基因修饰以表达自杀基因的骨髓间充质干细胞在制造用于治疗癌症的药物中的用途.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101272798 B (45)授权公告日 2012.01.04 CN 101272798 B *CN101272798B* (21)申请号 200680035727.7 (22)申请日 2006.09.29 10-2005-0091155 2005.09.29 KR A61K 48/00(2006.01) (73)专利权人 徐海荣 地址 韩国京畿道 (72)发明人 徐海荣 张多荣 金性洙 柳承完 李永敦 (74)专利代理机构 北京信慧永光知识产权代理 有限责任公司 11290 代理人 梁兴龙 王维玉 US 6464983 B1,2002.10.15, US 6905。

2、678 B2,2005.06.14, WO 9937332 A1,1999.07.29, US 5486359 A,1996.01.23, 朱克毅等 . 自杀基因治疗肿瘤的新进展 . 国 外医学遗传学分册 .2001, 第 24 卷 ( 第 2 期 ),64-67. (54) 发明名称 基因修饰以表达自杀基因的骨髓间充质干细 胞在制造用于治疗癌症的药物中的用途 (57) 摘要 通过将抗癌剂的前药选择性地转化为癌症周 围的抗癌剂， 表达自杀基因的骨髓间充质干细胞 对癌组织显示出优异的和高度选择性的抗癌作 用。 还公开了一种用于治疗癌症的药物组合物， 其 包括骨髓间充质干细胞 ； 一种用于治疗癌症。

3、的试 剂盒， 其包括含有自杀基因的表达载体、 骨髓间充 质干细胞和前药 ； 以及一种用于治疗癌症患者的 方法， 包括相继给予患者骨髓间充质干细胞和前 药。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2008.03.27 (86)PCT申请的申请数据 PCT/KR2006/003928 2006.09.29 (87)PCT申请的公布数据 WO2007/037653 EN 2007.04.05 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李岚 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 2 页 附图 6 页 CN 10127。

4、2798 B1/1 页 2 1. 一种用于治疗脑癌的药物组合物， 所述药物组合物包括表达自杀基因的骨髓间充质 干细胞。 2. 如权利要求 1 所述的药物组合物， 其中所述自杀基因是编码胞嘧啶脱氨酶或单纯疱 疹 1 型胸苷激酶的基因。 3. 如权利要求 1 所述的药物组合物， 其中用含有所述自杀基因的逆转录病毒载体转染 所述骨髓间充质干细胞。 4. 如权利要求 1 所述的药物组合物， 其中通过将所述自杀基因引入到骨髓间充质干细 胞中， 并在适宜条件下选择和扩增所得的骨髓间充质干细胞， 得到所述表达自杀基因的骨 髓间充质干细胞 ； 或通过增殖骨髓间充质干细胞， 将所述自杀基因引入到所述增殖的骨髓 。

5、间充质干细胞中， 并采集所得的骨髓间充质干细胞， 得到所述表达自杀基因的骨髓间充质 干细胞。 5. 一种用于治疗脑癌的试剂盒， 所述试剂盒包括含有自杀基因的表达载体、 骨髓间充 质干细胞和抗癌剂的前药。 6. 如权利要求 5 所述的试剂盒， 其中所述自杀基因是编码胞嘧啶脱氨酶的基因。 7. 如权利要求 5 所述的试剂盒， 其中所述表达载体是逆转录病毒载体。 8. 如权利要求 5 所述的试剂盒， 其中以用含有所述自杀基因的表达载体转染的骨髓间 充质干细胞的形式或用表达所述自杀基因的病毒转导的骨髓间充质干细胞的形式提供所 述含有自杀基因的表达载体和所述骨髓间充质干细胞。 9. 表达自杀基因的骨髓间。

6、充质干细胞在制造用于治疗脑癌的药物中的用途。 权 利 要 求 书 CN 101272798 B1/9 页 3 基因修饰以表达自杀基因的骨髓间充质干细胞在制造用于 治疗癌症的药物中的用途 技术领域 0001 本发明涉及一种用于治疗癌症的药物组合物和试剂盒， 所述药物组合物和试剂盒 含有表达自杀基因的骨髓间充质干细胞。 背景技术 0002 脑胶质母细胞瘤由于其转移到其他位置而成为最难医治的癌症之一， 并且目前没 有有效的治疗方法。在多数情况下不能安全地进行常规的脑瘤切除， 并且由于阻碍药物渗 透进入脑实质的血脑屏障 (BBB) 的原因， 也不能有效地使用抗癌药物进行化疗。 0003 此外， 当涉及。

