鱼类的盾纤虫病预防治疗疫苗.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102186498 A (43)申请公布日 2011.09.14 CN 102186498 A *CN102186498A* (21)申请号 200980141077.8 (22)申请日 2009.10.16 267669/08 2008.10.16 JP A61K 39/00(2006.01) A61P 33/00(2006.01) (71)申请人 国立大学法人爱媛大学 地址 日本爱媛县 申请人 明治制果株式会社 (72)发明人 北村真一 宋准荣 (74)专利代理机构 北京市柳沈律师事务所 11105 代理人 封新琴 (54) 发明名称 鱼类的盾纤虫病预防治疗疫苗 。

2、(57) 摘要 本发明提供对盾纤虫病、 特别是死亡率高的 舌齿鲈嗜污虫具有感染防御的有效的预防、 治疗 疫苗。所述疫苗以 (1) 与舌齿鲈嗜污虫 Iyo I 株 显示相同血清型的株的灭活物， (2) 与舌齿鲈嗜 污虫 Nakajima 株显示相同血清型的株的灭活物 以及， (3)与舌齿鲈嗜污虫Mie0301 株显示相同血 清型的株的灭活物作为有效成分。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2011.04.18 (86)PCT申请的申请数据 PCT/JP2009/067876 2009.10.16 (87)PCT申请的公布数据 WO2010/044451 JA 2010.04.。

3、22 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 4 页 CN 102186502 A1/1 页 2 1. 用于盾纤虫病的预防或治疗的混合疫苗， 其以 (1) 与舌齿鲈嗜污虫 (Philasterides dicentrarchi)Iyo I 株显示相同血清型的株的 灭活物、 (2) 与舌齿鲈嗜污虫 Nakajima 株显示相同血清型的株的灭活物、 和 (3) 与舌齿鲈嗜污虫 Mie0301 株显示相同血清型的株的灭活物作为有效成分。 2.根据权利要求1所述的混合疫苗， 其中， 与舌齿鲈嗜污虫Iyo I株显示相同。

4、血清型的 株是选自 Iyo I 株、 JF05To 株、 RF05To 株和 SK05Kyo 株中的株。 3. 盾纤虫病的预防或治疗方法， 其包括 向有必要进行盾纤虫病的预防或治疗的对象， 以有效量施用权利要求 1 或 2 所述的混 合疫苗。 4.(1) 与舌齿鲈嗜污虫 Iyo I 株显示相同血清型的株、 (2) 与舌齿鲈嗜污虫 Nakajima 株显示相同血清型的株、 和 (3) 与舌齿鲈嗜污虫 Mie0301 株显示相同血清型的株在制造用于盾纤虫病的预防或治 疗的混合疫苗中的用途。 5. 权利要求 1 或 2 所述的混合疫苗的制造方法， 其包括 将 (1) 与舌齿鲈嗜污虫 Iyo I 株显。

5、示相同血清型的株、 (2) 与舌齿鲈嗜污虫 Nakajima 株显示相同血清型的株、 和 (3) 与舌齿鲈嗜污虫 Mie0301 株显示相同血清型的株各自单独或两种以上组合进行灭 活的步骤 ； 和 将所得的灭活物混合的步骤。 权 利 要 求 书 CN 102186498 A CN 102186502 A1/9 页 3 鱼类的盾纤虫病预防治疗疫苗 技术领域 0001 本发明涉及对盾纤虫病 (scuticociliatosis) 的预防或治疗有效的疫苗。 背景技术 0002 盾纤虫病是一种鱼类寄生虫病， 在日本于 1990 年首次确认在牙鲆 ( ) 中发 病。日本 2004 年的养殖牙鲆产值为约 。

6、93 亿日元。这其中有约 20来自爱媛县， 而该县的 鱼类病指导中心报告的牙鲆鱼病诊断件数中， 盾纤虫病的诊断率一年间高至 15 20左 右， 据推测， 该病的死亡率为 30 70。对牙鲆养殖业而言， 该病已经成为重要的鱼类病， 但现状是， 针对该病的治疗、 预防方法尚未建立， 甚至有从业者因发生该病而不得不放弃牙 鲆养殖业。此后， 不仅在日本国内， 在韩国也确认有牙鲆养殖场发生该病。因此， 该病是牙 鲆养殖现场最希望进行研究的感染症。目前为止， 已经报告作为该病的原因的盾纤毛虫是 海洋尾丝虫 (Uronema marinum)， 而此后又从患盾纤虫病的牙鲆中分离出了各种种类的盾 纤毛虫。 0。

