技术领域
本发明涉及预防猪鼻支原体感染细胞的方法及制剂，具体地涉及针对猪鼻支原体通 过其表面的膜蛋白P37的氨基端22个氨基酸片段与细胞膜蛋白Annexin A2相互作用感 染细胞这一发现、而提供的针对猪鼻支原体膜蛋白P37或宿主细胞膜蛋白Annexin A2 的拮抗剂在制备预防猪鼻支原体感染细胞或促细胞迁移的制剂中的应用，以及预防猪鼻 支原体感染细胞或促细胞迁移的方法。
背景技术
支原体属于原核生物中的柔膜体纲，是自然界存在的、能独立复制的最小微生物， 其大小约为0.1m，能透过微孔滤膜，存在于宿主细胞的膜表面或内吞到胞内(Lo SC. Mycoplasmas and AIDS.In:Maniloff J,McElheney,RN,Finch LR,Baseman JB,editors. Mycoplasmas:molecular biology and pathogenesis.Washington,DC:Am Soc Microbiol Press；1992.p.525-45)。值得注意的是，越来越多的实验数据提示支原体的持续性慢性 感染与肿瘤的发生发展有一定的相关性(Namiki K,Goodison S,Porvasnik S,et al.(2009) Persistent Exposure to Mycoplasma Induces Malignant Transformation of Human Prostate Cells.PLoS ONE 4,e6872；Urbanek C,Goodison S,Chang M,et al.(2011)Detection of antibodies directed at M.hyorhinis p37 in the serum of men with newly diagnosed prostate cancer.BMC Cancer 11,233；Yang H,Qu LK,Ma HC,et al.(2010)Mycoplasma hyorhinis infection in gastric carcinoma and its effects on the malignant phenotypes of gastric cancer cells.BMC Gastroenterol 10,132)。早在1965年，Paton等报道口腔支原体可引起人类二 倍体细胞株WI38的染色体异常，并诱导其发生细胞转化(Paton GR,Jacobs JP,Perkins FT. (1965)Chromosome changes in human Diploid-cell cultures infected with mycoplasmas. Nature 207,43-45)。1986年,H.Kotani等发现非凡螺原体可使鼠NIH3T3细胞及猴肾 CV21细胞发生恶性转化(Kotani H,Phillips D,McGarrity GJ.Malignant transformation of NIH-3T3 and CV-1 cells by a helical mycoplasma,Spiroplasma mirum,strain SMCA.(1986) In Vitro Cell Dev Biol 22,756-762)。引起研究者更多兴趣的是Tsai等的研究工作，他们 用发酵支原体及穿透支原体感染小鼠胚胎细胞系C3H10T1/2，在感染11周后细胞出现 恶性改变，在感染18周之后细胞可在软琼脂上形成集落，在裸鼠体内成瘤(Tsai S,Wear DJ,Shih JW,et al.Mycoplasmas and oncogenesis:persistent infection and multistage malignant transformation.(1995)Proc Natl Acad Sci USA 92,10197-10201)。2009年Namiki 等人研究发现生殖支原体或猪鼻支原体的持续感染可以增加前列腺增生上皮细胞 BPH-1的迁移和侵袭能力，引起细胞核型异常，并可在裸鼠体内成瘤(Namiki K, Goodison S,Porvasnik S,et al.(2009)Persistent Exposure to Mycoplasma Induces Malignant Transformation of Human Prostate Cells.PLoS ONE 4,e6872)。这些研究均说明支原体感 染与肿瘤的发生发展有密切的关系。
