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1、(10)授权公告号 CN 101254242 B (45)授权公告日 2013.02.27 CN 101254242 B *CN101254242B* (21)申请号 200710079645.9 (22)申请日 2007.03.02 A61K 36/725(2006.01) A61K 9/08(2006.01) A61K 9/10(2006.01) A61K 9/20(2006.01) A61K 9/48(2006.01) A61P 3/10(2006.01) A61P 13/12(2006.01) A61K 35/64(2006.01) A61K 31/045(2006.01) (73)专。
2、利权人 河北以岭医药研究院有限公司 地址 050035 河北省石家庄市高新技术开发 区天山大街 238 号 (72)发明人 刘志民 邹俊杰 宋迎香 CN 1334121 A,2002.02.06, 权利要求 3. CN 1709291 A,2005.12.21, 权利要求 1. (54) 发明名称 一种中药组合物在制备抑制血管紧张素受 体的药物中的应用 (57) 摘要 本发明公开了一种中药组合物的新用途， 具 体地是该中药组合物在制备抑制血管紧张素 II 受体表达的药物中的应用。本发明药物能不同程 度抑制糖尿病患者血浆、 肾组织 Ang I、 Ang II 水 平的升高， 逆转糖尿病患者肾组织。
3、AT1aR的mRNA、 AT2R 的 mRNA 表达的上调和 AT1aR/AT2R 比值的增 加， 并能逆转糖尿病患者肾重 / 体重比的增加， 而 血糖并无明显改变， 本发明药物能抑制糖尿病患 者肾素 - 血管紧张素系统激活， 起到延缓和改善 糖尿病肾病的作用， 且这种作用不依赖于血糖的 改变。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 刘俊香 权利要求书 1 页 说明书 8 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 8 页 1/1 页 2 1. 一种中药组合物在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用， 所述中药组合物由如下重量 份的原料药制成 ：。
4、 人参 3-10 水蛭 3-11 土鳖虫 5-10 制乳香 1-5 赤芍 3-9 降香 1-5 檀香 1-5 全蝎 3-9 蝉蜕 3-12 蜈蚣 1-3 冰片 1-7 炒酸枣仁 3-10。 2. 如权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述中药组合物降低血管紧张素 II 受体 1/ 血管紧张素 II 受体 2 的比值。 3. 如权利要求 1 所述的应用， 其特征在于所述中药组合物由如下重量份的原料药制 成 ： 人参 6 水蛭 10 土鳖虫 7 制乳香 2 赤芍 5 降香 2 檀香 2 全蝎 7 蝉蜕 7 蜈蚣 1 冰片 5 炒酸枣仁 5 ； 或 ： 人参 10 水蛭 8 土鳖虫 7 制乳香。
5、 2 赤芍 5 降香 2 檀香 2 全蝎 9 蝉蜕 7 蜈蚣 1 冰片 5 炒酸枣仁 5 ； 或 ： 人参 6 水蛭 11 土鳖虫 7 制乳香 2 赤芍 5 降香 2 檀香 2 全蝎 3 蝉蜕 7 蜈蚣 1 冰片 5 炒酸枣仁 5。 4. 如权利要求 1-3 中任一项所述的应用， 其特征在于所述中药组合物的活性成分由下 列成分组成 ： a 平均粒径小于 100 的全蝎、 水蛭、 蜈蚣、 土鳖虫、 蝉蜕及制乳香药粉 ； b 冰片药粉 ； c 由降香和檀香提取的挥发油 ； d 人参用乙醇提取后的醇提液经浓缩后的醇提浸膏 ； e 提取成分 c 后的降香和檀香药渣的水提液、 赤芍和炒酸枣仁加水煎煮后的。
