技术领域
本发明涉及人肾上腺素β3受体配体、含有其的食品及药品。
背景技术
肾上腺素受体是与从交感神经游离的肾上腺素或去甲肾上腺素等儿茶酚胺激动剂结合的受体，根据对儿茶酚胺激动剂的敏感性分为α受体和β受体2种。肾上腺素α受体按照去甲肾上腺素≥肾上腺素＞多巴胺＞异丙肾上腺素的顺序显示敏感性，肾上腺素β受体按照异丙肾上腺素＞肾上腺素≥去甲肾上腺素＞多巴胺的顺序显示敏感性。
肾上腺素β受体有β1、β2、β3受体，近年来提示还存在β4受体。作为配体对各种受体的作用，已知肾上腺素β1受体激动剂有心率增加作用，肾上腺素β1受体拮抗剂有降压作用，肾上腺素β2受体激动剂有支气管平滑肌松弛作用，肾上腺素β3受体激动剂有产热的活化作用及脂肪分解的促进作用。因此，使交感神经活化促进儿茶酚胺激动剂分泌的物质，或者非选择性肾上腺素β受体激动剂恐怕会有β1或β2作用引起的副作用，不适于肥胖等生活习惯病的预防和/或改善。因而，对于肥胖等生活习惯病的预防和/或改善，肾上腺素β3受体激动剂有效。
作为肾上腺素β3受体配体，其激动剂于1984年首次发现，在动物实验中确认有产热和脂肪分解引起的抗肥胖作用、抗糖尿病作用。但是，这些作用在人体中很微弱。到了1989年明确这种效果差异的原因是小鼠和大鼠等嗫齿类与人的肾上腺素β3受体在化学结构上的种族差异(非专利文献1和2)。因此，人肾上腺素β3受体配体，特别是激动剂对肥胖、糖尿病等生活习惯病的预防和/或改善有效，期望开发这种配体。
最近，作为人肾上腺素β3受体激动剂已知几种化合物(非专利文献1)，在临床试验中确认了作为抗肥胖药或抗糖尿病药的效果。另外，还报道了以花椒提取物作为有效成分的人β3肾上腺素受体激动剂(专利文献1)。
另一方面，报道了由巴西蘑菇(アガリクス)、香菇、金针菇、丛生口蘑、灰树花(舞茸)、滑菇等菌类制造的含壳聚糖的多糖具有降低血压、尿糖值、血糖值、尿酸值、总胆固醇值、中性脂肪值等的作用，对于高血压症和糖尿病等生活习惯病、成人病的检查数值改善非常有效(专利文献2)。
专利文献1：特开2006-96666
专利文献2：WO2004/033502
非专利文献1：高仓康人、吉田俊秀、日本药理学杂志，118，315～320，2001
非专利文献2：C.Weyer，et al.，Diabetes & Metabolism，25，11～21，1999。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人肾上腺素β3受体配体。
本发明的另一目的在于提供含有上述人肾上腺素β3受体配体的食品及药品。
本发明的另一目的在于提供含有人肾上腺素β3受体配体的肥胖、肥胖症、糖尿病、高脂血症、高血压症、痛风等生活习惯病的预防和/或改善剂。
本发明人为了实现上述目的，进行了各种研究，结果发现特定的不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的组合对人肾上腺素β3受体具有高结合活性，从而完成了本发明。
本发明提供以下述特定的不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的组合作为有效成分的人肾上腺素β3受体配体，含有其的食品及药品。
1.人肾上腺素β3受体配体，其含有下述3种成分。
(A)具有3个以上双键的不饱和脂肪酸或其可药用盐，
(B)具有1个或2个双键的不饱和脂肪酸或其可药用盐，以及
(C)饱和脂肪酸或其可药用盐。
2.如上述1所述的人肾上腺素β3受体配体，其中，(A)成分的不饱和脂肪酸的碳原子数为8～24。
3.如上述1或2所述的人肾上腺素β3受体配体，其中，(B)成分的不饱和脂肪酸的碳原子数为8～24。
4.如上述1～3中任意一项所述的人肾上腺素β3受体配体，其中，(C)成分的饱和脂肪酸的碳原子数为8～24。
5.如上述1～4中任意一项所述的人肾上腺素β3受体配体，其中，(A)成分与(B)成分的质量比为1∶90～8∶2。
6.如上述1～5中任意一项所述的人肾上腺素β3受体配体，其中，(A)成分和(B)成分的合计质量与成分(C)的质量的比为50∶1～1∶3。