发明人所在的实验室在上世纪八十年代通过采用肿瘤细胞免疫，制备获得了鼠源性 的抗肿瘤单克隆抗体PD4(Dong ZW,Wan WH,Li ZF,et al.A monoclonal antibodies PD4 against gastric cancer cell line MGC803.(1985)Shengwu Huaxue Zazhi 2,52-58)，但后续的 抗原鉴定工作却发现单抗PD4对应的抗原并非来自于肿瘤细胞，而是来自于猪鼻支原 体，提示猪鼻支原体可能和肿瘤相关。2001年，发明人所在的实验室黄甦等人采用PD4， 通过免疫组织化学染色的方法对包括胃癌及肠癌组织在内的600例组织样本进行检测， 结果显示该抗体与胃癌组织的阳性反应率为56％，而相应的非肿瘤组织阳性率分别为： 慢性浅表型胃炎:28％，胃良性溃疡：30％，肠上皮：37％(Huang S,Li JY,Wu J,et al. Mycoplasma infections in different human carcinomas.(2001)World J Gastroenterol 7, 266-269)。由此可见，胃癌与胃良性疾患的猪鼻支原体感染率有显著的差异，胃癌组明 显高于胃良性疾病各组，并且，随着疾病的加重，猪鼻支原体的感染率也随之增加。这 些结果提示猪鼻支原体的感染可能和疾病以及肿瘤的发生发展存在一定相关性。此外， 来自第四军医大学的曹军等人亦利用同样的方法检测了95例肾癌组织中的猪鼻支原体 感染情况，发现64.2％的组织中存在猪鼻支原体感染，而对猪鼻支原体膜表面蛋白p40 蛋白在不同病理类型肾癌组织中的表达分析结果表明，猪鼻支原体感染与人类肾癌的病 理类型不存在某种相关性(曹军,李建平,程伟,等.猪鼻支原体P40蛋白在肾癌组织中 的表达及意义.(2008)西安交通大学学报(医学版)29,556-558)。2010年，杨华等人 用PD4对61例胃癌组织样本和109例卵巢癌组织标本进行了免疫组织化学染色分析， 结果发现，61例胃癌标本中猪鼻支原体感染率为45.9％，猪鼻支原体感染与胃癌的淋巴 结转移、Lauren分型和TNM分期呈正相关(Yang H,Qu LK,Ma HC,et al.(2010) Mycoplasma hyorhinis infection in gastric carcinoma and its effects on the malignant phenotypes of gastric cancer cells.BMC Gastroenterol 10,132)；109例卵巢癌标本中猪鼻 支原体感染率为43.1％(47/109)。
既然肿瘤组织中有较高的猪鼻支原体感染率，那么，猪鼻支原体感染与肿瘤发生发 展之间的关系如何？2009年，Namiki等报道了猪鼻支原体慢性感染可以诱导前列腺良 性增生细胞BPH发生染色体核型异常，最终导致其恶性转化(Namiki K,Goodison S, Porvasnik S,et al.(2009)Persistent Exposure to Mycoplasma Induces Malignant Transformation of Human Prostate Cells.PLoS ONE 4,e6872)。猪鼻支原体可以增强肿瘤 细胞系的侵润并抑制细胞的接触抑制(Elkind E,Rechnitzer H,Vaisid T,et al.Mycoplasma hyorhinis upregulates calpastatin and inhibits calpain-dependent proteolysis in SH-SY5Y neuroblastoma cells.(2010)FEMS Microbiol Lett 304,62-68)。发明人所在实验室的研究发 现，猪鼻支原体感染的胃癌细胞MGC803在软琼脂中形成集落的能力远远大于无支原体 感染的细胞(Yang H,Qu LK,Ma HC,et al.(2010)Mycoplasma hyorhinis infection in gastric carcinoma and its effects on the malignant phenotypes of gastric cancer cells.BMC Gastroenterol 10,132)。此外，多项研究显示猪鼻支原体可以增强肿瘤细胞的体外迁移和 侵袭能力。
以上临床标本的检测及实验室的相关研究结果均提示，猪鼻支原体感染和肿瘤的发 生发展有密切的关系。但对猪鼻支原体感染细胞的分子机制尚不明确，故缺乏特异性预 防猪鼻支原体感染细胞的方法。
发明内容
本发明的一个目的在于对猪鼻支原体感染细胞的分子机制进行研究，提供一种特异 性预防猪鼻支原体感染细胞的方法。
本发明的另一目的在于提供一种预防猪鼻支原体感染细胞或促细胞迁移的制剂。
本发明的另一目的在于提供针对猪鼻支原体膜蛋白P37或宿主细胞膜蛋白Annexin A2的拮抗剂在制备预防猪鼻支原体感染细胞或促细胞迁移的制剂中的应用。
本案发明人通过对猪鼻支原体感染细胞的分子机制研究，发现猪鼻支原体感染哺乳 动物细胞依赖于其表面膜蛋白p37，具体而言是猪鼻支原体通过其表面的膜蛋白P37的 氨基端多肽(更具体而言是膜蛋白P37的氨基端第2-23位氨基酸序列)与细胞膜蛋白 Annexin A2(更具体而言是其氨基端多肽，例如第2-26位氨基酸序列)的相互作用感染 细胞。