6、水提液以 及提取成分 d 后的人参药渣的水提液过滤、 混匀后浓缩成的水提浸膏。 5. 如权利要求 1-3 中任一项所述的应用， 其特征在于含有所述中药组合物的药物制剂 为胶囊剂、 片剂、 丸剂或口服液。 权 利 要 求 书 CN 101254242 B 2 1/8 页 3 一种中药组合物在制备抑制血管紧张素 II 受体的药物中 的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种中药组合物的新用途， 具体地， 涉及一种中药组合物在制备抑制 血管紧张素 II 受体的药物中的应用。 背景技术 0002 肾素 - 血管紧张素系统 (Renin-angiotensin system， RAS) 是人生理的主要调。
7、节 因子。它通过对心脏、 血管和肾脏的调节作用控制了血压、 体液和电解质平衡。近来研究 证实， RAS 还广泛存在于局部组织， 包括肾组织， 以自分泌、 旁分泌和胞内分泌的形式， 调节 局部组织的血流和细胞的生长、 增殖和代谢， 其效应不依赖于循环的 RAS 系统。肾素将血 管紧张素原转化为十肽的血管紧张素 I(angiotensin I， Ang I)， Ang I 在体内存留时间短 且生物活性较弱， 它在血管紧张素转化酶 (ACE) 作用下转化成具有生物活性的血管紧张素 II(angiotensin II， Ang II)。现在 Ang II 被认为是一个影响细胞功能的调节包括细胞 的增殖。
8、， 凋亡， 迁徙， 炎症和纤维化在内的多效应激素， 是 RAS 系统的主要活性成分， 它的升 高预示 RAS 系统的激活。在糖尿病高糖的病理条件下， 局部的 RAS 激活， 升高的 AT II 造成 内皮功能紊乱， 结构重塑， 血管炎症， 并与糖尿病肾病， 左心室肥大， 动脉粥样硬化的发生、 发展密切相关 Touyz RM & Schiffrin EL.Signal transduction mechanismsmediating the physiological and pathophysiological actions ofangiotensin II in vascular smoo。
9、th muscle cells( 血管平滑肌细胞中调节血管紧张素 II 生理学和病理学行为的信号 转导机制 ).PharmacologicalReviews( 药理学评论 )， 2000， 52 ： 639-672.。 0003 血管紧张素 II 主要通过其 1 型受体 (angiotensin II receptors， AT1R) 和 2 型 受体(AT2R)发挥生物学作用Shanmugam S and Sandberg K.Ontogenyof angiotensin II receptors( 血管紧张素 II 受体的个体发生学 ).Cell BiolInt( 国际细胞生物学 )， 1。
10、996， 20(3) ： 169-176。 0004 目前临床和实验室的研究均提示在糖尿病肾病发病机理中 RAS 系统的重要的作 用。高糖导致 Ang II 增加使肾脏的血流动力学恶化并导致一系列的细胞因子、 生长因 子和细胞内信号的改变， 是糖尿病肾病的重要的病理机制之一 Wolf G， Ziyadeh FN.The role of angiotensin II in diabeticnephropathy ： emphasis on nonhemodynamic mechanisms( 血管紧张素 II 在糖尿病肾病中的角色 ： 强调非血流动力学机制 ).Am J Kidney Dis( 。
11、美国肾脏病杂志 )， 1997， 29(1) ： 153-163。 0005 本发明是在第01131203.3号中国专利和第200410048292.2号专利申请的基础上 进行的改进发明， 在此全文引用该两专利文件记载的内容。本发明提供了一种中药组合物 在制备治疗糖尿病肾病的药物中的新应用， 通过对本发明药物干预前后血浆和肾脏血管紧 张素水平及其受体mRNA的表达的测定， 确定其对糖尿病RAS系统的影响及糖尿病肾脏保护 作用。 说 明 书 CN 101254242 B 3 2/8 页 4 发明内容 0006 本发明目的是提供一种中药组合物在制备抑制血管紧张素 II 受体的药物中的应 用， 其中。