7、一些小肿瘤时， 通过引入工程病毒使抗癌基因直接输送进入肿瘤细 胞来治疗脑胶质母细胞瘤的基因疗法也是无效的。而且， 反复注射病毒会引起严重的免疫 排斥。 0004 据 近 期 报 导，神 经 干 细 胞 (Aboody 等 人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 97， 12846-12851(2000) ； Brown 等人， Human Gene Therapy， 14， 1777-1785(2003) ； Tang 等人， Human Gene Therapy， 14， 1247-1254， (2003) 和 Zhang 等人， Gene Therapy， 23， 281-2。

8、87(2004) 和 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 (Nakamura 等 人， Gene Therapy， 11， 1155-1164(2004) 和 Zhang 等人， NeuroImage， 23， 281-287(2004) 对脑胶质母细胞瘤显示 嗜性， 因此已试图利用所述干细胞作为基因载体。 0005 例如， 据报导， 表达胞嘧啶脱氨酶 (CD) 的神经干细胞 (E.coli 的自杀基因 ) 的使 用在脑胶质母细胞瘤的治疗中显示出极好的抗癌作用 (Aboody 等人， 同上 ； 以及 Brown 等 人， 同上)。 然而， 因为必须从流产胎儿脑组织分离和培养神经干细胞， 所以极难得。

9、到神经干 细胞。因此， 上述实验使用致癌基因的永生化细胞系， 这会诱发癌症和免疫排斥。 0006 据报导， 将表达白细胞介素 -2(IL-2) 的骨髓间充质干细胞 (MSC) 注射 进大鼠脑 胶质瘤模型中增大了抗肿瘤作用并延长了带肿瘤大鼠的存活率(Nakamura等人， 同上)。 然 而， 上述方法的问题是免疫细胞很难穿过血脑屏障， 并且许多癌细胞常常不会受到免疫系 统的显著影响。 0007 因此， 已需要开发新的治疗剂和方法， 它们能特异地靶向肿瘤细胞而不伤害非肿 瘤细胞， 并且没有免疫毒性， 从而可以反复给予治疗剂。 0008 MSC 是能分化为诸如成骨细胞、 软骨细胞、 脂肪细胞和肌细胞。

10、等中胚层谱系细胞的 多潜能骨髓基质细胞。 MSC还可以在保持其未分化状态下容易地增殖， 这样由于其对肿瘤细 胞的嗜性而适于输送针对脑胶质母细胞瘤的抗癌剂。 0009 自杀基因能将无毒的前药转化为相应的抗癌药。 例如， CD能将5-氟胞嘧啶(5-FC) 转化为细胞毒性的抗癌剂 5- 氟尿嘧啶 (5-FU)， 而且分泌的 5-FU 杀死临近细胞， 这称为 “旁 观者效应” 。 0010 直接给予 5-FU 会引起细胞毒性并导致不利副作用， 但是以特定方式联合使用自 杀基因和 5-FC 则有可能在肿瘤细胞周围选择性地产生 5-FU(Bourbeau 等人， The Journal 说 明 书 CN 。

11、101272798 B2/9 页 4 of Gene Medicine， 6， 1320-1332(2004)。 0011 本发明者已努力开发使用 MSC 的安全而有效的抗癌剂 ； 并且已发现当将表达自杀 基因的MSC移植到脑癌动物模型的脑中， 随后给予抗癌剂的前药时， 可以有效地治疗脑瘤。 发明内容 0012 因此， 本发明的目的是提供一种治疗癌症的组合物， 所述组合物显示出对癌组织 的高靶向效率、 对正常细胞无毒性并且没有免疫毒性， 从而可以反复给予。 0013 本发明的另一个目的是提供一种用于治疗癌症的试剂盒， 所述试剂盒包括所述组 合物和抗癌剂的前药。 0014 本发明的另一个目的是提。

12、供一种通过使用所述组合物或试剂盒治疗受试者中的 癌症的方法。 0015 根据本发明的一个方面， 提供一种用于治疗癌症的药物组合物， 所 述药物组合物 包括表达自杀基因的骨髓间充质干细胞。 0016 根据本发明的另一个方面， 提供一种用于治疗癌症的试剂盒， 所述试剂盒包括含 有自杀基因的表达载体、 骨髓间充质干细胞和抗癌剂的前药。 0017 根据本发明的另一个方面， 提供一种用于治疗需要治疗癌症的受试者中的癌症的 方法， 所述方法包括给予所述受试者表达自杀基因的骨髓间充质干细胞， 随后给予抗癌剂 的前药。 附图说明 0018 从以下结合附图的发明说明中， 可以更清楚本发明的上述和其他目的以及特征。