在此研究结果的基础上，本发明提供了一种预防抗猪鼻支原体感染细胞的方法，其 包括采用针对猪鼻支原体膜蛋白P37的拮抗剂抑制猪鼻支原体与细胞结合。由于拮抗剂 (例如蛋白、核酸、碳水化合物)可以与膜蛋白P37结合并抑制或封闭膜蛋白P37的生 物活性，从而可以用于防止猪鼻支原体与细胞结合而感染细胞。例如，可以用抗猪鼻支 原体P37蛋白的抗体，它与猪鼻支原体P37蛋白的结合可通过封闭作用抑制猪鼻支原体 感染细胞。在本发明的一具体实施方案中，发明人通过实验证实，抗p37抗体不仅可以 阻断猪鼻支原体感染细胞，也可以阻断猪鼻支原体所引起的细胞迁移能力增强。
基于上述研究结果，本发明还提供了另外一种预防猪鼻支原体感染细胞的方法，其 包括采用针对宿主细胞膜蛋白Annexin A2的拮抗剂抑制猪鼻支原体与细胞结合。类似 的，由于拮抗剂(例如蛋白、核酸、碳水化合物)可以与蛋白Annexin A2结合并抑制 或封闭蛋白Annexin A2的生物活性，从而可以用于防止猪鼻支原体与细胞结合而感染 细胞。
例如，可以用抗Annexin A2的抗体封闭宿主细胞上与可与猪鼻支原体结合的分子 Annexin A2，使猪鼻支原体的P37蛋白不能与其结合，进而可以抑制猪鼻支原体感染细 胞。在本发明的一具体实施方案中，发明人通过实验证实，抗Annexin A2抗体处理细 胞后猪鼻支原体与细胞的结合显著减少，可以明显阻断猪鼻支原体感染细胞。
再如，可以采用小分子RNA干扰Annexin A2的表达，使细胞不表达或减少Annexin A2的表达，进而可以抑制猪鼻支原体感染细胞。在本发明的一具体实施方案中，发明 人通过实验证实，用小分子RNA干扰Annexin A2表达后猪鼻支原体感染细胞及促进细 胞迁移的能力明显下降。
又如，还可以采用p37的氨基端多肽，例如，包含P37蛋白氨基端22个氨基酸片 段LKKLKNFILFSSIFSPIAFAIS(SEQ ID No.1，P37蛋白氨基端第2-23位氨基酸序列) 的多肽，使其通过与宿主细胞膜蛋白Annexin A2的结合，从而竞争性抑制猪鼻支原体 与细胞的结合，进而预防猪鼻支原体感染细胞。在本发明的一具体实施方案中，发明人 通过实验证实，原核重组表达的氨基端多肽融合蛋白(GST-p37-2-23)可以和胃癌细胞 系结合；把氨基端多肽直接标记荧光素FITC(FITC-p37-2-23)后得到的FITC-p37-2-23 也可以直接和细胞结合；此外，合成的p37-2-23多肽也可呈浓度梯度依赖性地阻断猪鼻 支原体和胃癌细胞AGS的结合。
此外，还可以采用Annexin A2的氨基端多肽，例如，包含Annexin A2蛋白氨基端 25个氨基酸片段STVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGS(SEQ ID No.2，Annexin A2蛋白 氨基端第2-26位氨基酸序列)的多肽，使其通过与猪皮支原体膜蛋白P37的结合，从 而竞争性抑制猪鼻支原体与宿主细胞的结合，进而预防猪鼻支原体感染细胞。在本发明 的一具体实施方案中，发明人通过定量PCR实验验证了Annexin A2氨基端2至25位氨 基酸的多肽可通过竞争性结合阻断猪鼻支原体同细胞Annexin A2的结合，可以有效阻 断支原体的感染。
本发明中，所述的“针对猪鼻支原体膜蛋白P37的拮抗剂”是指与P37结合并抑制或 封闭P37的生物活性的物质，可以是蛋白、核酸或碳水化合物等。其中所述的“生物活 性”是指P37与宿主细胞结合的生物活性，特别是指与宿主细胞膜蛋白Annexin A2结合 的生物活性。
本发明中，所述的“针对宿主细胞膜蛋白Annexin A2的拮抗剂”是指与Annexin A2 结合并抑制或封闭Annexin A2的生物活性的物质，可以是蛋白、核酸或碳水化合物等。 其中所述的“生物活性”是指Annexin A2与猪鼻支原体结合的生物活性，特别是指与猪鼻 支原体膜蛋白P37结合的生物活性。
本发明中，所述“结合”是指猪鼻支原体与细胞的相互作用并在此基础上感染细胞。 发明人发现猪鼻支原体能够通过其表面的膜蛋白P37，具体地说是通过P37蛋白氨基端 的第2至23位氨基酸的多肽片段，与细胞膜蛋白Annexin A2的结合，具体地说是通过 与Annexin A2蛋白氨基端的第2至26位氨基酸多肽片段的结合，进而实现猪鼻支原体 与细胞的结合并感染细胞。根据这一发现，不管是采用P37或Annexin A2的单抗或多 抗封闭相应的抗原，还是采用P37或Annexin A2氨基端的多肽以竞争抑制P37蛋白与 Annexin A2的结合，还是通过敲除细胞Annexin A2的表达，凡是能够阻断P37蛋白与 Annexin A2的结合，都可以实现预防猪鼻支原体感染细胞并促进细胞迁移的目的。