12、， 该血管紧张素 II 受体包括受体 1 和受体 2。该中药组合物还降低血管紧张素 II 受体 1/ 血管紧张素 II 受体 2 的比值。 0007 所述中药组合物由如下重量份的原料药制成 ： 0008 人参 3-10 水蛭 3-11 土鳖虫 5-10 乳香 ( 制 )1-5 赤芍 3-9 降香 1-5 0009 檀香 1-5 全蝎 3-9 蝉蜕 3-12 蜈蚣 1-3 冰片 1-7 酸枣仁 ( 炒 )3-10 ； 0010 优选地， 该中药组合物由如下重量份的原料药制成 ： 0011 人参 6 水蛭 10 土鳖虫 7 乳香 ( 制 )2 赤芍 5 降香 2 0012 檀香 2 全蝎 7 蝉蜕。
13、 7 蜈蚣 1 冰片 5 酸枣仁 ( 炒 )5 ； 0013 或 ： 0014 人参 10 水蛭 8 土鳖虫 7 乳香 ( 制 )2 赤芍 5 降香 2 0015 檀香 2 全蝎 9 蝉蜕 7 蜈蚣 1 冰片 5 酸枣仁 ( 炒 )5 ； 0016 或 ： 0017 人参 6 水蛭 11 土鳖虫 7 乳香 ( 制 )2 赤芍 5 降香 2 0018 檀香 2 全蝎 3 蝉蜕 7 蜈蚣 1 冰片 5 酸枣仁 ( 炒 )5 ； 0019 更优选地， 上述中药组合物的活性成分由下列成分组成 ： 0020 a 平均粒径小于 100m 的全蝎、 水蛭、 蜈蚣、 土鳖虫、 蝉蜕及制乳香药粉 ； 0021 。
14、b 冰片药粉 ； 0022 c 由降香和檀香提取的挥发油 ； 0023 d 人参用乙醇提取后的醇提液经浓缩后的醇提浸膏 ； 0024 e 提取成分 c 后的降香和檀香药渣的水提液、 赤芍和炒酸枣仁加水煎煮后的水提 液以及提取成分 d 后的人参药渣的水提液过滤、 混匀后浓缩成的水提浸膏。 0025 本发明还公开了含有上述中药组合物作为活性组分的药物制剂为胶囊剂、 片剂、 丸剂、 口服液、 软胶囊或滴丸剂。 0026 本发明的另一目的是提供上述中药组合物在制备抑制糖尿病肾病患者血管紧张 素 II 作用的药物中的应用。 0027 本发明的另一目的是提供上述中药组合物在制备治疗糖尿病肾病的药物中的应 。
15、用。 0028 本发明中药组合物中， 作为活性组分的原料药的拉丁名及其加工方法来自 中药 大辞典 (1977 年 7 月， 第一版， 上海科学技术出版社 ) 和 中国药典 (2005 年版， 化学工业 出版社 )。 0029 本发明中药组合物还可以按常规的制剂工艺， 例如， 范碧亭 中药药剂学 ( 上海科 学出版社 1997 年 12 月第 1 版 ) 记载的制备工艺， 制成药剂学可接受的任意常规剂型， 例如 胶囊剂、 片剂、 丸剂、 口服液、 软胶囊、 滴丸等。 0030 本发明的应用中， 所述中药组合物为胶囊剂、 片剂、 丸剂、 口服液、 软胶囊、 滴丸制 剂中的一种， 为使上述剂型能够实。
16、现， 需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料， 例如 ： 填充剂、 崩解剂、 润滑剂、 助悬剂、 粘合剂、 甜味剂、 矫味剂、 防腐剂、 基质等。填充剂包括 ： 淀 说 明 书 CN 101254242 B 4 3/8 页 5 粉、 预胶化淀粉、 乳糖、 甘露醇、 甲壳素、 微晶纤维素、 蔗糖等 ； 崩解剂包括 ： 淀粉、 预胶化淀 粉、 微晶纤维素、 羧甲基淀粉钠、 交联聚乙烯吡咯烷酮、 低取代羟丙纤维素、 交联羧甲基纤维 素钠等 ； 润滑剂包括 ： 硬脂酸镁、 十二烷基硫酸钠、 滑石粉、 二氧化硅等 ； 助悬剂包括 ： 聚乙 烯吡咯烷酮、 微晶纤维素、 蔗糖、 琼脂、 羟丙基甲基纤维素等 。
17、； 粘合剂包括， 淀粉浆、 聚乙烯吡 咯烷酮、 羟丙基甲基纤维素等 ； 甜味剂包括 ： 糖精钠、 阿斯帕坦、 蔗糖、 甜蜜素、 甘草次酸等 ； 矫味剂包括 ： 甜味剂及各种香精 ； 防腐剂包括 ： 尼泊金类、 苯甲酸、 苯甲酸钠、 山梨酸及其盐 类、 苯扎溴铵、 醋酸氯乙定、 桉叶油等 ； 基质包括 ： PEG6000， PEG4000， 虫蜡等。为使上述剂型 能够实现中药药剂学， 需在制备这些剂型时加入药学可接受的其它辅料 ( 范碧亭 中药药 剂学 ， 上海科学出版社 1997 年 12 月第 1 版中各剂型记载的辅料 )。 0031 本发明制剂优选通过以下制备方法制成 ： 将上述配比的水蛭。