13、， 附图分别示出 ： 0019 图 1 ： 从人骨髓分离的骨髓间充质干细胞 (MSC) 在体外培养 1 天、 2 天、 3 天和 7 天 后的光学显微照片 ； 0020 图 2 ： 显示多潜能 MSC 的照片 (A ： 用油溶红 O(oil red-O) 染色的脂肪细胞 ； B ： 用 阿利新蓝 (alcian blue) 染色的软骨细胞 ； C ： 成骨细胞内碱性磷酸酶的活性 ； D ： 用冯库萨 (von Kossa) 染色的成骨细胞 ) ； 0021 图 3 ： 含有作为自杀基因的 E.coli 胞嘧啶脱氨酶 (CD) 基因的逆转录病毒载体的 构建 ； 0022 图4A至图4C ： 显示。

14、293T细胞内CD表达的图和照片(A ： 将3H胞嘧啶转化为3H 尿嘧啶的被表达的CD的活性 ； B ： 表达CD的293T细胞根据作为5-FU前药的5-FC的浓度变 化的细胞死亡 ； C ： 在 1,000M 0023 5-FC 存在下培养的 293T 和 293T/CD 细胞的光学显微照片 ) ； 0024 图 5A 和图 5B ： 显示 293T/CD 细胞的旁观者效应的照片和图 ( 图 5A ： 在 1,000M 5-FC 存在下与 C6/LacZ 脑胶质瘤细胞共培养后， 293T 和 293T/CD 细胞的相对比显微照片， 以及用 X-gal 染色后的光学显微照片 ( 放大倍数 ： 。

15、100) ； 图 5B ： 显示 293T 和 293T/CD 细 胞内 - 半乳糖苷酶 (-gal) 活性随 5-FC 浓度变化的图 ) ； 0025 图 6A 和图 6B ： 显示经用 5-FC 处理后， MSC 和用含有 CD 基因的 逆转录病毒载体 转染的MSC(MSC/CD)的细胞死亡的照片和图(图6A ： 光学显微照片 ； 图6B ： MTT分析结果的 说 明 书 CN 101272798 B3/9 页 5 图 ) ； 0026 图 7A 至图 7C ： 显示 MSC/CD 细胞的旁观者效应的照片和图 ( 图 7A ： 在 1,000M 5-FC 存在下与 C6/LacZ 脑胶质瘤。

16、细胞共培养后， MSC 和 MSC/CD 细胞的相对比显微照片， 以 及用 X-gal 染色后的光学显微照片 ( 放大倍数 ： 100) ； 图 7B ： 显示在 -gal 检测中 C6/ LacZ 细胞存活率的图 ； 图 7C ： 全细胞的解剖显微照片和数字显微照片 ) ； 0027 图 8A 和图 8B ： 显示在 MSC 和 MSC/CD 细胞内前药 5-FC 转化为 5-FU 的 HPLC 分析 结果 ( 图 8A ： MSC 和 MSC/CD 细胞的 HPLC 色谱图 ； 图 8B ： 显示 5-FU 的检测量的图 ) ； 0028 图 9 ： 显示 C6、 U373 和 U87 脑。

17、胶质瘤细胞系的细胞死亡率随 5-FU 浓度变化的图 ； 0029 图10 ： 显示MSC对脑胶质瘤嗜性的结果(A ： 显示在一个脑半球中移植的MSC/LacZ 迁移到对侧的带脑胶质瘤的脑半球的示意图 ； B ： 显示 MSC/LacZ 迁移到带脑胶质瘤的脑半 球的脑组织切片的显微照片 ； C和D ： 显示在脑胶质瘤边缘处MSC/LacZ细胞分布分别在100 和 200 放大倍数时的显微照片 ) ； 0030 图 11 ： 显示表达 CD 的 MSC 抗癌作用的 MRI 图像 ； 以及 0031 图 12 ： 脑瘤大鼠模型的脑切片的 X-gal 染色结果， 显示了表达 CD 的 MSC 的抗癌作。

18、 用。 具体实施方式 0032 本发明使用的自杀基因可以是将无毒的抗癌剂的前药转化为有毒的抗癌剂的前 药激活酶。示例性的自杀基因包括编码单纯疱疹 1 型胸苷激酶 (HSV-TK) 和胞嘧啶脱氨酶 (CD) 的基因。HSV-TK 将无毒的丙氧鸟苷 (GCV) 转化为有毒的磷酸化代谢物， CD 将无毒的 5- 氟胞嘧啶 (5-FC) 转化为有毒的 5- 氟尿嘧啶 (5-FU)。CD 基因优选用于基因疗法， 因为 5-FU 显示强旁观者效应。 0033 根据将基因引入到细胞内的任何公知的方法， 通过使用包括基因的 病毒载体， 优 选使用逆转录病毒载体， 可将自杀基因引入到骨髓间充质干细胞 (MSC)。