从而，本发明还提供了针对猪鼻支原体膜蛋白P37或宿主细胞膜蛋白Annexin A2 的拮抗剂在制备预防猪鼻支原体感染细胞或促细胞迁移的制剂中的应用。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，针对猪鼻支原体膜蛋白P37的拮抗剂为与 猪鼻支原体膜蛋白P37结合、从而抑制猪鼻支原体与细胞结合的试剂。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，针对猪鼻支原体膜蛋白P37的拮抗剂为与 猪鼻支原体膜蛋白P37氨基端第2-23位氨基酸结合、从而抑制猪鼻支原体与细胞结合 的试剂。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，针对猪鼻支原体膜蛋白P37的拮抗剂为抗 猪鼻支原体膜蛋白P37或其抗原性片段的特异性单克隆抗体或多克隆抗体。这里所述的 “特异性”是指抗体能结合于本发明的P37或其片段，优选那些能与本发明的P37结合但 不识别且不与其它非相关抗原分子结合的抗体。本领域普通技术人员已知，所述的单克 隆抗体或多克隆抗体可以参照现有技术通过P37的全长或其抗原性的片段作为抗原进 行免疫获得。
根据本发明的另一具体实施方案，针对猪鼻支原体膜蛋白P37的拮抗剂为包含宿主 细胞膜蛋白Annexin A2氨基端氨基酸序列(例如Annexin A2氨基端第2-26位氨基酸序 列)的多肽或蛋白。其中，包含Annexin A2蛋白氨基端第2-26位氨基酸序列的多肽或 蛋白，例如可以是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽，也可以是在SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与SEQ ID No.2所示 的氨基酸序列组成的多肽具有相同功能(这里是指与猪鼻支原体膜蛋白P37结合的功 能)的衍生多肽或蛋白。所述多肽或蛋白可不带有或带有重组标签或荧光素等标记物。 本领域普通技术人员已知，这样的多肽或蛋白可以参照现有技术通过原核重组表达融合 蛋白来制备，或者通过化学方法合成来制备。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，针对宿主细胞膜蛋白Annexin A2的拮抗 剂为与Annexin A2结合、从而抑制猪鼻支原体与细胞结合的试剂。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，针对宿主细胞膜蛋白Annexin A2的拮抗 剂为与Annexin A2氨基端第2-26位氨基酸结合、从而抑制猪鼻支原体与细胞结合的试 剂。
在本发明的一具体实施方案中，针对宿主细胞膜蛋白Annexin A2的拮抗剂为针对 Annexin A2或其抗原性片段的特异性单克隆抗体或多克隆抗体。这里所述的“特异性”是指 抗体能结合于本发明的Annexin A2或其片段，优选那些能与本发明的Annexin A2结合 但不识别且不与其它非相关抗原分子结合的抗体。本领域普通技术人员已知，所述的单 克隆抗体或多克隆抗体可以参照现有技术通过Annexin A2的全长或其抗原性的片段作 为抗原进行免疫获得。
在本发明的另一具体实施方案中，针对宿主细胞膜蛋白Annexin A2的拮抗剂为干 扰Annexin A2表达的小分子干扰RNA。优选地，所述小分子干扰RNA具有SEQ ID No. 3所示核苷酸序列。所述小分子干扰RNA可以通过诸如化学合成等现有技术方法来制 备。
在本发明的另一具体实施方案中，针对宿主细胞膜蛋白Annexin A2的拮抗剂为包 含猪鼻支原体膜蛋白P37氨基端氨基酸序列(例如P37氨基端第2-23位氨基酸序列) 的多肽或蛋白。其中，包含P37蛋白氨基端第2-23位氨基酸序列的多肽或蛋白，例如 可以是SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的多肽，也可以是在SEQ ID No.1所示的 氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与SEQ ID No.1所示的氨基酸 序列组成的多肽具有相同功能(这里是指与宿主细胞膜蛋白Annexin A2结合的功能) 的衍生多肽或蛋白。所述多肽或蛋白可不带有或带有重组标签或荧光素等标记物。本领 域普通技术人员已知，这样的多肽或蛋白可以参照现有技术通过原核重组表达融合蛋白 来制备，或者通过化学方法合成来制备。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，抑制猪鼻支原体感染细胞、抑制猪鼻支原 体促进细胞迁移中所说的细胞，可以为胃癌细胞MGC803、胃癌细胞AGS、人肾上皮细 胞293T、人胃粘膜永生化上皮细胞GES-1、非洲绿猴肾细胞COS-7或人脐静脉内皮细 胞(HUVEC)等。
此外，本发明还提供了一种预防猪鼻支原体感染细胞或促细胞迁移的制剂，其包含 针对猪鼻支原体膜蛋白P37或宿主细胞膜蛋白Annexin A2的拮抗剂。所述的针对猪鼻 支原体膜蛋白P37的拮抗剂或针对宿主细胞膜蛋白Annexin A2的拮抗剂如前所述。
综上所述，本发明针对猪鼻支原体通过其表面的膜蛋白P37的氨基端与细胞膜蛋白 Annexin A2氨基端相互作用感染细胞这一发现，提供了新的预防猪鼻支原体感染细胞或 促细胞迁移的方法及相关制剂，可以从阻止或抑制P37与Annexin A2结合的角度预防 猪鼻支原体感染细胞。
附图说明
