技术领域
本发明涉及一种植物美白剂及其制备方法。
背景技术
还原型维生素C在美容方面具有淡化色斑、促进胶原蛋白合成、抗氧化、抗衰 老和防护皮肤等美容功效。由于维生素C具有还原性，对黑色素中间体起还原作用， 可以抑制酪氨酸酶或多巴色素互变酶的活性，从而阻碍黑色素形成过程中各点上的 氧化链反应，减少已形成的色素沉积，如黑斑、雀斑等，活化胶原合成过程，干扰 过氧化脂质的形成，从而起到美白皮肤的作用。
目前，维生素C大部分是通过工业合成或两步发酵法生产，而“绿色、自然与 环保”已成为全球日化、食品等非耐用消费品业的主流呼声，从日常食用的瓜果蔬 菜中摄取人体所需的各种微量元素，既能抗衰老、润肌肤，而且又绿色天然、经济 实惠。西印度樱桃冻干粉中富含维生素C以及糖、蛋白和各种矿物质，具有很好的 美白功效，但又因其中含有丰富的植物纤维等物质，不能直接作为化妆品的添加剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物美白剂及其制备方法。
本发明所提供的植物美白剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将西印度樱桃冻干粉和水混合，搅拌，过滤，收集滤液，得到樱桃粉提取 液；
2)将上述步骤1)的樱桃粉提取液进行离子交换层析，以脱盐和脱色，收集流 出液，得到植物美白剂。
上述方法中，所述步骤1)中，所述西印度樱桃冻干粉和水的质量比为1： (9-12)，具体可为1：10。
上述步骤1)中，所述过滤是将西印度樱桃冻干粉和水的混合液用硅藻土进行 过滤。
上述方法中，所述步骤2)中，所述离子交换层析是用阳离子树脂T212和阴离 子树脂T112进行的。
上述方法还包括在植物美白剂中加入甘油的步骤，所述植物美白剂和所述甘油 的质量比为1：0.3。
上述方法还包括将所述植物美白剂和所述甘油的混合液进行灭菌的步骤，所述 灭菌条件为90℃灭菌20min。
上述方法还包括将灭菌后的混合液冷却，然后在冷却的混合液中加入L.G.P防 腐剂的步骤；所述L.G.P和所述混合液的质量比为1：167。
采用上述方法制备的植物美白剂也属于本发明的保护范围。
本发明的植物美白剂的制备方法，不需要有机试剂，提取分离方法简便，得到 一种天然还原型维生素C相对稳定的体系；采用本发明方法制备的美白剂质量稳 定，美白功效显著。
附图说明
图1为植物美白剂的生产工艺流程图
图2为植物美白剂对L-酪氨酸酶的活性抑制率实验结果
图3为植物美白剂清除超氧阴离子自由基实验结果
图4为植物美白剂清除羟自由基实验结果
图5为植物美白剂清除DPPH自由基实验结果
具体实施方式
实施例1、植物美白剂的生产
植物美白剂的生产工艺流程如图1所示，具体过程如下：
1)将100g西印度樱桃冻干粉(购自广西金红果农业综合开发有限公司)和1L 煮沸并静置冷却至室温的去离子水以1：10的质量比混合，常温(20—25℃)下搅 拌1h，以不出现沉淀为指标，得到西印度樱桃冻干粉的水溶液；
2)将上述西印度樱桃冻干粉的水溶液5000转/分离心10分钟，得到的上清液 用硅藻土进行过滤，收集滤液，得到澄清透亮淡黄色的樱桃粉提取液；
3)将上述樱桃粉提取液分别过阳离子树脂T212和阴离子树脂T112(树脂均购 自辽宁丹东明珠特种树脂有限公司)，以脱盐和降低其电导率，收集流出液；
4)将上述步骤3)的流出液和甘油混合，使混合液中甘油的质量百分含量为 23％；
5)将上述步骤4)获得的混合液于90℃灭菌20分钟；
6)将上述步骤5)的混合液冷却至40℃以下，加入L.G.P(丙二醇/双咪唑烷 基脲/碘代丙炔基丁基甲胺酸酯，购自美国ISP公司)，使L.G.P和混合液的质量比 为1：167，混合均匀，得到植物美白剂；将得到的植物美白剂的用不透明的容器罐 装。
钼酸铵经还原剂Vc还原后，可以生成亮蓝色的络合物，通过建立Vc与吸光度 之间的标准曲线方程，采用分光比色可以测定上述获得的植物美白剂中还原型Vc 的含量。结果表明，上述获得的植物美白剂中还原型Vc的含量为9.3mg/ml。
实施例2、植物美白剂的功能实验
1、植物美白剂对L-酪氨酸酶的活性抑制率实验
酪氨酸酶是黑素形成过程中主要的限速酶，该酶的活性大小决定着黑素形成的 数量，当前化妆品市场上的美白产品绝大多数以酪氨酸酶抑制剂为主。L-酪氨酸酶 与其底物L-酪氨酸可以发生催化反应，当在反应体系中添加有L-酪氨酸酶活性抑 制作用的试剂后，对催化反应可以产生抑制作用，通过测定添加有L-酪氨酸酶活性 抑制作用的试剂前后475nm处吸光度值的变化，来评价该有L-酪氨酸酶活性抑制 作用的试剂对L-酪氨酸酶活性的抑制率。具体实验过程如下：