7、003 近年来， 发明人的小组进行了形态学上和基因上的鉴定， 结果明确了舌齿鲈嗜污 虫(Philasterides dicentrarchi， P.Dicentrarchi)(该学名与贪食迈阿密虫(Miamiensis avidus) 是同义词 ) 是该病的主要原因 ( 非专利文献 1)。进一步， 发明人的小组通过使用 舌齿鲈嗜污虫进行的实验感染， 确认了该虫对牙鲆的高病原性 ( 非专利文献 2)。 0004 为了驱除包括该舌齿鲈嗜污虫在内的盾纤毛虫， 试验了各种治疗方法。 例如， 利用 福尔马林等的浸渍已确认有杀虫效果 ( 非专利文献 3)， 而利用含过氧化氢的药浴的治疗方 法也已确认有效果。

8、 ( 专利文献 1)， 但是， 对于舌齿鲈嗜污虫的情况， 其为内部寄生性， 会侵 入宿主鱼类的脑内， 因而还不能说取得了充分的效果。 0005 在这种情况下， 有报告报道了该虫的福尔马林灭活疫苗对盾纤虫病是有效的 ( 专 利文献 2、 非专利文献 4 和 5)， 以及利用缺少特定金属的淡水浴的预防 - 治疗方法 ( 专利文 献 3)。 0006 现有技术文献 0007 专利文献 0008 专利文献 1 ： 专利第 3882939 号说明书 0009 专利文献 2 ： 国际公开第 WO2008/084125 号公报 0010 专利文献 3 ： 特开 2006-306834 号公报 0011 非专。

9、利文献 0012 非专利文献 1 ： 平成 16 年度日本魚病学会大会講演要旨集， 65 页， 2004 年 0013 非专利文献 2 ： Diseases of Aquatic Organisms、 73 卷， 227 234 页， 2007 年 0014 非专利文献 3 ： 愛媛県水産試験埸研究報告， 第 6 号， 65 70 页， 1997 年 0015 非专利文献 4 ： 平成 17 年度日本魚病学会大会講演要旨集， A-29， 37 页， 2005 年 0016 非专利文献 5 ： Journal of Fish Pathology， ( 韩国 )， 19 卷， 2 号， 173 1。

10、81 页， 2006 年 说 明 书 CN 102186498 A CN 102186502 A2/9 页 4 发明内容 0017 发明所要解决的问题 0018 然而， 即使是被认为对盾纤虫病有效的传统疫苗， 其效果也不能说是充分的， 希望 开发有效性更高的疫苗。特别是， 在本发明中， 发明人的小组明确了舌齿鲈嗜污虫存在 3 种 血清型， 采用单一的疫苗无法预防其它血清型的该虫的感染。因而， 本发明的目的是 ： 对于 盾纤虫病、 特别是死亡率高的舌齿鲈嗜污虫的感染能够有效地进行预防、 治疗的疫苗。 0019 解决问题的方法 0020 发明人进行了深入研究， 结果发现 ： 将由 3 种不同血清型。

11、的该虫获得的疫苗组合 而得到的本发明的混合疫苗能够飞跃式地提高针对舌齿鲈嗜污虫的有效性， 即使是针对单 一疫苗无法预防的该虫的感染， 也能够发挥有效的预防、 治疗， 从而完成了本发明的混合疫 苗。 0021 本发明涉及 ： 0022 1以(1)舌齿鲈嗜污虫(舌齿鲈嗜污虫)Iyo I株与显示相同血清型的株的灭活 物、 (2) 与舌齿鲈嗜污虫 Nakajima 株显示相同血清型的株的灭活物、 以及 (3) 与舌齿鲈嗜 污虫 Mie0301 株显示相同血清型的株的灭活物作为有效成分的用于盾纤虫病的预防或治 疗的混合疫苗 ； 0023 21 所述的混合疫苗， 其中， 与舌齿鲈嗜污虫 Iyo I 株显示。

12、相同血清型的株是 选自 Iyo I 株、 JF05To 株、 RF05To 株以及 SK05Kyo 株中的株 ； 0024 3盾纤虫病的预防或治疗方法， 其包括将1或2所述的混合疫苗以有效量施 用于有必要进行盾纤虫病的预防或治疗的对象 ； 0025 4(1) 与舌齿鲈嗜污虫 Iyo I 株显示相同血清型的株、 (2) 与舌齿鲈嗜污虫 Nakajima 株显示相同血清型的株、 以及 (3) 与舌齿鲈嗜污虫 Mie0301 株显示相同血清型的 株在制造用于盾纤虫病的预防或治疗的混合疫苗中的用途 ； 0026 51 或 2 所述的混合疫苗的制造方法， 其包括将 (1) 与舌齿鲈嗜污虫 Iyo I 株。