图1A：显示猪鼻支原体感染胃癌细胞MGC803和AGS且呈时间－浓度梯度依赖性 的细胞ELISA实验结果。
图1B：显示GST-p37与胃癌细胞MGC803和AGS结合呈时间－浓度梯度依赖性 的ELISA实验结果。
图1C：显示抗p37抗体能阻断猪鼻支原体感染293T、GES-1、COS-7和HUVEC 等非肿瘤细胞的PCR检测结果。
图1D：显示抗p37抗体阻断猪鼻支原体和胃癌细胞结合的ELISA实验结果。
图1E：显示抗p37抗体阻断猪鼻支原体和胃癌细胞结合的免疫荧光染色结果。
图1F：显示抗p37抗体可以阻断猪鼻支原体的促胃癌细胞迁移作用的Transwell实 验结果。
图2A：显示支原体p37氨基端多肽融合蛋白GST-p37-2-23能和胃癌细胞MGC803、 AGS结合，并呈时间－浓度梯度依赖性的细胞ELISA结果。
图2B：显示支原体氨基端多肽FITC-p37-2-23可以和胃癌细胞膜表面结合的激光共 聚焦检测结果。
图2C：显示p37氨基端多肽p37-2-23可阻断支原体感染细胞的PCR检测结果。
图3A：MALDI-TOF质谱分析结果显示p37和ANXA2相互作用。
图3B：双向免疫共沉淀实验证实p37和ANXA2的相互作用。
图3C：显示p37和ANXA2存在共定位的激光共聚焦免疫荧光检测结果。
图3D：显示p37的氨基端多肽介导p37和ANXA2的相互作用的GST pull-down检 测结果。
图3E：显示ANXA2的氨基端介导p37和ANXA2相互作用的GST pull-down检测 结果。
图3F：显示GST-p37以及GST-p37-2-23和ANXA2-2-26的相互作用的ELISA实验 结果。
图3G：显示p37的氨基端多肽p37-2-23阻断GST-p37和ANXA2的相互作用的 ELISA实验结果。
图3H:显示ANXA2氨基端2至26位的多肽片段可以阻断猪鼻支原体的感染的定 量PCR检测结果。
图4A：显示抗ANXA2抗体阻断猪鼻支原体与胃癌细胞结合的激光共聚焦免疫荧 光染色实验结果。
图4B：显示抗ANXA2抗体阻断猪鼻支原体感染293T、GES-1、COS-7和HUVEC 等非肿瘤细胞的PCR检测结果。
图4C：显示抗p37抗体可以阻断猪鼻支原体的促胃癌细胞迁移作用的Transwell实 验结果。
图4D：显示ANXA2的RNAi干扰效果的Western Blot检测结果。
图4E：显示干扰ANXA2表达后抑制猪鼻支原体感染细胞的PCR检测结果。
图4F：显示干扰ANXA2后阻断猪鼻支原体和胃癌细胞结合的激光共聚焦免疫荧光 染色检测结果。
图4G：显示干扰ANXA2表达后抑制阻断猪鼻支原体的促胃癌细胞迁移作用的 Transwell实验结果。
图5A：胃癌组织中有猪鼻支原体的感染(p37蛋白免疫组化检测的代表图)。
图5B：胃癌组织猪鼻支原体感染与各种临床病理参数的相关性分析。
图5C：猪鼻支原体感染胃癌患者的生存期短(Kaplan-Meier曲线分析)。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域 的常规条件或按照制造厂商所建议的条件进行。实施例中所用各原始试剂和材料均可商 购获得。
实施例1、猪鼻支原体感染哺乳动物细胞依赖于其表面膜蛋白p37
本实施例中，通过文献报道的常用细胞ELISA实验证实猪鼻支原体和p37蛋白均 可以分别与细胞结合。
细胞ELISA实验即首先将胃癌细胞MGC803和AGS(这些细胞源自中国医学科学 院肿瘤细胞库)接种于96孔板进行培养48小时，然后分别加入1ⅹ103CCU，1ⅹ104CCU，1ⅹ105CCU/mL的猪鼻支原体以感染细胞。感染持续24小时后，用PBS洗三遍， 用0.4％戊二醛室温固定10min，用5％奶粉/PBST室温封闭2h，然后依次常规加入抗 猪鼻支原体抗体、酶标二抗及底物液，最后用ELISA READER测OD492nm。读数越高表 明支原体与细胞的结合越多。结果显示，猪鼻支原体和细胞结合呈浓度梯度依赖性(图 1A)。
接下来，采用上述1ⅹ104CCU/mL的猪鼻支原体分别感染胃癌细胞MGC803和AGS 0、24、48小时，细胞ELISA结果显示猪鼻支原体和细胞结合呈时间梯度依赖性(图 1A)。
另外，用原核细胞重组表达纯化的GST-p37处理胃癌细胞后，发现重组表达的 GST-p37蛋白也可以和胃癌细胞系结合，而且这种结合也呈明显的时间和浓度梯度依赖 性(图1B)。这提示猪鼻支原体感染胃癌细胞很可能是通过其表面膜蛋白p37所介导的。
上述原核细胞重组表达蛋白GST-P37通过常规基因重组、细菌表达及蛋白纯化的 方法获得。简言之，即将通过突变、能在细胞及细菌表达全长P37蛋白的cDNA(见 Wen-Bin Liu,Jian-Zhi Zhang,Bei-Hai Jiang,et al:Lipoprotein p37 from mycoplasma hyorinis inhibiting mammalian cell adhesion J Biomedical.Science 2006 13:323-331) 与原核表达质粒pGEX4T-1进行重组，将重组质粒导入大肠杆菌BL21培养于LB培养 基中，待OD600达到1.0时加入IPTG进行诱导表达，4小时后收集细菌，经溶菌酶处 理及超声裂解后离心，取其上清用GST凝胶柱纯化，获得的GST-P37融合蛋白用蛋白 电泳对其纯度进行鉴定和定量。