7.一种食品，其中含有上述1～6中任意一项所述的人肾上腺素β3受体配体。
8.一种药品，其中含有上述1～6中任意一项所述的人肾上腺素β3受体配体。
本发明的人肾上腺素β3受体配体对人肾上腺素β3受体的结合活性高，具有降低血压、尿糖值、血糖值、尿酸值、总胆固醇值、中性脂肪值、内脏脂肪值等的作用，对于高血压症、糖尿病、肥胖、高胆固醇血症、高脂血症等生活习惯病的预防和/或治疗有效。另外，本发明的有效成分细胞毒性低，作为食品和药品可以安全使用。
具体实施方式
作为本发明有效成分(A)的具有3个以上双键的不饱和脂肪酸，碳原子数优选为8～24，更优选为10～20。
作为三不饱和脂肪酸，可以例举α-亚麻酸(18:3、9，12，15-三不饱和脂肪酸)、α-桐油酸(α-eleostealic acid)(18:3、9c，11t，13t)、β-桐油酸(β-eleostealic acid)(18:3、9t，11t，13t)、石榴酸(punicicacid)(18:3、9c，11t，13c)、金盏花酸(calendic acid)(18:3、8t，10t，12c)、ジヤルカリツク酸(jarcaric acid)(18:3、8c，10t，12c)、梓树酸(catalpic acid)(18:3、9t，11t，13c)、粗糠柴酸(kamlolenic acid)(18OH、9c，11t，13t)，作为四不饱和脂肪酸，可以例举硬脂艾杜糖酸(stearidonic acid)(6，9，12，15-四不饱和脂肪酸)、花生四烯酸(arachidonic acid)(5、8，11，14-四不饱和脂肪酸)、杷荏酸(parinaric acid)(18:4、9c，11t，13t，15c)，作为五不饱和脂肪酸，可以例举二十碳五烯酸(all-cis-icosa-5，8，11，14，17-pentaenoic acid)、二十二碳五烯酸(7，10，13，16，19-五不饱和脂肪酸)，作为六不饱和脂肪酸，可以例举二十二碳六烯酸等。
特别优选的是α-亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等。
作为本发明有效成分(B)的具有1个或2个双键的不饱和脂肪酸，碳原子数优选为8～24，更优选为10～20。
作为单不饱和脂肪酸，可以例举肉豆蔻烯酸(myristoleic acid)(碳原子数14)、棕榈油酸(palmitoleic acid)(碳原子数16)、油酸(oleic acid)(碳原子数18)、反油酸(elaidic acid)(碳原子数18)、异油酸(vaccenic acid)(碳原子数18)、鳕肝油酸(gadoleic acid)(碳原子数20)、芥酸(erucic acid)(碳原子数22)、神经酸(nervonic acid)(碳原子数24)等，作为二不饱和脂肪酸，可以例举亚油酸(linoleic acid)(碳原子数18)等。
作为本发明有效成分(C)的饱和脂肪酸，碳原子数优选8～24，更优选10～20。
作为具体实例，可以例举辛酸、壬酸、癸酸、十二烷酸、十四烷酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸、十九烷酸、二十烷酸、二十二烷酸、二十四烷酸、二十六烷酸、二十八烷酸、三十烷酸等。
在本发明中，有效成分(A)、(B)和(C)也可以是盐、酯、酰胺等形态。
作为盐，只要是食品学、营养学、或药理学上允许的盐，没有特别限制，可以例举钠盐、钙盐等金属盐，铵盐，与甲胺、乙胺、二乙胺、三乙胺、吡咯烷、哌啶、吗啉、六亚甲基亚胺、苯胺、吡啶等有机碱形成的盐，与精氨酸、谷氨酸、鸟氨酸等氨基酸形成的盐等。
另外，作为酯衍生物，只要是食品学、营养学、或药理学上允许的酯，可以选择任何酯，优选乙酯、丁酯、丙酯和甘油酯，更优选乙酯和甘油酯。作为甘油酯衍生物，可以是甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯中的任何一种形式，优选甘油二酯和甘油三酯的形式，最优选甘油三酯。