19、 中。例如， 通过将自 杀基因引入到逆转录病毒载体内而得到表达载体， 用表达载体转染包装细胞， 在适宜的培 养条件下培养转染细胞， 过滤培养基得到逆转录病毒溶液， 并用逆转录病毒溶液转染 MSC， 可将自杀基因引入到骨髓间充质干细胞内。然后， 通过使用逆转录病毒载体含有的选择标 记可得到持续表达自杀基因的 MSC。 0034 通过将自杀基因引入到干细胞中， 并在适宜条件下选择、 扩增所得的干细胞， 可在 体外大量生产表达自杀基因的骨髓间充质干细胞 ； 或通过充分增殖干细胞， 将自杀基因引 入到增殖的干细胞中， 并采集所得的干细胞， 可在体外大量生产表达自杀基因的骨髓间充 质干细胞。 0035 。

20、能用于本发明的干细胞可以从包括人在内的任何哺乳动物的骨髓、 外周血或脐带 血分离， 优选从人骨髓分离。 0036 包括表达自杀基因的骨髓间充质干细胞的本发明组合物可用于癌症治疗。 示例性 的癌症包括脑癌、 乳腺癌、 肝癌、 胰腺癌、 结肠直肠癌和肺癌， 但不限于此。 0037 本发明的组合物还可包括药物可接受的赋形剂、 载体或稀释剂。 优选地， 可将所述 组合物配制成适于注射进入组织或器官的注射剂。 0038 所述组合物还可包括润滑剂、 调味剂、 乳化剂、 防腐剂等。 说 明 书 CN 101272798 B4/9 页 6 0039 根据本领域公知的常规方法， 例如 Bjorklund 和 S。

21、tenevi(Brain Res.， 177， 555-560(1979) 和 Lindvall 等人 (Arch.Neurol.， 46， 615-31(1989) 公开的临床方法， 可 将本发明的组合物注射进入患者身体。 0040 实际给予的本发明的骨髓间充质干细胞的单位剂量应该依据各种相关因素而定， 包括待治疗的疾病、 患者症状的严重程度、 选择的给药途径以及患者自身的年龄、 性别和体 重。 0041 此外， 本发明还提供用于治疗癌症的试剂盒， 所述试剂盒包括含有自杀基因的表 达载体、 骨髓间充质干细胞和抗癌剂的前药。 0042 在本发明的试剂盒中， 可以单独提供含有自杀基因的表达载体和。

22、骨髓间充质干细 胞， 或者以用含有自杀基因的表达载体转染的骨髓间充质 干细胞的形式或用表达自杀基 因的病毒转导的骨髓间充质干细胞的形式提供。优选通过将自杀基因引入到病毒载体内， 优选引入到逆转录病毒载体内， 来制备表达载体。 0043 本发明在其范围内还包括用于治疗患有癌症的受试者的方法， 所述方法包括给予 所述受试者治疗有效量的表达自杀基因的骨髓间充质干细胞， 随后给予抗癌剂的前药。 0044 当从患者自己的骨髓或从与患者有同型 HLA( 人白细胞抗原 ) 的其他人的骨髓得 到骨髓间充质干细胞时， 使用本发明组合物可使基因疗法中的免疫排斥最低。 因此， 为彻底 防止癌症复发， 可以反复给予本。

23、发明的组合物。 而且， 在基因疗法中使用骨髓间充质干细胞 的优点在于， 无需使用致癌基因就可以容易地培养并得到足以用于移植到患者中的大量骨 髓间充质干细胞。 0045 此外， 本发明的组合物可用于治疗免疫监视未发现的癌症， 因为其作用不依赖于 免疫应答的改进。 0046 因此， 可以单独使用本发明的组合物或与治疗癌症的其他治疗联用， 特别是针对 难治疗的癌症。 0047 经注射后， 本发明组合物中的骨髓间充质干细胞显示对癌组织的嗜性。 因此， 通过 将表达自杀基因的骨髓间充质干细胞特异性地运送到癌组织， 然后给予待由自杀基因激活 的抗癌剂的前药以使抗癌剂只在癌组织周围产生， 则可使对正常细胞的。

24、不利副作用最低。 而且， 表达自杀基因的骨髓间充质干细胞对没有直接引入自杀基因的周围癌细胞显示旁观 者效应， 因此增强了其抗癌作用。 0048 以下实施例意图对本发明作进一步解释， 而不限制其范围。 0049 此外， 以下对于固体混合物中的固体、 液体中的液体、 液体中的固体所给出的百分 比分别按 wt/wt、 vol/vol 和 wt/vol 计， 并且除非另有具体说明外， 所有反应均在室温下进 行。 0050 实施例 1 ： 人骨髓间充质干细胞 (hMSC) 的分离和培养 0051 ( 步骤 1) 骨髓的提取和骨髓间充质干细胞的分离 0052 将 4ml HISTOPAQUE 1077(S。