用多聚酶链式反应实验(PCR)扩增细胞中猪鼻支原体特异性DNA片段，结果揭 示，猪鼻支原体不仅可以感染肿瘤细胞系，也可以感染293T、GES-1、COS-7和HUVEC 等非肿瘤细胞系(所用细胞除胃粘膜永生化细胞GES-1由北京市肿瘤防治研究所提供 外，其余非肿瘤细胞均源自美国ATCC细胞库)(图1C)。
为了揭示p37在猪鼻支原体感染细胞中是否发挥重要作用，本实施例中采用了p37 抗体阻断的方法，即先用抗P37的兔抗体与猪鼻支原体反应2小时，随后把反应混合液 加到细胞培养体系中，培养24小时后弃去培养液，收集细胞并提取DNA，然后用PCR 扩增细胞中猪鼻支原体特异性DNA片段。结果显示，5μg/mL的抗p37抗体可以明显阻 断猪鼻支原体对细胞的感染(图1C)。其中，抗P37兔抗体的制备采用常规方法，简言 之用细菌表达获得的P37蛋白与福氏佐剂充分混合后常规皮下多点免疫家兔，共免疫三 次，每次免疫至少间隔四周，在末次免疫后第十至十四天采血，待血自然凝固后离心获 得抗血清，然后用蛋白A凝胶柱纯化，获得兔抗P37蛋白抗体。
细胞ELISA实验结果也揭示抗p37抗体可以明显阻断猪鼻支原体对细胞的感染， 并且这种阻断作用呈浓度梯度依赖性(图1D)。
免疫荧光染色结果也显示抗p37抗体可以明显阻断猪鼻支原体感染胃癌细胞系(图 1E)。
抗p37抗体不仅可以阻断猪鼻支原体感染细胞，也可以阻断猪鼻支原体所引起的细 胞迁移能力增强(图1F)。
以上实验结果充分表明，猪鼻支原体感染细胞是依赖于其表面膜蛋白p37的，用抗 P37的抗体可以阻断猪鼻支原体感染细胞。
实施例2、p37的氨基端多肽阻断支原体感染细胞
p37的氨基端序列(p37蛋白序列的第2位至第23位氨基酸序列，记做p37-2-23： LKKLKNFILFSSIFSPIAFAIS，SEQ ID No.1)是猪鼻支原体所特有的，而在其他类型的 支原体中并不存在(Dudler R,Schmidhauser C,Parish RW,et al.A mycoplasma high-affinity transport system and the in vitro invasiveness of mouse sarcoma cells.(1988) The EMBO Journal 7,3963-3970)。
为了探讨p37的氨基端在介导猪鼻支原体感染细胞中所发挥的作用，本实施例中用 GST融合蛋白通过ELISA检测了其与细胞的结合。结果发现，原核重组表达的氨基端 多肽融合蛋白(GST-p37-2-23)可以和胃癌细胞系结合，并呈时间和浓度梯度依赖性， 而缺失氨基端多肽的p37蛋白(GST-p37-△2-23)并不能够和细胞结合(图2A)。
本实施例中GST-p37-2-23和GST-p37-△2-23制备方法与上述GST-P37蛋白的制备 相类似。在制备GST-p37-2-23时，首先合成能编码P37第2至23位多肽片段的正义寡 核苷酸(5’-GATCCGAGGTAGCTTTTATGCTCAAAAAATTTAAAAATTTTATTC TATTTTCATCTATATTTTCGCCAATAGCATTTGCTATATCAG-3’，SEQ ID No.4) 和反义寡核苷酸(5’-AATTCTGATATAGCAAATGCTATTGGCGAAAATATA GATGAAAATAGAATAAAATTTTTAAATTTTTTGAGCATAAAAGCTACCTC G-3’，SEQ ID No.5)，将二者退火形成双链寡核苷酸后再与原核表达质粒pGEX4T-1进行重组(寡 核苷酸链中用黑体标出的为内切酶粘性末端序列)、表达及纯化。在制备缺失P37氨基 端22个氨基酸片段的融合蛋白GST-p37-△2-23时，采用相应的引物(正义链引物为： 5’-CGC GGATCC TTTGCTATATCATGTTC-3’，SEQ ID No.6；反义链引物为：5’-CCG GAATTCTAATGGCTTTTTCAT-3’，SEQ ID No.7；黑体为引入的酶切位点)通 过常规PCR扩增获得缺少编码P37氨基端22个氨基酸的P37 cDNA，经过常规酶切和 与pGEX4T-1进行重组、表达及纯化。
把氨基端多肽直接标记荧光素FITC(FITC-p37-2-23)后进行免疫荧光染色，结果 显示，FITC-p37-2-23也可以直接和细胞结合(图2B)。
此外，合成的p37-2-23多肽可呈浓度梯度依赖性地阻断猪鼻支原体和胃癌细胞AGS 的结合，在30μM时达到了接近完全阻断的效果，而序列与p37-2-23多肽无关的对照肽 (序列为：DSGEGDFLAEGGGVR，SEQ ID No.8)没有阻断作用(图2C)。
以上结果表明，p37的氨基端多肽介导了其与细胞的结合，猪鼻支原体感染细胞依 赖于p37的氨基端多肽，用p37的氨基端多肽可以通过与细胞的结合竞争性抑制猪鼻支 原体的感染。