13、显示相同血清型的株、 (2)与舌齿鲈嗜污虫Nakajima株显示相同血清型的株、 以及(3)与 舌齿鲈嗜污虫 Mie0301 株显示相同血清型的株、 各自单独或两种以上组合进行灭活的步 骤， 以及将所得灭活物混合的步骤。 0027 发明的效果 0028 本发明是一种针对包括死亡率高的舌齿鲈嗜污虫感染在内的盾纤虫病的预防、 治 疗有效性高的疫苗。更具体地， 根据本发明， 能够提供一种安全的鱼类用疫苗， 该鱼类用疫 苗即使施用于以食品为前提饲养的养殖鱼类， 也不会出现问题。本发明的灭活疫苗， 能够 以简便且低成本的步骤制造， 因为在获取其抗原的过程中能够容易地大量生产舌齿鲈嗜污 虫， 且灭活方法简。

14、单。 而且， 制造出来的疫苗能够诱导针对起因于舌齿鲈嗜污虫的盾纤虫病 的感染防御能力。 因此， 其能够对养殖产业及相关产业中的生产性和品质提升、 以及养殖中 环境卫生的改善做出很大贡献。 附图说明 0029 图 1 该图显示了使用 Iyo I 株 ( 泳道 1)、 JF05To 株 ( 泳道 2)、 RF05To 株 ( 泳 说 明 书 CN 102186498 A CN 102186502 A3/9 页 5 道 3)、 SK05Kyo 株 ( 泳道 4)、 Nakajima 株 ( 泳道 5)、 Mie0301 株 ( 泳道 6) 和抗 Iyo I 株、 SK05Kyo 株、 Nakajim。

15、a 株、 Mie0301 株血清进行的 Westren 印迹的结果。图中的 A、 B、 C、 D 分 别为抗 Iyo I 株、 SK05Kyo 株、 Nakajima 株、 Mie0301 株血清的反应情况。而且， 图 1 最左侧 的泳道显示分子量标记。 0030 图 2 该图表示出了利用 Iyo I 株 (4.03104细胞 / 鱼 ) 对接种 3 种混合疫苗 后的牙鲆进行的攻击试验的天数累计死亡率变化。 表示3种混合疫苗接种区， 表示MEM 对照区。 0031 图 3 该图表示出了利用 Nakajima 株 (4.03104细胞 / 鱼 ) 对接种 3 种混合疫 苗后的牙鲆进行的攻击试验的。

16、天数累计死亡率变化。表示 3 种混合疫苗接种区， 表示 MEM 对照区。 0032 图 4 该图表示出了利用 Mie0301 株 (4.03105细胞 / 鱼 ) 对接种 3 种混合疫 苗后的牙鲆进行攻击试验的天数累计死亡率变化。 表示3种混合疫苗接种区， 表示MEM 对照区。 0033 图5该图表示出了利用Iyo I株(6.12105细胞/鱼)对接种Iyo I、 Nakajima 和 Mie0301 中的各单一疫苗后的牙鲆进行攻击试验的天数累计死亡率变化。、 、 、 分别表示 Iyo I 株、 Nakajima 株、 Mie 株、 MEM 对照区。 0034 图 6 该图表示出了利用 Nak。

17、ajima 株 (6.12105细胞 / 鱼 ) 对接种 Iyo I、 Nakajima 和 Mie0301 中的各单一疫苗后的牙鲆进行攻击试验的天数累计死亡率变化。、 、 、 分别表示 Iyo I 株、 Nakajima 株、 Mie 株、 MEM 对照区。 0035 图 7 该图表示出了利用 Mie 株 (6.12105细胞 / 鱼 ) 对接种 Iyo I、 Nakajima 和 Mie0301 中的各单一疫苗后的牙鲆进行攻击试验的天数累计死亡率变化。、 、 、 分别表示 Iyo I 株、 Nakajima 株、 Mie 株、 MEM 对照区。 0036 图 8 该图表示出了利用 Iyo 。