18、、 全蝎、 蝉蜕、 土鳖虫、 蜈蚣等五味药洗净， 低温烘干， 备用 ； 檀香、 降香提取挥发油， 药渣及水溶液备用 ； 人参用 70乙醇加热回流提取二次， 第一次 3 小时， 第二次 2 小时， 合并提取液， 回收乙醇至无醇 味 ； 人参药渣与檀香、 降香的药渣以水溶液合并， 加入赤芍、 酸枣仁 ( 炒 )， 加水煎煮二次， 第 一次3小时， 第二次2小时， 合并煎液， 滤过， 滤液浓缩至相对密度为1.20-1.25(60)的清 膏， 加入上述人参醇提液， 混匀， 低温干燥， 粉碎成细粉 ； 乳香 ( 制 ) 与水蛭等五味共粉碎成 细粉 ； 冰片研细， 分别与上述细粉配研， 混匀， 喷入挥发油。
19、， 混匀， 装入胶囊， 即得。 0032 或者， 本发明制剂优选通过以下制备方法制成 ： 0033 a)原料药的重量比为 ： 人参3-10份、 水蛭3-11份、 土鳖虫5-10份、 制乳香1-5份、 赤芍 3-9 份、 降香 1-5 份、 檀香 1-5 份、 全蝎 3-9 份、 蝉蜕 3-12 份、 蜈蚣 1-3 份、 冰片 1-7 份、 炒酸枣仁 3-10 份 ； 0034 b) 药材粉碎工艺 ： 0035 将全蝎、 水蛭、 蜈蚣、 土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、 水洗处理后和净选炮制后的 制乳香按处方配料， 由粉碎机进行粉碎， 药粉细度达到 80 目以上 ； 粗粉后的药粉经各种超 微粉碎技术。
20、进行超微粉碎， 使药粉平均粒径小于 100m ； 待粉碎的药材经清洗烘干灭菌 后， 配料 ； 0036 c) 提取浓缩和干燥工艺 ： 0037 降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取， 赤芍和酸枣仁加水煎煮， 水提液过 滤后， 待浓缩成浸膏 ； 人参用乙醇提取后， 再用水提取， 醇提液回收乙醇后， 浓缩成醇提浸 膏， 水提液过滤与所有的水提液混匀后浓缩成水提浸膏 ； 0038 d) 制剂工艺 ： 0039 在沸腾制粒干燥机中加入超微粉碎粉， 再将步骤 c) 所得提取浸膏喷入制粒 ； 将制 成的颗粒经整粒， 加入冰片细粉， 喷入由降香和檀香提取的挥发油， 混匀后由胶囊充填机充 填， 制成胶囊。 。
21、0040 或者， 本发明制剂优选通过以下制备方法制成 ： 0041 a) 原料药的重量比为 ： 人参 3-10 份、 水蛭 3-11 份、 土鳖虫 5-10 份、 乳香 ( 制 )1-5 份、 赤芍 3-9 份、 降香 1-5 份、 檀香 1-5 份、 全蝎 3-9 份、 蝉蜕 3-12 份、 蜈蚣 1-3 份、 冰片 1-7 份、 炒酸枣仁 3-10 份 ； 0042 b) 药材粉碎工艺 ： 0043 将全蝎、 水蛭、 蜈蚣、 土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、 水洗处理后和净选炮制后的 说 明 书 CN 101254242 B 5 4/8 页 6 制乳香按处方配料， 由粉碎机进行粉碎， 药粉细度。
22、达到 80 目以上 ； 粗粉后的药粉经各种超 微粉碎技术进行超微粉碎， 使药粉平均粒径小于 100m ； 待粉碎的药材经清洗烘干灭菌 后， 配料 ； 0044 c) 提取浓缩和干燥工艺 ： 0045 降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取， 赤芍和酸枣仁加水煎煮， 水提液过 滤后， 待浓缩成浸膏 ； 人参用乙醇提取后， 再用水提取， 醇提液回收乙醇后， 浓缩成醇提浸 膏， 水提液过滤与所有的水提液混匀后浓缩成水提浸膏， 将浸膏直接喷雾干燥成喷雾粉 ； 0046 d) 制剂工艺 ： 0047 将超微粉碎粉与步骤 c) 所得喷雾干燥粉一起加到沸腾制粒干燥机中， 再喷溶媒 制成颗粒 ； 将制成的颗粒。