25、igma， U.S.A.) 和 4ml 从骨髓库 (KoreanMarrow Donor Program， KMDP) 得到的骨髓加到经灭菌的 15ml 试管中。在 400g 下离心 30 分钟后， 收集 界面上的 0.5ml 淡黄色覆层并转移到含有 10ml 经灭菌的磷酸盐缓冲盐溶液的试管中。将 所得悬浮液在 250g 下离心 10 分钟除去上清液， 并加入 10ml 磷酸盐缓冲溶液得到悬浮 液， 在 250g 下离心 10 分钟。重复上述步骤两次并将含有 10 FBS(Gibco) 的 DMEM 培养 说 明 书 CN 101272798 B5/9 页 7 基 (Gibco， U.S.A.。

26、) 加到所得沉淀中。将所得溶液相当于 1107个细胞的那部分溶液置于 100mm 皿中并在 37下培养 4 小时， 同时供给 5 CO2和 95空气。然后除去上清液并加 入新培养基继续培养。 0053 ( 步骤 2)hMSC 的培养和传代培养 0054 使用 MSC 培养基 (10 FBS(Gibco)+10ng/ml bFGF(Sigma)+1青霉素 / 链霉素 (Gibco)+89 DMEM(Gibco) 在保持于 37的 CO2培养箱中培养步骤 1 所得的 hMSC。每 隔 2 天更换培养基进行连续培养。当细胞达到 80融合时， 用 0.25胰蛋白酶 /0.1mM EDTA(Gibco)。

27、收集细胞并用培养基稀释20倍， 然后， 在新皿中传代培养。 将所得的剩余细胞 在含有10DMSO(Sigma)的培养基中冷冻。 图1显示从人骨髓分离的骨髓间充质干细胞在 体外培养 1 天、 2 天、 3 天和 7 天后的光学显微照片。( 步骤 3)hMSC 的多分化潜能 0055 以下检验 hMSC 体外分化为脂肪细胞、 软骨细胞和成骨细胞的潜能。 0056 (1)hMSC 的成脂分化 0057 在 MSC 培养基中培养 hMSC， 随后在成脂分化诱导培养基 ( 补充 1M 地塞米松 (Sigma)、 0.5mM 甲基异丁基黄嘌呤 (Sigma)、 10g/ml 胰岛素 (Gibco)、 10。

28、0nM 吲哚美辛 (Sigma) 和 10 FBS(Gibco) 的 DMEM 培养基 (Gibco) 中培养 48 小时。随后在成脂维持培 养基 ( 含有 10g/ml 胰岛素和 10 FBS 的 DMEM 培养基 ) 中培养所得的混合物 1 周， 并用 油溶红 O 染色。如图 2 所示， 用油溶红 O 染色的脂肪细胞在细胞内部明显 ( 图 2， A)。此结 果表明 hMSC 可以成功地分化为脂肪细胞。 0058 (2)hMSC 的成软骨分化 0059 在 MSC 培养基中培养 hMSC。用胰蛋白酶收集 2105个细胞， 离心， 然后， 在 0.5ml 无血清成软骨分化诱导培养基 ( 含有 。

29、0.5ml100ITS(0.5mg/ml 牛胰岛素、 0.5mg/ml 人 铁传递蛋白、 0.5g/ml 硒酸钠 (Sigma) 和 10ng/ml TGF-1(Sigma) 的 50ml 高葡萄糖 DMEM(Gibco) 中再培养 3 周， 同时每 3 天更换培养基。然后用 4多聚甲醛固定细胞群， 用 切片机切片， 然后， 用阿利新蓝染色。如图 2 所示， 细胞外软骨基质被染成蓝色并且观察到 在软骨陷窝中存在软骨细胞 ( 图 2， B)。这些结果表明 hMSC 分化为软骨细胞。 0060 (3)hMSC 的成骨分化 0061 在MSC培养基中培养hMSC， 随后在0.5ml成骨分化诱导培养基。

30、(补充10mM -磷 酸甘油 (Sigma)、 0.2mM 抗坏血酸 -2- 磷酸酯 (Sigma)、 10nM 地塞米松 (Sigma) 和 10 FBS(Gibco) 的 DMEM) 中培养 2 周， 同时每 3 天更换培养基。然后用 4多聚甲醛固定细胞， 分别用碱性磷酸酶染色和使用冯库萨法染色。如图 2 所示， 碱性磷酸酶活性的增加和羟磷 灰石形式的钙矿物质的细胞外聚集表明 hMSC 分化为成骨细胞 ( 图 2， C 和 D)。 0062 实施例 2 ： 表达胞嘧啶脱氨酶的逆转录病毒载体的构建 0063 ( 步骤 1) 胞嘧啶脱氨酶的克隆 0064 以E.coli K12 MG1655的。