18、I 株 (3.06105细胞 / 鱼 ) 对接种 3 种混合疫苗 后的牙鲆进行攻击试验的天数累计死亡率变化。表示 3 种混合疫苗接种区， 表示 MEM 对照区。 0037 发明的具体实施方式 0038 本发明中使用的各株的灭活物、 即灭活疫苗可以按照常规方法来制备， 例如可以 如下地制备。对舌齿鲈嗜污虫 ( 以下称作该虫 ) 喂食鱼类细胞系化细胞 CHSE-214(ATCC No.CRL-1681 ； 从北海道大学大学院水产科学研究院海洋应用生命科学部门吉水永守教授 处获得 )， 于 20静置培养 5 天。鱼类细胞系化细胞 CHSE-214 使用 CHSE-214 细胞用培养 基 添加了 10。

19、胎牛血清的 Eagle s MEM(Minimum Essential Medium) 培养基 ( 日水制 药制造 ： 制品编码 05900) 用碳酸氢钠调整至 pH7.3 于 20培养至单层。通过离心分离收 集这样培养得到的该虫， 添加灭活剂、 例如福尔马林、 戊二醛、 -丙内酯等进行灭活。 例如， 在使用福尔马林的例子中， 添加 35福尔马林液使得终浓度为 0.3， 在 4的温度下灭活 过夜。但是， 在灭活会损害抗原性的情况下， 要使灭活条件缓和。可以列举出例如 ： 减少灭 活剂的量、 添加 pH 缓冲剂、 降低灭活温度等。 0039 作为这里使用的原生动物， 使用 (1) 与舌齿鲈嗜污虫。

20、 Iyo I 株显示相同血清型的 株、 (2) 与 Nakajima 株显示相同血清型的株、 以及 (3) 与 Mie0301 株显示相同血清型的株、 即相互间显示不同血清型的 3 种株。作为与 Iyo I 株显示相同血清型的株， 可以使用例如 说 明 书 CN 102186498 A CN 102186502 A4/9 页 6 JF05To 株、 RF05To 株、 SK05Kyo 株。 0040 这些株是发明人的小组分离、 鉴定的， 其详细情况如表 1 所示。 0041 表 1 0042 分离株来源产地分离年份GenBank 登录号 Iyo I牙鲆 / 脑爱媛县2006EU831227 N。

21、akajima牙鲆 / 脑爱媛县2006EU831226 JF05To牙鲆 / 脑鸟取县2005EU831231 Mie0301牙鲆 / 脑三重县2003EU831233 RF05To木叶鲽 / 脑鸟取县2005EU831230 SK05Kyo斑石鲷京都府2005EU831232 0043 对于 Iyo I 型 ( 血清型 I 型 )， 在使用抗 Iyo I 株兔抗体进行 Westren 印迹时 ( 图 1A 以及图 1B)， 在 30kDa 处检测出了强烈反应的蛋白质 ( 泳道 1 4)。另一方面， 对于抗 Nakajima 株兔抗体 ( 图 1C) 和抗 Mie0301 株兔抗体 ( 图 。

22、1D)， 未检测出这样的蛋白质。 0044 对于Nakajima型(血清型II型)， 在使用抗Nakajima株兔抗体和抗Mie0301株兔 抗体进行 Westren 印迹时 ( 图 1C 以及图 1D)， 在 38kDa 处检测出了强烈反应的蛋白质 ( 泳 道 5)。 0045 对于Mie0301型(血清型III型)， 在使用抗Nakajima株兔抗体和抗Mie0301株兔 抗体进行 Westren 印迹时 ( 图 1C 以及图 1D)， 在 34kDa 处检测出了强烈反应的蛋白质 ( 泳 道 6)。 0046 本发明中使用的该虫的形态学特征为约 30400m 的椭圆形， 有纤毛。与其它纤 。

23、毛虫不同， 其为组织食性， 不仅摄食细菌类， 还摄食动物细胞(例如鱼类细胞系化细胞)。 此 外， 该虫在分类学上分类于盾纤目 (Scuticociliatida)、 嗜污亚目 (Philasterina)、 嗜污 科 (Philasteridae)。 0047 本发明中使用的该虫的传代培养， 可以是在 20的保存条件下一个月一次传代至 新鲜细胞。 至少数日一次在显微镜下观察该虫， 当虫体变小时， 即使在一个月以内也要进行 传代。经确认， 所述传代引起的病原性变化在 5 年间是稳定的。此外， 未确认到传代引起的 抗原性变化。 0048 本发明的 3 种混合疫苗是指由上述的血清型不同的 3 种灭活。