23、经整粒， 加入冰片细粉， 喷入由降香和檀香提取的挥发油， 混匀后 由胶囊充填机充填， 制成胶囊。 0048 本发明药物的用量， 按原料药总重量计， 为每次0.8-3克， 每日服用2-4次， 优选为 每次 1.11-2.22 克， 每日服用三次。 具体实施方式 0049 实施例 1 ： 本发明药物的制备 0050 a) 原料药配方为 ： 0051 人参 39.6g 水蛭 72.6g 土鳖虫 46.2g 乳香 ( 制 ) 13.2g 0052 赤芍 33g 降香 13.2g 檀香 13.2g 全蝎 19.8g 0053 蝉蜕 46.2g 蜈蚣 6.6g 冰片 33g 酸枣仁 ( 炒 )33g 00。
24、54 b) 药材粉碎工艺 ： 0055 将全蝎、 水蛭、 蜈蚣、 土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、 水洗处理后和净选炮制后的 制乳香按处方配料， 由粉碎机进行粉碎， 药粉细度达到 80 目以上 ； 粗粉后的药粉经各种超 微粉碎技术进行超微粉碎， 使药粉平均粒径小于 30-40m ； 待粉碎的药材经清洗烘干灭菌 后， 配料 ； 0056 c) 提取浓缩和干燥工艺 ： 0057 降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取， 赤芍和酸枣仁加适量水煎煮二次， 每次 3 小时， 合并水煎液， 水提液过滤后， 待浓缩成浸膏 ； 人参用适量 70的乙醇提取二次， 每次3小时， 合并提取液， 回收乙醇至无醇味， 再用。
25、水提取， 醇提液浓缩成相对密度为0.9 1.1(60 ) 醇提浸膏， 水提液过滤与上述所有水提液混匀后浓缩至相对密度为 0.9 1.1(60 ) 的清膏， 备用 ； 0058 d) 制剂工艺 ： 0059 在沸腾制粒干燥机中加入超微粉碎粉， 再将步骤 c) 所得提取浸膏喷入制粒 ； 将制 成的颗粒经整粒， 加入冰片细粉， 喷入由降香和檀香提取的挥发油， 混匀后由胶囊充填机充 填， 制成 1000 粒胶囊。 0060 本发明药物的用量， 为每次 2-4 粒， 每日服用三次。 0061 实验例 本发明药物对糖尿病大鼠肾组织血管紧张素水平及其受体的影响 0062 1 材料与方法 0063 1.1 材。
26、料 说 明 书 CN 101254242 B 6 5/8 页 7 0064 1.1.1实验动物 健康雄性SD大鼠(中国人民解放军第二军医大学实验动物中心 提供 )， 重 190 215g， 大鼠自由进水和摄食， 清洁级适应性饲养 5 天。 0065 1.1.2 实验仪器强生稳豪血糖仪， 购自美国强生公司 ； 实时荧光定量 PCR 仪 (DNA Engine OpticonTM)， 购自美国 MJ Research 公司。 0066 1.1.3 主要试剂 (1) 本发明药物 ： 河北以岭医药股份有限公司提供 ； (2)AI、 AII 放免试剂盒 ： 北京北方生物技术研究所生产 ； (3) 肾组织。
27、血管紧张素 II 受体 1 型 (AT1aR) mRNA和2型(AT2R)PCR引物 ： 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 ； (4)链脲佐菌霉 素(STZ) ： 美国Sigma公司生产， 产品批号046K1206 ； (5)诺和灵N胰岛素 ： 丹麦诺和诺德有 限公司生产， 产品批号 RVG0462。 0067 1.2 方法 0068 1.2.1 糖尿病动物模型的建立及分组 0069 大鼠 46 只随机分为二组 ： 糖尿病模型组 (n 35) 和正常对照组 (NC 组， n 11)。 糖尿病模型组以链脲佐菌霉素 (STZ， 购自 Sigma 公司， 10mg/ml， 溶于 PH 4.5，。