31、基因组DNA(ATCC 700926， Korea ResearchInstitute of Bioscience and Biotechnology)为模板通过PCR反应克隆胞嘧啶脱氨酶(CD)基因。 用寡 核苷酸CD-F(5-GAA TTC AGG CTA GCA ATGTCT CGA ATA ACG CTT TAC AAA C-3： SEQ ID NO ： 1) 和 CD-R(5 -GGATTC TCT AGC TGG CAG ACA GCC GC-3 ； SEQ ID NO ： 2) 在 94、 5 分钟 ； 94、 30 秒， 60、 40 秒和 72、 1 分钟的 27 个循环 ；。

32、 72、 7 分钟的条件下进行 PCR。 用 pGEM-T Easy 载体克隆试剂盒 (Promega) 克隆 PCR 产物， 并用 X-gal 和 IPTG 通过蓝白斑 说 明 书 CN 101272798 B6/9 页 8 克隆筛选分离含有 CD 基因的载体 pGEM-T-CD。通过使用 SEQ ID NO ： 3(5 -CAT ACG ATT TAG GTGACA CTA TAG-3)和SEQ ID NO ： 4(5-ACC GGG AAA CAC CTA TTGTG-3)的寡 核苷酸对载体 pGEM-T-CD 进行序列分析， 验证 CD 基因 (gi298594)。 0065 ( 步骤。

33、 2) 表达胞嘧啶脱氨酶的逆转录病毒载体的构建 0066 用 EcoRI(Roche， Germany) 和 NotI(Roche) 从载体 pGEM-T-CD 中分离 CD cDNA， 并用 T4DNA 连接酶 (Roche) 将其插到载体 pcDNA3.1(Clontech， U.S.A.) 的 EcoRI 位点和 NotI 位点中。用所得的载体转化 E.coliDH5， 并在含有 50g/ml 氨比西林的 LB 平板中 培养和筛选所得的转化体， 得到 pcDNA3.1/CD。用 BamHI(Roche) 从 pcDNA3.1/CD 中分离 CDcDNA， 并用 T4DNA 连接酶 (Ro。

34、che) 将其插到逆转录病毒载体 pMSCV-puro(Clontech) 的 BglII(Roche) 位点中。所得的被指定为 pMSCV-puro/CD 的构建示于图 3。 0067 ( 步骤 3) 逆转录病毒的制备 0068 用磷酸钙共沉淀法 Jordan， Nucleic Acid Research， 24， 569-601(1996) 将 pMSCV-puro/CD 载体转染为逆转录病毒包装细胞系 PA317(ATCCCRL-9078) 或 PG13(ATCC CRL-10686)， 并在 37、 5 CO2的条件下培养细胞。48 小时后， 收集培养液， 用 0.45M 尼 龙膜过滤。

35、， 得到逆转录病毒溶液。将逆转录病毒溶液在 -70下保存直至使用。 0069 实施例 3 ： CD 表达在 293T 细胞中的验证 0070 ( 步骤 1) 胞嘧啶脱氨酶活性的量化 0071 根据磷酸钙共沉淀法将pMSCV-puro/CD转染为293T细胞(ATCCCRL-11268)中。 转 染 48h 后， 在含有嘌呤霉素 (4g/ml， Sigma， U.S.A.) 的选择培养基中使细胞在 2 周内以 1 10 分裂。在磷酸盐缓冲盐溶液中采集生长的细胞， 在乙醇的干冰中冷冻 2 分钟， 然后 在 37下解冻 5 分钟， 重复 5 次使细胞裂解。通过在 4和 12,000rpm 下离心细胞。

36、裂解物 5 分钟得到上清液， 用 Bradford 法 (Anal Biochem， 72 ： 248-254， 1976) 量化蛋白浓度。将 10l 中的 10g 蛋白与 5l 的 3mM6-3H 胞嘧啶 (0.14mCi/mmol， Moravek， USA) 混合并 在 37下培养 1h。通过加入 345l 的 1M 乙酸终止反应。使用 SCX Bond 洗脱柱 (Varian， U.S.A)， 用 1ml 的 1M 乙酸漂洗， 洗脱混合物， 并用液体闪烁计数器测定生成的 6-3H 尿嘧 啶。 pMSCV-puro转化的293T细胞用作此实验中的阴性对照。 如图4A所示， 用pMSCV-。

