2011±502  新双黄连2组   0.2   10   2.03±0.2   670±132   0.51  市售组   0.2   10   2.05±0.1   668±145   0.50

实施例4

过敏反应试验比较

取实施例2中的配方1、2、5和6，按过敏反应检查法进行试验， 结果小鼠无明显反应，表明上述配方的双黄连液体制剂不会致过敏 反应。而选择配方3、4、7和8进行试验，各组小鼠均有不同程度 的过敏反应，表现为轻微抓鼻、颤抖、竖毛等，表明绿原酸含量在 1.0mg/ml以上的双黄连液体制剂有产生过敏现象的可能。

按现行标准对新双黄连液体制剂进行检验，各项均符合要求，另 对其进行异常毒性、降压物质、过敏反应、树脂、重金属、有害元 素和指纹图谱检查，也符合相关要求。

实施例5

1)仪器与试药

仪器：高效液相色谱仪Agilent 1200，色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 4.6×150mm 5μ。

对照品：黄芩苷(批号：110715-200514)，连翘苷(批号： 110821-200610)，绿原酸(批号：110753-200413)，汉黄芩素(批 号：111514-200403)，木犀草苷(批号：111720-200503)，上述对 照品均购自中国药品生物制品检定所。

样品：配方1、2、3

试剂：乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2)色谱条件与洗脱程序

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.2％磷 酸溶液为流动相；检测波长为278nm；流速为1.0ml/min；柱温25℃； 理论板数按绿原酸峰计算，应不低于2000。

洗脱程序：在洗脱步骤中，流动相A的体积百分比逐渐递增， 先用体积百分比为27％的A相和73％的B相作为流动相洗脱2-4个 柱体积；然后用体积百分比为30％的A相和70％的B相作为流动相 洗脱1-3个柱体积；接着用体积百分比为60％的A相和40％的B相 作为流动相洗脱2-4个柱体积；再用体积百分比为90％的A相和10％ 的B相作为流动相洗脱3-5个柱体积。

3)供试品溶液的制备

精密吸取双黄连液体制剂1.0ml，置于50ml容量瓶中，加流动 相溶解并稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，即得。

4)对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的绿原酸、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩素和木 犀草苷对照品适量，置10ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度， 摇匀，制成浓度分别为20μg/ml、240μg/ml、7μg/ml、1.6μg/ml和 0.3μg/ml的混合对照品溶液。

5)线性关系考察

分别精密吸取混合对照品溶液2μl、5μl、10μl、15μl、20μl，将 其注入液相色谱仪，记录色谱图。分别以绿原酸、黄芩苷、连翘苷、 汉黄芩素和木犀草苷进样量(μg)为横坐标，以峰面积为纵坐标， 进行线性回归，结果见表3。

表3绿原酸、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩素和木犀草苷的 线性回归方程

  组分   回归方程   r   线性范围(μg)   黄芩苷   Y＝-2166591+3870320X   0.9999   0.48-4.80   连翘苷   Y＝-9801+5637830X   0.9999   0.014-0.14   绿原酸   Y＝982150+9913130X   0.9999   0.04-0.40   汉黄芩素   Y＝145021+6301853X   0.9998   0.0032-0.032   木犀草苷   Y＝-63452+2564216X   0.9997   0.0004-0.004

6)精密度试验

精密吸取绿原酸、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩素和木犀草苷混合对 照品溶液注入液相色谱仪，重复进样5次，每次20μl。绿原酸峰面 积RSD＝0.96％，黄芩苷峰面积RSD＝0.81％，连翘苷峰面积 RSD＝0.64％，汉黄芩素峰面积RSD＝0.58％，木犀草苷峰面积 RSD＝0.76％。结果表明，所选方法精密度良好。

7)稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、24h 进样，测定样品中绿原酸、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩素和木犀草苷 的峰面积，结果绿原酸峰面积RSD＝1.55％，黄芩苷峰面积 RSD＝1.96％，连翘苷峰面积RSD＝1.74％，汉黄芩素峰面积 RSD＝2.01％，木犀草苷峰面积RSD＝1.68％。表明样品溶液在24h内 稳定。

8)重复性试验

取同一样品，按供试品溶液制备方法分别制备5份样品溶液，按 含量测定方法分别测定，记录峰面积，结果绿原酸RSD＝1.20％，黄 芩苷RSD＝1.34％，连翘苷RSD＝1.06％，汉黄芩素RSD＝1.28％，木犀 草苷RSD＝1.49％，表明方法重现性良好。

9)专属性试验

按处方比例及制备工艺，分别制备缺金银花、黄芩、连翘的阴性 对照样品，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液。分别取 混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液，按含量测定方法 进行测定，结果阴性对照品溶液在供试品溶液和混合对照品溶液中 绿原酸、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩素和木犀草苷保留时间相应位置 上均无吸收峰出现，表明阴性对照品无干扰。

10)准确度试验

精密量取同一样品0.4ml各6份，分别置于50ml容量瓶中，每 瓶均加入绿原酸、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩素和木犀草苷对照品适 量，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤。按 含量测定方法进行测定，结果绿原酸平均回收率为98.5％，RSD为 1.04％；黄芩苷平均回收率为99.43％，RSD为1.36％；连翘苷平均 回收率为99.67％，RSD为1.03％；汉黄芩素平均回收率为98.02％， RSD为1.81％；木犀草苷平均回收率为99.28％，RSD为1.16％。

11)含量测定

取3批样品，按供试品溶液制备方法分别进行处理得供试品溶 液。分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相 色谱仪，按上述色谱条件和洗脱程序进行检测，用外标法计算样品 中绿原酸、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩素和木犀草苷的含量，结果见 表4。

表4配方1、2、3中各有效成分的含量测定结果

 批号   绿原酸   (mg/ml)   黄芩苷   (mg/ml)   连翘苷   (mg/ml)   汉黄芩素   (mg/ml)   木犀草苷   (mg/ml)  配方1   0.406   6.04   0.103   0.092   0.013  配方2   0.998   10.06   0.796   0.147   0.024  配方3   1.512   9.04   0.315   0.133   0.041