28、 0.1mmol/ L 柠檬酸缓冲液 ) 一次性腹腔注射 (60mg/kg) 诱发， 3 天后尾静脉采血测定末梢血糖， 以血 糖 16.7mmol/L 者定为糖尿病造模成功。NC 组腹腔注射相同体积的 0.1mmol/L 柠檬酸缓 冲液。将造模成功的大鼠适应性饲养 3 天后， 再随机分组 ： (1) 糖尿病本发明药物小剂量治 疗组 (DM+TL1 组， n 11) ： 本发明药物直接溶于蒸馏水， 0.5g/kg/d， 每天早上 9 ： 00AM-10 ： 00AM 一次性灌胃。(2) 糖尿病本发明药物大剂量治疗组 (DM+TL2 组， n 11) ： 本发明药物 直接溶于蒸馏水， 1.0g/k。
29、g/d， 每天早上 9 ： 00AM-10 ： 00AM 一次性灌胃。(3) 糖尿病未治疗组 (DM 组， n 13)， 在饲养过程中死亡 2 只， 与 (4) 正常对照组 (NC 组， n 11) 均以同一时间 同等剂量蒸馏水一次灌胃。为避免糖尿病大鼠血糖过高发生酮症死亡， 根据每周 2 次尾静 脉采血测血糖注射 2-4U 诺和灵 N， 自由饮水和摄食。所有组每周 2 次尾静脉采血糖， 每周 1 次测体重。糖尿病成模后治疗 10 周后处死。在饲养过程中， DM+TL2 组因灌胃不当死亡 1 只。DM 组死亡 2 只， 1 只为相互撕咬致死， 另外 1 只为处死时可能麻醉剂过量。 0070 1。
30、.2.2 组织及血浆标本处理 0071 大鼠处死前一天禁水禁食一天， 称取体重后按 300mg/kg 腹腔注射 10水合氯醛 麻醉， 麻醉后大鼠腹主动脉取尽动脉血处死大鼠， 用 4等渗盐水灌注双肾后迅速取出肾 脏， 0.4 DEPC 水冲洗干净后滤纸吸干水分， 去肾包膜后分别称重并记录。取血后每 ml 血 用 0.3M EDTA 20ul， 0.32M 二巯基丙醇 10ul， 8- 羟基喹林硫酸盐 20ul 抗凝摇匀。4冰箱 保存 1-2 小时取出后 2500 转 / 分， 离心 7 分钟 (4 )， 取上清放入低温冰箱保存 (-20 )。 ( 按北京北方生物技术研究所 AI 和 A II 试。
31、剂盒要求处理 )。取左肾组织去掉包膜及肾门 部血管， 切成100mg大小分管快速液氮冷冻后-70冰箱保存。 取冻存肾组织约100mg滤纸 吸干水分后称重后加入 0.1mmol/L 的醋酸煮沸 10 分钟冰浴迅速冷却， 匀浆 (14000rpm10 秒 3 次 )， 4离心 (10000rpm20 分钟 )， 方法同温绍君、 汪家瑞、 何士大等 大鼠老化过程 中心肌局部血管紧张素的研究 ( 中华心血管病杂志， 1990， 18(2) ： 91-93) 所述， 取上清液 置于 -20冰箱保存备用。 0072 1.2.3 血浆和肾组织 Ang I 和 Ang II 检测 0073 取冻存全部血浆标本。
32、及组织均浆标本严格按照北京北方生物技术研究所 AI、 A II 放免试剂盒说明书冰浴下检测血浆和肾组织匀浆 Ang I 和 Ang II 水平。所有标本均同批 说 明 书 CN 101254242 B 7 6/8 页 8 检测。 0074 1.2.4 AT1aRmRNA 和 AT2RmRNA 引物设计与合成 0075 设定 GAPDH 为内标， 从 Genbank 中检索出大鼠 GAPDH、 AT1aR、 AT2R 基因 cDNA 序列， 并设计各基因引物。 0076 大鼠 GAPDH 上游引物 ： 5 -GTTCAACGGCACAGTCAAGG-3 ； 0077 下游引物 ： 5 -CACC。
33、AGTGGATGCAGGGAT-3 ； 扩增产物 473bp。 0078 大鼠 AT1aR 上游引物 ： 5 -ATTCGTGGCTTGAGTCCTGTTC-3 ； 0079 下游引物 ： 5 -TCTTGGATTCTTTTGATACCATCTTC-3 ； 扩增产物 286bp。 0080 大鼠 AT2R 上游引物 ： 5 -GGAAGAACAGAATTACCCGTGAC-3 ； 0081 下游引物 ： 5 -AACCATTGCTAGGCTGATTACA-3 ； 扩增产物 399bp。 0082 1.2.5 RNA 的抽提 ： 将组织样品从液氮中取出， 迅速加入 1ml 总 RNA 提取试剂 。