37、puro/ CD转化的293T实验组比阴性对照组高4倍。 此结果显示pMSCV-puro/CD被功能性地表达。 0072 ( 步骤 2)CD 基因在 293T 细胞中的自杀作用 0073 将正常 293T 细胞和步骤 1 中制备的用 pMSCV-puro/CD 转化的 293T/CD 细胞以 2,000个细胞/孔的密度在含有10胎牛血清的DMEM的24孔板中铺板。 24小时后， 将5-FC 以不同浓度 (0-10mM) 加到细胞内。1 周内每 2 天用含有 5-FC 的新鲜培养基更换培养基。 如图 4C 所示， 根据相对比显微镜测定， 在 1,000M 5-FC 存在下， 293T/CD 的存。

38、活率降低。 通过使用溴化 3-(4， 5- 二甲基 - 噻唑 -2- 基 )-2， 5- 二苯基四唑盐 (MTT) 检测法测定线粒 体 NADPH 活性来估计存活率。在 200l 的 25mg/ml MTT(Sigma， U.S.A) 的 PBS 中培养细胞 4 小时。用 200l 无水二甲基亚砜 (DMSO， Sigma) 更换溶液。在室温下培养 15 分钟后， 用 ELISA 读数机 (Molecular Probe， U.S.A) 测定 540nm 下的吸光度。相对于在没有 5-FC 存 在下生长的细胞的数据， 图 4B 中的数据表示为 3 个独立实验的平均值 S.E.。从 10M 的 。

39、5-FC 开始检测 293T/CD 的细胞死亡， 其中 IC50为 296M。与其相对照， 在 1,000M 5-FC 存在下， 293T 细胞没有显示出细胞死亡。 说 明 书 CN 101272798 B7/9 页 9 0074 ( 步骤 3)293T/CD 细胞的体外旁观者效应 0075 在 6 孔板中， 将 3103个 / 孔的 293T/CD 和 293T 细胞分别与 3103 个 C6/LacZ 脑胶质瘤细胞(ATCC CRL2199)共培养。 C6/LacZ细胞最初通过用E.coli LacZ基因转化C6 脑胶质瘤细胞得到， 并用于测定293T/CD细胞的旁观者效应。 24小时后，。

40、 将所示浓度的5-FC 加到细胞内。1 周内每 2 天用含有 5-FC 的新鲜培养基更换培养基。对培养液进行 X-gal 染色或 - 半乳糖苷酶 (-gal) 检测。对于 X-gal 染色， 用 0.00625戊二醛 (Merck， U.S.A.) 固定细胞 10min， 用 PBS 漂洗 3 次， 并在 2mM MgCl2、 5mM 亚铁氰化钾 / 铁氰化钾和 1mg/ml X-gal(Koma， Korea) 中培养 8 小时。如图 5A 所示， 与亲代 293T 细胞共培养的 C6/ LacZ细胞在数量上有所增加并且用X-gal染成蓝色。 与其相对照， 当与293T/CD共培养时， 在 。

41、1,000M5-FC 存在下， 由于 293T/CD 的旁观者效应， C6/LacZ 细胞死亡。 0076 通过用测定LacZ基因产物(-半乳糖苷酶)的残余酶活性的-gal检测法进一 步证实C6/LacZ细胞的存活率。 采集细胞并在1passive裂解缓冲溶液(Promega， U.S.A.) 中裂解。在 37下， 于 300l 的 0.88mg/mlONPG(Sigma)、 1mM MgCl2和 0.1M 磷酸盐缓冲溶 液 (pH 7.4) 中培养 10g 细胞裂解物的蛋白约 30 分钟。通过加入 500L 的 1M Na2CO3终 止反应并在 420nm 下测定混合物的吸光度。图 5B 示。

42、出相对于未处理细胞的相对比率。与 图 5A 显示的结果相一致， 在 -gal 检测中， 5-FC 没有改变与 293T 共培养的 C6/LacZ。与 其相对照， 在 100-1,000M 5-FC 存在下， 通过与 293T/CD 共培养， C6/LacZ 细胞的 - 半 乳糖苷酶活性降低。此数据表明， 在 5-FC 存在下， 由于旁观者效应， 与 293T/CD 的共培养诱 发临近 C6/LacZ 细胞的细胞死亡。 0077 实施例 4 ： 表达胞嘧啶脱氨酶的 hMSC 的制备 0078 ( 步骤 1) 将 CD 基因引入到 hMSC 中 0079 表达CD的逆转录病毒用于将CD基因运送到M。

43、SC。 将实施例1步骤1中所得的MSC 在 37和 5 CO2下， 于生长培养基 ( 含有 10 FBS、 100 单位 /ml 青霉素和 100g/ml 链 霉素的 DMEM) 中生长， 直至 70融合。将实施例 2 中制备的表达 CD 的逆转录病毒以 1 1 的稀释比加到培养基中， 在8g/ml聚凝胺(polybrene)(Sigma)存在下在生长培养基中培 养 8 小时， 并在新鲜生长培养基中培养 16 小时。在逆转录病毒转导重复 2 次以上后， 细胞 在含有 4g/ml 嘌呤霉素 (Sigma) 的生长培养基中在 14 天内分以 1 3 分裂。将存活的 细胞汇集 (pooled)， 并。