24、疫苗 ( 优选福尔马林 灭活疫苗 ) 组合而得到的混合疫苗。对于该组合的比例没有特殊限制， 例如， 可以相对于最 少量的单一疫苗、 在细胞数方面以 1 5 倍、 优选 1 3 倍的量使用各单一疫苗， 特别优选 将各单一疫苗以 1 1 1 的比例混合而得到的混合疫苗。 0049 对于本发明的混合疫苗的浓度， 没有特殊限制。可以根据使用情况调整适宜浓度 来使用。特别是， 如果以各疫苗的总量计为 105细胞 / 鱼以上， 则能够获得充分的有效性。 0050 而且， 对于舌齿鲈嗜污虫的Iyo I株、 Nakajima株、 Mie0301株各株， 申请人于平成 说 明 书 CN 102186498 A 。

25、CN 102186502 A5/9 页 7 20 年 7 月 24 日， 对于舌齿鲈嗜污虫的 JF05To 株、 RF05To 株、 SK05Kyo 株各株申请人于平成 20年10月7日， 向日本特许厅长官指定的保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所 的专利生物保藏中心提出了保藏申请， 并于平成 20 年 8 月 1 日和平成 20 年 10 月 16 日收 到不予出具保藏证明通知书 ( 寄託受託証不交付通知 )， 通知申请人不予保藏。因此， 本发 明中使用的原生动物采取自行保藏， 申请人在此保证遵守日本专利法实施细则第 27 条之 3 关于分让 ( 分譲 ) 的规定。 0051 对于适应本发。

26、明的混合疫苗的鱼种没有特殊限制， 只要是存在盾纤虫病发病可能 性的鱼种即可， 可以列举出牙鲆、 大菱鲆 ( - )、 真鲷 ( )、 条石鲷 ( )、 斑石鲷 ( )、 木叶鲽 ( ) 等。此外， 对于任何鱼种， 可以对 存在感染可能性的任意年龄或任意尺寸的鱼类使用。使用方法可以列举出例如经口施用、 肌肉内施用、 皮下施用、 腹腔内施用、 浸渍处理等方法。 这其中， 腹腔内施用可以以少的抗原 量诱导充分的免疫。 0052 作为可以利用本发明的混合疫苗有效预防、 治疗的原生动物， 可以列举出舌齿鲈 嗜污虫 Iyo I 株、 Nakajima 株、 Mie0301 株、 JF05To 株、 RF0。

27、5To 株、 SK05Kyo 株等。 0053 实施例 0054 以下通过实施例对本发明进行更具体的说明， 但这并非是对本发明的限定。 0055 参考例 1 0056 为了比较从不同鱼种、 不同地域分离的舌齿鲈嗜污虫的抗原性， 灭活测定和 Westren 印迹。 0057 (1) 灭活测定 0058 选择舌齿鲈嗜污虫的 Iyo I、 Nakajima、 Mie0301、 SK05Kyo 各分离株， 制作了家兔 血清。供试株使用的是 Iyo I 株、 Nakajima 株、 Mie0301 株、 JF05To 株、 RF05To 株、 SK05Kyo 株。灭活测定是使用 20、 40、 80、 。

28、160、 320、 640、 1280 和 2560 倍稀释的上述抗血清对舌齿鲈 嗜污虫的各株 ( 约 100 虫体 ) 进行致敏， 在显微镜下观察凝集和灭活， 求出灭活效价。 0059 结果如表 2 所示。抗 Iyo I 株血清 ( 抗体 ) 对 Iyo I 株、 JF05To 株、 RF05To 株、 SK05Kyo 株分别显示出 80 倍以上的凝集抗体效价。但是， 对于 Nakajima 株和 Mie0301 株则 为 20 倍以下。另一方面， 抗 Nakajima 株血清 ( 抗体 ) 对 Nakajima 株显示出 1280 倍的凝 集抗体效价， 但对其它 5 株则为 20 倍以下。。

29、在抗 Mie0301 株血清 ( 抗体 ) 中也确认到了与 抗 Nakajima 株血清 ( 抗体 ) 的结果相似， 其仅对同系的 Mie0301 株显示高灭活。 0060 表 2 0061 说 明 书 CN 102186498 A CN 102186502 A6/9 页 8 0062 (2)Westren 印迹 0063 Westren 印迹按常规方法如以下进行。抗血清和株使用了与上述灭活测定中相同 的材料。 0064 将该虫在鱼类细胞系化细胞 CHSE-214 细胞上培养 5 天， 所述鱼类细胞系化细胞 CHSE-214 细胞已经用在 Eagle s MEM 培养基 “NISSUI” ( 。