而且，作为酰胺衍生物，只要是食品学、营养学、或药理学上允许的酰胺，没有特别限制，可以例举乙酰胺、丙酰胺、丁酰胺、戊酰胺等。
在本发明中，(A)成分与(B)成分的质量比优选1∶90～8∶2，更优选1∶60～3∶7。
另外，(A)成分和(B)成分的合计质量与成分(C)的质量的比优选为50∶1～1∶3，更优选为40∶1～1∶1。
本发明的肾上腺素β3受体配体可以仅使用有效成分，也可以以添加了赋形剂等的形态使用。
例如，以液体制剂的形态使用本发明的配体时，根据需要在上述有效成分中配合苯甲酸钠、对羟基苯甲酸甲酯、脱氢乙酸钠等防腐剂，苹果酸、抗坏血酸、枸橼酸、乙酸等溶解助剂，以及着色剂、香料、风味剂、葡萄糖、甘露醇等甜味剂等，而且，根据需要加入蒸馏水、生理盐水等稀释剂，配制成药品或食品。
以上述成分作为有效成分的药品通常配制成片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、栓剂等固体制剂的形态。这时，这些药物制剂使用通常使用的填充剂、增量剂、粘结剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂等稀释剂或赋形剂配制。
制成片剂形态时，载体可以广泛使用本领域现有的公知物质，可以例举乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素等赋形剂，蒸馏水、生理盐水、单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、明胶溶液、羧甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等粘结剂，干燥淀粉、海藻酸钠、琼脂末、碳酸氢钠、碳酸钙、月桂基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、淀粉、乳糖等崩解剂，蔗糖、硬脂、可可脂、氢化油等崩解抑制剂，乙酸、抗坏血酸、苹果酸等溶解吸收促进剂，甘油、淀粉、乳糖、高岭土、膨润土、胶状硅酸等吸附剂，精制滑石、硬脂酸盐、聚乙二醇等润滑剂等。而且，片剂可以根据需要制成糖衣片、明胶包衣片、肠溶衣片、膜包衣片或双层片、多层片。
制成丸剂的形态时，载体可以广泛使用本领域现有的公知物质，可以例举葡萄糖、乳糖、甘露醇、淀粉、可可脂、硬化植物油、高岭土、滑石等赋形剂，阿拉伯胶末、明胶等崩解剂等。制成栓剂的形态时，载体可以广泛使用现有的公知物质，可以例举可可脂、高级醇的酯类、明胶等。
有效成分的含量没有特别限制，可以在宽范围内选择，有效成分(A)、(B)和(C)整体通常可以在制剂中含有0.001～30质量％，优选0.01～10质量％。
给药量没有特别限定，可以根据用法、患者的年龄、性别、疾病的程度等条件适当选择。例如，相对于体重1kg，按有效成分(A)、(B)和(C)整体0.01～20mg，优选0.02～10mg的量，分每日1～4次口服给药。
含有本发明的有效成分(A)、(B)和(C)的食品没有特别限制，可以例举汤、酱汤、饮料、果冻、软糖(グミ)等。这些食品中的有效成分(A)、(B)和(C)整体的含量优选为0.001～30质量％，更优选为0.01～10质量％。
肾上腺素β3受体结合活性例如可以使用表达人重组肾上腺素β3受体的HEK-293细胞，按照Cell Biology：Feve et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(1994)，Vol.91，pp.5677-5681记载的方法进行。即，可以通过在Tris缓冲液(pH7.4)中加入样品的1％DMSO溶液、以及0.5nM[125I]氰基吲哚洛尔，将HEK-293细胞在25℃下培养90分钟后，过滤，洗涤，测定肾上腺素β3受体结合配体的放射能进行。
以下结合实施例更详细地说明本发明。
试验例1
使用大鼠原代前脂肪细胞4种(内脏脂肪、副睾周围脂肪(periepididymal fat)、皮下白色脂肪、褐色脂肪)，对于本发明组合物的脂肪蓄积抑制效果和脂肪释放效果在体外(in vitro)进行初步研究。