34、(trizol)， 匀浆使组织裂解， 转移到1.5ml焦碳酸二乙脂(DEPC)处理的无菌离心管中， 加入 400ul 氯仿， 剧烈震荡混匀， 低温 12000rpm 离心 10min 转移上清至另一离心管中， 加入等体 积氯仿 ： 异戊醇 (24 ： 1)， 剧烈震荡混匀， 低温 12000rpm 离心 10min 转移上清至另一离心管 中， 加入等体积氯仿 ： 异戊醇(24 ： 1)， 剧烈震荡混匀， 室低温12000rpm离心10min转移上清 至另一离心管中， 加入等体积异丙醇， 震荡混匀， 室温放置 2min， 低温 12000rpm 离心 10min 轻轻移弃上清， 防止吸去沉淀， 。
35、加入1ml70乙醇， 悬浮沉淀， 低温12000rpm离心10min并重 复1次-轻轻移弃上清， 防止吸去沉淀， 低温12000rpm离心1min， 用移液器吸干残余酒精， 使酒精挥发， 加入 100ul DEPC 处理的灭菌水， 溶解 RNA- 电泳察看 RNA 的浓度和完整性。 0083 1.2.6 RNA 的逆转录 0084 2g RNA， 1l 寡核苷酸引物， 0.5l 核糖核酸抑制剂， 补灭菌水至终体积 10l， 72水浴 2min， 迅速冰浴 2min， 离心收集混合液至管底， 每个反应管中顺序加入以 下试剂 2l 10X 缓冲液， 1l 三磷酸脱氧核苷 (dNTP) 混合物 (1。
36、0mM each)， 0.5l 核 糖核酸酶抑制剂， 5.5l 无菌水， 1l MMLV 反转录酶 (100U/l)， 42空气浴孵育 1.5hr， 95 5min。 0085 1.2.7 荧光定量 PCR ： 0086 PCR 扩增 30l 体系 ： 1l 第一链产物， 3l10X 缓冲液， 1l dNTP， 0.6l， 引物 血管紧张素II受体1型(AT1aR)(25pmol/l)， 0.6l引物血管紧张素II受体2型(AT2R) (25pmol/l)， 0.3l 荧光染料探计 (SYBR)， 1l 栖热水生菌 (Taq)， 22.5l 无菌水， 置 实时荧光定量 PCR 仪进行反应。反应。
37、参数为 94变性 30s， 55退火 30s， 72延伸 30s， 共 40 个循环， 72延伸 10min。产物 16保存。PCR 结果以测定样本基因及内标基因的 CT 值 表示， CT 值为目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数。以 CT 表示目标基因和内标 基因 CT 值的差异， 以 2- CT表示 AT1aR mRNA 和 AT2R mRNA 的基因表达量。 0087 1.2.8 统计学方法 0088 采用 SPSS12.0 软件系统进行统计学分析。各指标以 xs 表示， 显著性分析采用 单因素方差分析和组间均数比较 t 检验。方差不齐参数比较采用卡方检验。 0089 2 结果 009。
38、0 2.1 大鼠肾重 / 体重的改变 0091 所有糖尿病大鼠体重均较NC组明显减轻， 血糖明显升高(与NC组比较P0.001)。 说 明 书 CN 101254242 B 8 7/8 页 9 这种体重的减轻在 DM+TL2 组较 DM 组稍有改善 (DM 组比较 P0.05)， 而 DM+TL1 组与 DM 组间 体重无显著差异 ； 本发明药物各治疗组与 DM 组血糖水平无明显差异。在 DM 组肾重相对增 加， 其肾重/体重比在糖尿病大鼠均较NC组有不同程度的增加(与NC组比较P0.001)， 经 本发明药物干预后 DM+TL1 组和 DM+TL2 组肾重 / 体重比均较 DM 组有不同程度。
39、的降低 ( 与 DM 组比较 P0.001)， 这种改善在 DM+TL2 组更为明显， 但各治疗组间并无明显差异 ( 见表 1)。 0092 表 1 ： 糖尿病大鼠肾脏和肾重 / 体重改变 (xs) 0093 0094 DM+TL1 为本发明药物小剂量治疗组， DM+TL2 为本发明药物大剂量治疗组， NC 为正 常组， DM 为糖尿病肾病模型组， *P0.001， *P0.01， *P0.05 与 DM 组比较 ； #P0.001， #P0.01， #P0.05 与 NC 组比较 0095 2.1 大鼠血浆和肾组织 Ang I、 Ang II 水平变化 0096 在所有糖尿病大鼠可见血浆和肾。