30、日水制药株式会社制 ) 中混合 10胎牛血清 (FBS)、 并用 7.5的碳酸氢钠水调整至 pH7.3 而得到的培养基培养至单层。 0065 培养该虫后， 通过离心分离 (500g、 20、 5 分钟 ) 回收该虫， 用不含 FBS 的 Eagle s MEM 培养基洗涤后， 悬浮于 Tris-EDTA 缓冲液中。在悬浮液中混合等量的含 10 十二烷基硫酸钠 (SDS) 的 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 样品缓冲液， 在热板上 100加热 3 分钟。从该悬浮液中通过 SDS-PAGE 在凝胶上分离蛋白质。将该凝胶用含 25 甲醇 -10醋酸的考马斯亮蓝 ( 和光纯药制 )。

31、 染色。 0066 然后， 将SDS-PAGE上分离的蛋白质转印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上， 将该膜用含 有 10脱脂牛奶的 TBS-T 封闭 2 小时， 用 TBS-T 进行了洗涤。 0067 然 后，将 封 闭 的 膜 作 为 第 一 抗 体 与 抗 血 清 一 起 反 应 1 小 时，用 TBS-T(Tris-Buffered Saline-Tween) 进行洗涤。然后， 作为第二抗体使用过氧化物酶标 记山羊抗兔 IgG 反应 1 小时。将该膜用 TBS-T 洗涤， 使用 HRP(horseradish peroxidase) Conjugate substrate 试剂盒 (Bio。

32、-Rad Laboratories 公司制造 ) 使条带可视化。 0068 其结果支持了灭活测定 ( 图 1)。即， Iyo I 株 ( 图 1 的泳道 1)、 JF05To 株 ( 泳道 2)、 RF05To 株 ( 泳道 3)、 SK05Kyo 株 ( 泳道 4) 的 30kDa 的蛋白质对于抗 Iyo I 株血清 ( 图 1A)和抗SK05Kyo株血清(图1B)的各抗体显示出了强反应性。 但是， 对于Nakajima株(泳 道 5) 和 Mie0301 株 ( 泳道 6)， 未确认到该条带。此外， 抗 SK05Kyo 抗体 (B) 针对 Mie0301 株在 34kDa 确认了强反应。 。

33、0069 另一方面， 在使用抗 Nakajima 株血清 ( 图 1C) 和抗 Mie0301 株血清 ( 图 1D) 的情 况下， 对于 Nakajima 株、 Mie0301 株分别在 38kDa、 34kDa 显示出了强条带。 0070 由上述灭活测定和 Westren 印迹的结果可以明确， 舌齿鲈嗜污虫存在至少 3 种血 清型 (serotype I ； Iyo I、 JF05To 株、 RF05To 株、 SK05Kyo 株、 serotypeII ； Nakajima 株、 serotype III ； Mie0301 株 )。 0071 实施例 1 ： 3 种混合疫苗的有效性试验。

34、 0072 (1) 疫苗的制作 说 明 书 CN 102186498 A CN 102186502 A7/9 页 9 0073 (a) 供试鱼 0074 使用了下述的鱼 ： 对于牙鲆的鱼苗200条， 使用乙姬牙鲆用海产种苗用饲料(日清 丸红饲料公司制造 ) 喂食饵料 2 星期， 预备饲养至平均体重 10.3g。 0075 (b) 该虫的培养 0076 将该虫在鱼类细胞系化细胞 CHSE-214 细胞上培养 5 天， 所述鱼类细胞系化细胞 CHSE-214 细胞已经用在 Eagle s MEM 培养基 “NISSUI” ( 日水制药株式会社制 ) 中混合 10胎牛血清 (FBS)、 并用 7.5。

35、的碳酸氢钠水调整至 pH7.3 而得到的培养基培养至单层。 0077 (c) 福尔马林灭活疫苗的制备 0078 在 上 述 培 养 的 该 虫 (Iyo I 株、 Nakajima 株 以 及 Mie0301 株 )1.65106 9.85106细胞中添加 35福尔马林 (Nacalai Tesque 制 )， 使其终浓度为 0.3， 4灭活 一昼夜， 制备了 3 种福尔马林灭活疫苗。而且， 按相同比例加入上述 3 种疫苗， 制备了混合 疫苗。 0079 (2) 疫苗接种 0080 将上述 (1) 制作的福尔马林灭活疫苗 100L 接种于牙鲆 ( 平均体重 10.3g) 腹腔 内， 使得浓度为。