试验材料及试验方法
阴性对照物质
使用二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide，以下称为DMSO)(和光纯药工业(株))。
被测物质
将按表1所示质量比含有下述表1所示成分的成分用DMSO溶解至1w/v％，添加至脂肪细胞分化介质(Primary Cell Co.，Ltd.，Lot.No.080411)中，使最终浓度达到10μg/mL后使用。肾上腺素β3受体结合活性试验按照前述的方法进行。
【表1】
使用细胞
使用前脂肪细胞培养试剂盒3种组合H-3(原代、大鼠、Primary Cell Co.，Ltd.：内脏脂肪前细胞(以下称为VAC)Lot.No.FIHA-FV；皮下白色前脂肪细胞(以下称为SAC)FIHA-FS；副睾周围前脂肪细胞(以下称为EAC)FIHA-FE)以及褐色脂肪细胞培养试剂盒F-8(原代、大鼠、Primary Cell Co.，Ltd.：Lot.No.HDOA-1)。
使用去甲肾上腺素(以下称为NE)(-)-Norepinephrine(+)-bitartrate salt hydrate(SIGMA：Lot No.103K0979)。
细胞裂解液的制备
使用TRI试剂(Molecular Research Center：Lot No.3681)。
试验方法
培养操作
(1)3种前脂肪细胞(VAC、SAC、EAC)
将3种脂肪细胞前细胞(内脏脂肪、副睾周围脂肪、皮下白色脂肪)1.5×106cells接种于24孔板的12孔中(细胞数为1.2×105cells/mL/well)，用脂肪细胞分化介质进行预培养4天。预培养后(接种后第4天)用内脏脂肪分化介质将阴性对照物质和被测物质配制成规定浓度，将配制好的培养基添加到细胞中。
培养基更换于被测物质添加第0，2，4天(接种第4，6，8天)进行，回收后加入新的配制好的培养基。最后一天，对于NE未处理组，直接进行细胞裂解液的制备，对于NE处理组，在制备细胞裂解液的6小时前用脂肪细胞分化介质将被测物质和阴性对照物质配制成规定浓度，将NE配制成1×10-6M浓度，添加到细胞中。显微镜观察在被测物质添加日以及NE添加前后进行，对于代表例用hoffman module lens(ホフマンモジユ一ルレンズ)拍摄照片。
(2)褐色脂肪细胞(以下称为BAT)
将24孔板中接种的褐色脂肪细胞用增殖用介质培养3天，确认铺满。更换为分化诱导培养基，培养2天，用维持介质将阴性对照物质和被测物质配制成规定浓度，将配制好的培养基添加到细胞中，培养4天。关于NE处理，用维持介质进行与VAC同样的处理。
显微镜观察在NE添加前后进行，对于代表例用hoffman module lens拍摄照片。
试验组的构成如以下的表2和表3所示。
【表2】
【表3】
试验结果
细胞形态观察显微镜照片(VAC)
被测物质给药第0天(接种第4天)
在接种内脏脂肪细胞后第4天，添加常规培养基和被测物质配制好的培养液1mL，进行显微镜观察和代表例的照片拍摄。
对各孔的整体进行观察后，确认在脂肪细胞中脂肪滴开始一点一点蓄积。
确认各组间没有差异，试验系统在各组相同的条件下进行。
被测物质给药第2天(接种第6天)
对照组可见蓄积了小脂肪滴的脂肪细胞，也看到了一些成熟的脂肪细胞。
本发明的组合物(实施例3)10μg/mL添加组中，蓄积了小脂肪滴的脂肪细胞多，确认几乎没有肥大化的脂肪细胞。
各组均确认没有细胞障碍的情况。
被测物质给药第4天(接种第8天)
对照组中，几乎所有的脂肪细胞都成为成熟细胞，可以见到很多肥大化的细胞。
本发明的组合物(实施例3)10μg/mL连续添加组中，成熟的脂肪细胞增加。另外，也可以见到一些肥大化的脂肪细胞。与对照组相比，确认没有大的差异。
未能明确见到样品添加6小时的效果。
获得了添加NE 6小时引起的反应。另外，由于样品的连续添加，可以见到NE反应性提高。添加NE+样品6小时，可以见到与添加NE 6小时的组同等的反应性。
被测物质给药第6天(接种第10天)