44、用于随后的实验中。 0080 ( 步骤 2)CD 基因在 MSC/CD 细胞中的自杀作用 0081 在与 5-FC 接触的前一天， 将 MSC/CD 或 MSC 细胞以 5,000 个细胞 / 孔的密度在 6 孔板中的生长培养基上铺板。 2周内每2天用含有0-10mM5-FC的新鲜生长培养基更换培养 基。如图 6A 所示， 用 1,000M 5-FC 处理 2 周后 MSC/CD 细胞几乎死亡。如以上对 293T/CD 细胞所述的那样， 通过使用 MTT 检测法测定线粒体 NADPH 活性来估计存活率。相对于未处 理细胞的数据， 将数据表示为 3 个独立实验中的平均值 S.E.( 图 6B)。。

45、从 100M 的 5-FC 开始检测MSC/CD的细胞死亡， 其中IC50332M。 与其相对照， 直至高达1,000M 5-FC， MSC 没有显示出细胞死亡。 0082 ( 步骤 3) 表达 CD 基因的 MSC 的体外旁观者效应 0083 在 6 孔板中， 将 1104个 / 孔的 MSC/CD 和 MSC 细胞分别与 3103 个 C6/LacZ 脑 胶质瘤细胞在生长培养基中共培养。 24小时后， 将5-FC加到细胞内， 终浓度为1-1,000M， 说 明 书 CN 101272798 B8/9 页 10 并且 1 周内每 2 天更换培养基。如以上对 293T/CD 细胞所述的那样， 。

46、对剩余细胞进行 X-gal 染色 ( 图 7A 和图 7C) 或 - 半乳糖苷酶检测 ( 图 7B)。在 1000M 5-FC 存在下， MSC/CD 细胞诱发 C6/LacZ 的细胞死亡， 而 MSC 不改变 C6/LacZ 细胞下降的增殖 ( 图 7A 和图 7C)。 因此， C6/LacZ 细胞在与 MSC/CD 共培养时， 其集落形成频率以剂量依赖方式下降 ( 图 7C)。 此数据表明， 在 5-FC 存在下， MSC/CD 细胞对 C6/LacZ 细胞起到旁观者效应。 0084 通过-gal检测法进一步验证C6/LacZ细胞的存活率， 通过此检测法可间接量化 存活的细胞。使用 10g。

47、 细胞裂解物的蛋白， 以类似于以上对 293T/CD 细胞所述的方式进 行检测。420nm 下的吸光度表示为相对于未处理细胞的相对比率。如图 7B 所示， 当细胞与 MSC/CD 细胞共培养时， - 半乳糖苷酶活性在 C6/LacZ 细胞内以浓度依赖方式急剧下降。 与其相对照， - 半乳糖苷酶活性在与正常 MSC 共培养的 C6/LacZ 细胞内未改变。再次地， 在 5-FC 存在下， MSC/CD 细胞对 C6/LacZ 细胞起到旁观者效应。 0085 ( 步骤 4) 通过 MSC/CD 验证 5-FC 向 5-FU 的转化 0086 将 MSC 细胞和 MSC/CD 细胞以 1104个细胞。

48、 / 孔的密度在 12 孔板中铺板， 并在 1,000M 5-FC 存在下培养 3 天。用 500l 乙酸乙酯异丙醇 ： 0.5mol/L 乙酸 (84151(v/v/v)和0.3g 5-溴尿嘧啶(5-BU， Aldrich， U.S.A.)提取50l培养基。 在用真空蒸发仪将有机馏分在 4下干燥 90 分钟后， 在 H2O 甲醇 (4 1) 的 500l 混合 物中重构成小球。 用Xterra TMRP185m C-18柱(4.6150mm， Waters， U.S.A)进行HPLC。 使用由 40mMKH2PO4构成并用 10 KOH 调节到 pH 7.0 的等度流动相以 0.6ml/min 的流速进 行等度洗脱。5-FC 和 5-FU 在 3.1min 和 3.9min 洗脱出来。作为内标的 5-BU 在 10.2min 洗 脱出来 ( 图 8A)。如图 8B 所示， MSC/CD 将 1,000M 5-FC 转化为 2.67M 5-FU， 而 MSC 不 能产生任何 5-FU。结果显示， 5-FC 向 5-FU 的转化对 CD 基因具有特异性。 0087 实施例 5 ： 通过 MSC/CD 生成的 5-FU 对各种脑胶质瘤细胞系的细胞毒性作用的验 证 0088 为验证 MSC/CD 生成的 。