36、 6.76105细胞 / 鱼。然后， 2 个星期后， 作为加强免疫， 以 9.85105细胞 / 鱼的浓度进行了免疫。 0081 此外， 作为对照， 将细胞培养中使用的 MEM 培养基本身 100L 接种于腹腔内。 0082 (3) 安全性试验 0083 疫苗接种后， 将供试鱼收纳在 10L 的水槽中， 流水条件下进行 2 个月的饲养观察， 确认了安全性。在饲养期间， 像上述那样喂食饵料。 0084 (4) 攻击试验 ( 有效性的判定 ) 0085 最终免疫后的第 4 天， 将用混合疫苗免疫的牙鲆 ( 疫苗接种区 ) 和未进行免疫的 牙鲆 ( 对照区 ) 分别分成 4 个区， 以各区 15 条。

37、进行了试验。用 Iyo I 株、 Nakajima 株和 Mie0301 株各株进行了感染。此外， 为了进行比较， 在疫苗接种区和对照区中加入了未用 该虫感染的区。对于 Iyo I 株和 Nakajima 株， 腹腔内接种 100L， 使其为 4.03104细胞 / 鱼。此外， 对于 Mie0301 株， 从预备试验的结果已经明确其病原性比其它两株低， 因此以 4.03105细胞 / 鱼同样地进行腹腔内接种。 0086 疫苗的有效性方面， 通过 (1- 疫苗接种区的死亡率 / 对照区的死亡率 )100的 公式求出有效率。 0087 (5) 试验结果 0088 结果 ( 天数累计死亡率的变化 )。

38、 如图 2(Iyo I 株的攻击 )、 图 3(Nakajima 株的攻 击 )、 图 4(Mie0301 株的攻击 ) 所示。 0089 接种了 3 种混合疫苗的牙鲆对各原生动物的攻击 (Iyo I 株、 Nakajima 株以 及 Mie0301 株 ) 显示出良好的免疫效果， 攻击天数 14 天的有效率分别为 75、 73.3和 92.9。对于 Iyo I 株以及 Nakajima 株， 在 5以下的显著水平上确认存在显著差异。而 对于 Mie0301 株， 在 1以下的显著水平上确认存在显著差异。 0090 比较例 1 ： 单一疫苗的有效性试验 0091 (1) 疫苗的制作 0092 。

39、供试鱼和该虫的培养按照实施例那样的方法进行。福尔马林灭活疫苗的制备如 说 明 书 CN 102186498 A CN 102186502 A8/9 页 10 下 ： 在上述培养的该虫 (Iyo I 株、 Nakajima 株以及 Mie0301 株 )1.65106 9.85106细 胞中加入 35福尔马林 (Nacalai Tesque 制 )， 使其终浓度为 0.3， 4灭活一昼夜， 制备 了 3 种福尔马林灭活疫苗。 0093 (2) 疫苗接种 0094 将上述(1)制作的3种福尔马林灭活疫苗100L接种于牙鲆(平均体重10.05g) 腹腔内， 使得其浓度为 1.65105细胞 / 鱼。。

40、而且， 2 个星期后， 作为加强免疫， 以 3105细 胞 / 鱼的浓度进行了免疫。 0095 此外， 作为对照， 将细胞培养中使用的 MEM 培养基本身 100L 接种于腹腔内。 0096 (3) 安全性试验 0097 疫苗接种后， 将供试鱼收纳于 10L 的水槽中， 流水条件下进行 2 个月的饲养观察， 确认了安全性。饲养期间像上述那样喂食饵料。 0098 (4) 攻击试验 ( 有效性的判定 ) 0099 最终免疫后的第4天， 将用3种福尔马林灭活疫苗分别免疫的牙鲆(疫苗接种区) 和未进行免疫的牙鲆 ( 对照区 ) 分别分成 16 区 ( 各 4 区 )， 以各区 15 条进行了试验。用 。

41、Iyo I 株、 Nakajima 株和 Mie0301 株各株进行了感染。感染效价是腹腔内接种 100L， 使 其为 6.12105细胞 / 鱼。 0100 疫苗的有效性方面， 通过 (1- 疫苗接种区的死亡率 / 对照区的死亡率 )100的 公式求出有效率。 0101 (5) 试验结果 0102 结果 ( 天数累计死亡率的变化 ) 如图 5(Iyo I 株的攻击 )、 图 6(Nakajima 株的攻 击 )、 图 7(Mie0301 株的攻击 ) 所示。 0103 接种了 Iyo I 株的疫苗的牙鲆对各原生动物的攻击 (Iyo I 株、 Nakajima 株以及 Mie0301株)的攻击。