对照组中，肥大化的细胞多，确认有脂肪滴的融合。
样品添加组中，确认几乎没有肥大化细胞，确认了明确的肥大化抑制作用。
细胞形态观察显微镜照片(VAC)(倍率100倍)如图1所示。
细胞形态观察显微镜照片(SAC)
被测物质给药第0天(接种第4天)
接种皮下白色脂肪细胞后第4天，添加常规培养基和被测物质配制好的培养液1mL，进行显微镜观察和代表例的照片拍摄。
对各孔的整体进行观察后，确认在脂肪细胞中脂肪滴开始蓄积。
确认各组间没有差异，试验系统在各组相同的条件下进行。
被测物质给药第2天(接种第6天)
对照组中，也可见蓄积了小脂肪滴的脂肪细胞，还可以看到成熟的脂肪细胞。
本发明的组合物(实施例3)10μg/mL添加组，与对照组相比，蓄积了小脂肪滴的脂肪细胞多，确认几乎没有肥大化的脂肪细胞。
本发明的组合物(实施例3)10μg/mL添加组中，见到少量认为细胞剥离的现象，确认细胞密度变低。
被测物质给药第4天(接种第8天)
对照组中，确认几乎所有的脂肪细胞都成为成熟细胞。
本发明的组合物(实施例3)10μg/mL添加组中，成熟的脂肪细胞增加。另外，第6天见到的认为细胞剥离的现象增加，与对照组相比脂肪细胞数少。
添加样品6小时的组中，由形态观察确认几乎没有效果。
获得了添加NE引起的反应。另外，提示了通过样品的同时添加，良好进行反应的可能性。
细胞形态观察显微镜照片(EAC)
被测物质给药第0天(接种第4天)
接种副睾周围脂肪细胞后第4天，添加常规培养基和被测物质配制好的培养液1mL，进行显微镜观察和代表例的照片拍摄。
对各孔的整体进行观察后，确认在脂肪细胞中脂肪滴开始一点一点蓄积。
确认各组间没有差异，试验系统在各组相同的条件下进行。
被测物质给药第2天(接种第6天)
对照组也可见蓄积了小脂肪滴的脂肪细胞，确认脂肪蓄积不断进行。
本发明的组合物(实施例3)10μg/mL添加组，与对照组相比，脂肪滴的小细胞多，确认几乎没有脂肪滴肥大化的脂肪细胞。
与对照组相比，细胞密度低，认为有细胞剥离的可能性。
被测物质给药第4天(接种第8天)
对照组中，确认几乎所有的脂肪细胞都成为成熟细胞，脂肪滴肥大化的细胞多。
本发明的组合物(实施例3)10μg/mL添加组中，也可见到一些脂肪滴肥大化的脂肪细胞，但与对照组相比，脂肪滴肥大化的脂肪细胞数少。另外，细胞密度低，认为有细胞剥离的可能性。
未能明确确认添加样品6小时的效果。
获得了添加NE 6小时引起的反应。另外，由于样品的同时添加或连续添加，NE反应性与添加NE 6小时组同等程度。
细胞形态观察显微镜照片(BAT)
被测物质给药第0天(接种第5天)
接种褐色脂肪细胞后第5天，添加维持培养基和被测物质配制好的培养液1mL，进行显微镜观察和代表例的照片拍摄。
对各孔的整体进行观察后，确认在脂肪细胞中脂肪滴开始一点一点蓄积。
确认各组间没有差异，试验系统在各组相同的条件下进行。
被测物质给药第4天(接种9日目)
对照组中，确认几乎所有的脂肪细胞都成为成熟细胞。
本发明的组合物(实施例3)10μg/mL连续添加组中，脂肪滴的大小较小，另外可以见到细胞的密度变低。
添加样品刺激1小时的效果在形态观察中未能明确确认。
添加NE 1小时引起的反应可以充分确认。
对于通过同时添加NE和样品、或连续添加样品后添加NE引起的刺激，通过形态观察也确认进行了反应。
制剂例1(片剂)
在实施例1制备的组合物10g中，加入苹果酸10g、抗坏血酸10g，溶解于1000ml的水中，冷冻干燥。该物质具有瞬间溶解于纯水的特性。在该冷冻干燥物10g中加入甘露醇20g、乳糖50g、聚葡萄糖20g，充分混合，加入蔗糖脂肪酸酯2g作为粘结剂，制成片剂。
制剂例2(颗粒剂)
将实施例2制备的组合物1g在糊精100g中充分分散后，将其与糊精900g混合，通过流化床造粒制成颗粒剂。
制剂例3(果冻)
在实施例3制备的组合物1g中加入抗坏血酸10g，分散·溶解于500g的液体糖中，加入凝胶化剂0.1g、柠檬香料0.1g和水500ml，填充到塑料容器中，冷却，制成果冻。
附图说明
图1是被测物质给药第6天(接种第10天)的细胞形态观察显微镜照片(VAC)(倍率100倍)。