实施例3、p37蛋白和宿主ANXA2蛋白分别通过氨基端发生相互作用
为了寻找和p37相互作用的宿主细胞表面受体分子，本实施例首先通过GST pull-down技术将细胞裂解液中和p37相互作用蛋白进行富集，然后通过SDS-PAGE及 考马斯亮蓝染色找出差异条带(图3A中箭头所示)，将该条带通过MALDI-TOF质谱分 析鉴定，发现其多肽片段为Annexin A2序列(图3A)，表明p37的相互作用蛋白为Annexin A2(以下称ANXA2)。
为了验证p37和Annexin A2之间存在相互作用，本实施例中，还分别用p37和 ANXA2抗体(该抗体购自Novus Biotechnology公司)通过常规双向免疫共沉淀实验， 结果表明用P37抗体进行免疫沉淀可以将ANXA2沉淀下来，反之用ANXA2抗体也能 将P37沉淀下来，说明p37和ANXA2确实存在相互作用(图3B)，在实施例中也检测 了P37与Annexin蛋白家族其他分子，如ANXA1和ANXA4的相互作用，发现p37和 它们并不存在相互作用(图3B)。
在本实施例中还通过特异抗体分别将P37蛋白和ANXA2蛋白分别标记为绿色和红 色，通过激光共聚焦免疫荧光实验以更为直观地判断两种蛋白之间是否存在相互作用， 二者如果存在共同的细胞定位，则绿色和红色重叠显示黄色。结果表明，p37和ANXA2 在细胞膜上存在共定位(图3C)。
为了确定P37蛋白与ANXA2相互作用的具体区域，在本实施例中，还进行了GST pull-down实验。结果显示，p37的N端多肽融合蛋白GST-p37-2-23可以与ANXA2直 接相互作用，而缺失N端多肽的p37融合蛋白GST-p37-△2-23和ANXA2并不能相互 作用(图3D)，说明p37的N端多肽介导了p37蛋白与ANXA2的相互作用。
ANXA2属于钙离子依赖型的膜联蛋白家族，在人类中这一蛋白家族共有12个成员。 每个成员在蛋白质组成上的区别主要体现在其氨基端前26个氨基酸上，每个成员氨基 端特有的序列决定了其具有其他家族成员所不具有的某些特定功能(Gerke V,Moss S. Annexins:form structure to function.(2002)Physiol Rev 82,331-371)。比如ANXA2的N 端结构域介导其与其他蛋白质相互作用。ANXA2的N端也包含一些磷酸化修饰位点， 这些位点被磷酸化激活后，都介导ANXA2的特定生物学功能。比如，ANXA2第23位 酪氨酸磷酸化可以促使其从胞浆里向细胞膜外表面转运，进而促进相关生物学功能的发 挥(Gerke V,Moss S.Annexins:form structure to function.(2002)Physiol Rev 82,331-371)。
通过体外GST pull-down实验，本发明发现ANXA2的N端结构域介导其与p37结 合，缺失N端25个氨基酸的ANXA2蛋白并不能够和p37发生直接相互作用(图3E)。 此外，固相结合实验揭示，ANXA2的N端结构域和p37以及p37的N端多肽均存在直 接相互作用(图3F)，而且p37的N端多肽可以竞争性地阻断ANXA2与p37的结合(图 3G)。本实施例通过体外GST pull-down实验，发现完整的ANXA2融合蛋白 (His-ANXA2-FL)能够同GST-p37相互作用，而缺少氨基端25个氨基酸的ANXA2融 合蛋白(His-ANXA2-△2-26)不能与GST-p37相互作用，表明ANXA2氨基端从第2 至26的25个氨基酸多肽片段介导了ANXA2与p37的结合(图3E)。
为了进一步证明p37和ANXA2的结合是通过它们氨基端的多肽相互作用实现的， 本实施例还采用ELISA方法，用合成的ANXA2氨基端第2至26位的多肽包被96孔板 (以无关多肽SEQ ID No.8作为对照)，然后分别加入含有完整p37的GST-p37融合蛋 白、只含有p37氨基端多肽的GST-p37-2-23融合蛋白及缺失氨基端的GST-p37-△2-23 融合蛋白，在反应一定时间后常规先后加入抗GST鼠单抗、抗鼠酶标二抗及底物液， 然后在酶标仪上进行度数检测，结果表明，GST-p37和GST-p37-2-23均能与包被的 ANXA2氨基端多肽特异结合(与对照肽不结合)，而缺少氨基端的p37融合蛋白 GST-p37-△2-23与ANXA2氨基端多肽不结合，这进一步证明了ANXA2的氨基端结构 域和p37以及p37的氨基端多肽均存在直接相互作用(图3F)。
采用类似的ELISA实验，用ANXA2的融合蛋白His-ANXA2包被96孔板，分别 加入GST-p37和GST-p37-2-23或同时加入GST-p37和GST-p37-2-23，检测结果表明， p37氨基端多肽融合蛋白GST-p37-2-23可以竞争性地阻断GST-p37与ANXA2的结合(图 3G)，进一步佐证了p37与ANXA2的结合是通过其氨基端的22个多肽片段实现的。