42、天数13天的有效率分别为41.7、 0和0， 虽然是相同血清型， 但效 果差。相对于对照区， 仅 Iyo I 株在 1以下的显著水平上确认存在显著差异。 0104 此外， 接种了Nakajima株的疫苗的牙鲆对各原生动物的攻击(Iyo I株、 Nakajima 株以及 Mie0301 株 ) 的攻击天数 13 天的有效率为 0、 21.4和 0， 虽然是相同血清型， 但效果差。相对于对照区， 所有株均没有显著差异。 0105 此外， 接种了 Mie0301 株的疫苗的牙鲆对各原生动物的攻击 (Iyo I 株、 Nakajima 株以及 Mie0301 株 ) 的攻击天数 13 天的有效率分别为。

43、 33.3、 25.0和 33.3， 虽然是相 同血清型， 但效果差。相对于对照区， 仅 Mie0301 株和 Iyo I 株在 5以下的显著水平上确 认存在显著差异。 0106 实施例 2 ： 高浓度一次免疫的 3 种混合疫苗的有效性试验 0107 (1) 疫苗的制作 0108 (a) 供试鱼 0109 使用下述的鱼 ： 对于牙鲆的鱼苗160条， 使用乙姬牙鲆用海产种苗用饲料(日清丸 红饲料公司制造 ) 喂食饵料 2 个星期， 预备饲养至平均体重 12.5g。 0110 (b) 该虫的培养 0111 将该虫在鱼类细胞系化细胞 CHSE-214 细胞上培养 5 天， 所述鱼类细胞系化细胞 CH。

44、SE-214 细胞已经用在 Eagle s MEM 培养基 “NISSUI” ( 日水制药株式会社制 ) 中混合 说 明 书 CN 102186498 A CN 102186502 A9/9 页 11 10胎牛血清 (FBS)、 并用 7.5的碳酸氢钠水调整至 pH7.3 而得到的培养基培养至单层。 0112 (c) 福尔马林灭活疫苗的制备 0113 在上述培养的该虫 (Iyo I 株、 Nakajim 株以及 Mie030 株 )4.30106 8.85106 细胞中加入 35福尔马林 (Nacalai Tesque 制 )， 使其终浓度为 0.3， 4灭活一昼夜， 制 备了 3 种福尔马林。

45、灭活疫苗。而且， 按相同比例加入上述的 3 种疫苗， 制备了混合疫苗。 0114 (2) 疫苗接种 0115 将上述(1)制作的各种福尔马林灭活疫苗100L接种于牙鲆的腹腔内， 使得其浓 度为 2.15106细胞 / 鱼。 0116 此外， 作为对照， 将细胞培养中使用的 MEM 培养基本身 100L 接种于腹腔内。 0117 (3) 安全性试验 0118 疫苗接种后， 将供试鱼收纳于 10L 的水槽中， 流水条件下进行 2 个月的饲养观察， 确认了安全性。饲养期间像上述那样喂食饵料。 0119 (4) 攻击试验 ( 有效性的判定 ) 0120 免疫后的第 11 天， 将用混合疫苗免疫的牙鲆 。

46、( 疫苗接种区 ) 和未进行免疫的牙鲆 ( 对照区 ) 分别分成 2 个区， 以各区 30 条进行了试验。以 3.6105细胞 / 鱼腹腔内接种 Iyo I 株来进行了感染。此外， 在疫苗接种区和对照区中加入了未感染该虫的区。 0121 在疫苗的有效性方面， 通过 (1- 疫苗接种区的死亡率 / 对照区的死亡率 )100 的公式求出有效率。 0122 (5) 试验结果 0123 结果 ( 天数累计死亡率的变化 ) 如图 8 所示。 0124 接种了 3 种混合疫苗的牙鲆对 Iyo I 株的攻击显示良好的免疫效果， 攻击天数 14 天的有效率分别为68.5， 在5以下的显著水平上确认存在显著差异。

47、。 3种混合疫苗和对 照区的非感染区中未确认到死亡， 因而从图 8 中省略。 0125 以上， 说明了本发明的具体实施方式， 对本领域技术人员而言显而易见的变形和 改良也包含在本发明的范围内。 说 明 书 CN 102186498 A CN 102186502 A1/4 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102186498 A CN 102186502 A2/4 页 13 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102186498 A CN 102186502 A3/4 页 14 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102186498 A CN 102186502 A4/4 页 15 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 102186498 A 。