40、组织 AngI 和 Ang II 水平均明显升高 ( 与 NC 组 比较 P0.001)， 经本发明药物干预后在 DM+TL1 组和 DM+TL2 组血浆和肾组织 Ang I 和 Ang II 水平均较 DM 组有不同程度的下降， 这种下降在 DM+TL2 组更显著 ( 组间差异 P0.001)， 但 DM+TL1 组和 DM+TL1 组血浆和肾组织 AngI 和 AngII 水平均未降低到正常水平 ( 见表 2)。 0097 表 2 大鼠血浆和肾组织血管紧张素水平改变 (xs) 0098 说 明 书 CN 101254242 B 9 8/8 页 10 0099 DM+TL1 为本发明药物小剂。
41、量治疗组， DM+TL2 为本发明药物大剂量治疗组， NC 为正 常组， DM 为糖尿病肾病模型组， *P0.001， *P0.01， *P0.05 与 DM 组比较 ； #P0.001， #P0.01， #P0.05 与 NC 组比较 0100 2.2 大鼠肾组织 AT1aR mRNA、 AT2R mRNA 表达及 AT1aR/AT2R 改变 0101 DM 组大鼠肾组织 AT1aR mRNA、 AT2R mRNA 表达均较 NC 组显著增加 ( 分别较 NC 组增加约 39.0 倍和 4.4 倍， P 值均 0.001) ； AT1aR/AT2R 比值在 DM 组较 NC 组明显升高 (P。
42、0.001)。DM+TL1 组和 DM+TL2 组肾组织 AT1aR mRNA、 AT2R mRNA 表达较 DM 组显著降低 (P 值均 0.001)， 且 DM+TL2 组较 DM+TL1 组肾组织 AT1aR mRNA、 AT2R mRNA 水平降低更显著 ( 组间差异 P0.001)。DM+TL1 组和 DM+TL2 组肾组织 AT1aR/AT2R 比值较 DM 组降低 ( 分别 P0.001， P0.05)， 这种下降在 DM+TL1 组较 DM+TL2 组明显， 但组间差异无统计学意义 ( 见 表 3)。 0102 表 3 ： 大鼠肾组织 AT1aR mRNA、 AT2R mRNA。
43、 表达改变及 AT1aR/AT2R 改变 (xs) 0103 0104 DM+TL1 为本发明药物小剂量治疗组， DM+TL2 为本发明药物大剂量治疗组， NC 为正 常组， DM 为糖尿病肾病模型组， *P0.001， *P0.01， *P0.05 与 DM 组比较 ； #P0.001， #P0.01， #P0.05 与 NC 组比较 0105 3 结论 0106 本研究显示在 DM 组大鼠肾脏 AT1aR mRNA、 AT2R mRNA 表达均明显上调， 在糖尿病 肾脏虽然显示局部组织 AT2R mRNA 表达增加， 但远不及 AT1aR mRNA 增加明显 (AT1aR mRNA 和 A。
44、T2R mRNA 分别较 NC 组增加 39.0 倍和 4.4 倍 )， 提示在糖尿病大鼠肾脏 RAS 激活， 肾脏 局部组织 Ang II 增加， AT1R 和 AT2R 表达失衡， AT1R 上调， 并可能部分通过上调 AT2R 来对 抗一部分因 AT1R 上调所引起的病理作用， 这或许是糖尿病病理状态下的一种保护性机制， 但 AT1aR/AT2R 比值在糖尿病的明显升高， 提示增加的 Ang II 主要通过其 1 型受体上调导 致糖尿病肾损伤。 0107 我们的研究显示本发明药物能不同程度抑制实验性糖尿病大鼠血浆、 肾组织 Ang I、 Ang II 水平的升高， 逆转实验性糖尿病大鼠肾组织 AT1aR 的 mRNA、 AT2R 的 mRNA 表达的 上调和 AT1aR/AT2R 比值的增加， 并能逆转肾重 / 体重比在糖尿病大鼠的增加， 而血糖并无 明显改变， 提示本发明药物能抑制实验性糖尿病大鼠肾素 - 血管紧张素系统激活， 起到延 缓和改善糖尿病肾病的作用， 且这种作用不依赖于血糖的改变。 说 明 书 CN 101254242 B 10 。