在证明猪鼻支原体通过p37氨基端同Annexin A2氨基端2至26位氨基酸的多肽 (STVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGS，SEQ ID No.2)结合后，为证明Annexin A2氨 基端2至26位氨基酸的多肽可通过竞争性结合阻断猪鼻支原体同细胞Annexin A2的结 合，进而抑制支原体感染细胞，本案通过常规定量PCR对这一设想进行了验证。实施 方法是常规培养肿瘤细胞MGC803，然后在加入猪鼻支原体的同时分别加入不同浓度的 Annexin A2氨基端2至26位氨基酸的多肽(分别为4μm和20μm)，以不加小肽或无关 肽做对照，在感染细胞24小时后洗去细胞培养上清，常规方法、提取DNA并通过定 量PCR扩展p37基因。结果参见图3H，图中①为未加入支原体、②为加只入支原体、 ③为加入支原体同时加入无关对照肽、④和⑤为加入支原体同时加入不同浓度的 Annexin A2氨基端2至26位氨基酸的多肽(分别为4μm和20μm)。结果表明，Annexin A2氨基端2至26位氨基酸的多肽(SEQ ID No.2)可以有效阻断支原体的感染。
上述实验从不同角度充分证明了猪鼻支原体蛋白p37和宿主细胞蛋白ANXA2的相 互作用是是分别通过他们氨基端的直接结合实现的。
实施例4、ANXA2在介导猪鼻支原体感染细胞中是必需的
为了探讨ANXA2在介导猪鼻支原体感染细胞中的作用，本实施例中，在无支原体 感染的细胞培养液中先加入抗ANXA2抗体(5μg/ml)，以封闭ANXA2蛋白。反应2小 时后再加入猪鼻支原体感染细胞，在培养24小时后分别用免疫荧光染色实验及PCR扩 增支原体DNA的方法检测猪鼻支原体感染细胞的情况。实验结果显示，抗ANXA2抗 体处理细胞后，猪鼻支原体与细胞的结合显著减少(表现为荧光染色看不到支原体或 PCR扩增支原体DNA的量显著减少，图4A和图4B)，说明用ANXA2抗体处理细胞 可以明显阻断猪鼻支原体感染细胞，表明ANXA2介导了猪鼻支原体对细胞的感染。
采用常规的细胞迁移实验(即Transwell chamber实验，可参考文献Hua Yang,Like Qu, Huachong Ma,et al:Mycoplasma hyorhinis infection in gastric carcinoma and its effets on the malignant phenotypes of gastric cancer cells.2010,BMC Gastroenterology 10:132)检 测表明，细胞在先经ANXA2抗体处理后，可显著降低由猪鼻支原体引起的促细胞迁移 作用(图4C)。
为了进一步验证ANXA2在介导猪鼻支原体在感染细胞中的作用，本实施例中还采 用小分子RNA(干扰序列为：AAGGACAU-UAUUUCGGACACA，SEQ ID No.3)干 扰ANXA2的表达，使细胞不表达或减少ANXA2的表达(图4D)，然后通过上述类似 方法检测猪鼻支原体对细胞的感染情况，结果发现，用小分子RNA干扰ANXA2表达 后猪鼻支原体感染细胞的能力明显下降(图4E，用PCR检测细胞的支原体DNA；图 4F，用免疫荧光检测细胞的猪鼻支原体蛋白p37)。采用细胞迁移实验发现，干扰ANXA2 表达后猪鼻支原体的及促进细胞迁移能力也明显下降(图4G)。这进一步证明了猪鼻支 原体是通过ANXA2感染细胞的。
上述实验证明，通过抗ANXA2抗体封闭细胞膜上与可与猪鼻支原体结合的分子， 进而可以抑制猪鼻支原体感染细胞，从而本发明提供了一种可以预防猪鼻支原体感染细 胞的新的方法。
实施例5、人胃癌组织的猪鼻支原体感染的检测及与患者预后的相关性分析
为了检测胃癌组织中猪鼻支原体的感染与临床病理参数与患者预后的关系，发明人 用常规的免疫组织检测方法，用特异性抗p37蛋白抗体PD4对339例有随访资料的胃癌 组织进行了免疫组织化学的检测(方法见Yang H,Qu LK,Ma HC,et al.(2010) Mycoplasma hyorhinis infection in gastric carcinoma and its effects on the malignant phenotypes of gastric cancer cells.BMC Gastroenterol 10,132)。图5A提供的检测结果阳 性的代表性图片，5A中的1是用无关抗体的阴性对照，2至6分别表示对不同分化程 度的胃癌组织的组化检测阳性结果。
图5B是胃癌组织猪鼻支原体感染与各种临床病理参数的相关性分析，结果显示， 在339例组织中，134例为染色阳性，阳性率为39.5％(134/339)，支原体感染检测阳 性的病例，其肿瘤侵犯血管及发生远处转移的比例明显高于检测阴性的病例，说明支原 体感染与肿瘤侵犯血管及发生远处转移呈明显正相关(P值分别为0.021和0.029，图 5B)。
用Kaplan-Meier曲线分析显示，支原体阳性的胃癌患者预后较支原体阴性的患者 差，生存期短(P值为0.040，图5C)。
上述研究结果表明，人胃癌组织中存在猪鼻支原体的感染，有猪鼻支原体感染的患 者其预后差，生存时间短。