称取17.91g十二水磷酸氢二钠溶于500mL蒸馏水中，得到溶液a；称取7.8g 二水磷酸二氢钠溶于500mL蒸馏水中，得到溶液b；将92.6mL溶液a和107.4mL 溶液b混合，得到200mL pH为6.8的PBS缓冲溶液。
称取0.05g L-酪氨酸，先用少量0.1mol/L的盐酸溶解，待其溶解后用上述配制 的pH为6.8的PBS缓冲液定容至100mL。
实验过程中，各组中各物质的加入量如表1所示。
表1 植物美白剂对L-酪氨酸酶的活性抑制实验中各物质的加入量
注：C1组和T1组均加入0.5mL酪氨酸酶，酶活为100U/mL。
C0组各溶液配好摇匀后，在37℃水浴锅中水浴加热10min，波长475nm下调 零。C1组溶液配好摇匀后，37℃水浴10min后加入0.5ml酶活为100U/mL的酪氨 酸酶，继续水浴10分钟，测定吸光度值。
T0组各溶液配好摇匀后，在37℃水浴锅中水浴加热10min，波长475nm下调 零。T1组溶液配好摇匀后，37℃水浴10min后加入0.5ml酶活为100U/mL的酪氨酸 酶，继续水浴10分钟，测定吸光度值。
计算酪氨酸酶的活性抑制率T(％)，T(％)＝(C1-T1)/C1×100％。
实验设三次重复，三次重复的平均结果如图2所示。结果表明，当上述实施例 1制备的植物美白剂的浓度为2％(即Vc的含量为186ug/ml)，加入量为1ml时， 对酪氨酸酶活性的抑制率达到98.4％；当上述实施例1制备的植物美白剂的浓度为 2.5％(即Vc的含量为232.5ug/ml)，加入量为1ml时，对酪氨酸酶活性的抑制率 达到99.1％。所以，当上述实施例1制备的植物美白剂的浓度为2％(即Vc的含量 为186ug/ml)，加入量为1ml时，基本可以完全抑制酪氨酸酶的活性，因此美白效 果很好。
2、清除超氧阴离子自由基实验
取0.05mol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.5ml，置于25℃水浴中预热20min，分别 加入1ml不同浓度的上述实施例1制备的植物美白剂和0.4ml 25mmol/L的邻苯三酚溶 液，混匀后于25℃水浴中反应5min，加入1.0ml 8mol/L的HCl终止反应，以Tris-HCl 缓冲液作参比，在299nm处测定吸光度，计算清除率。空白对照组以1ml去离子水代 替样品，每个处理均做三个重复。
清除率的计算公式：超氧阴离子自由基清除率(％)＝100(A1-A2)/A1，其中A1为空 白对照的平均吸光度，A2为植物美白剂的平均吸光度。
上述实施例1制备的植物美白剂对超氧阴离子自由基的清除作用结果如图3所 示。结果表明，随着植物美白剂浓度的增大，对超氧阴离子自由基的清除作用也逐 渐增强，当植物美白剂稀释20倍，即其中Vc含量为465μg时，对超氧阴离子自由 基的清除率为90.3％；而Vc含量相同的标准Vc溶液对超氧阴离子自由基的清除率 为87.8％。当上述实施例1制备的植物美白剂稀释100倍-25倍时，即Vc含量为 93-372μg时，植物美白剂对超氧阴离子自由基的清除能力要明显高于Vc含量相同 的标准分析纯Vc溶液，其原因可能是上述实施例1制备的植物美白剂中还含有其 他的抗氧化物质，和植物美白剂中的Vc共同作用清除超氧阴离子自由基。
3、清除羟自由基(·OH)实验
羟基自由基是活性氧中化学性质最活泼的自由基，它几乎能与活细胞中任何生 物大分子发生反应，且反应速度极快，是对机体危害最大的自由基。通过测定水杨 酸捕获羟自由基所得到的产物来确定羟自由基的清除率，反应体系中若加入具有清 除羟自由基作用的物质即可降低反应液的吸光度值。因此可通过分光光度法来描述 羟自由基的量及待测物质清除羟基自由基的能力。具体实验过程如下：
取稀释50倍的上述实施例1制备的植物美白剂(其中Vc的浓度为186μg/ml)。 羟基自由基由Fenton反应产生，·OH氧化水杨酸产生对510nm光有特征吸收的2， 3-二羟基苯甲酸，通过测定水杨酸捕获·OH所得到的产物确定·OH的清除率。在25ml 比色管中加入3ml2mmol/L FeSO4和3ml1mmol/L H2O2，摇匀，接着再加入3ml 6mmol/L水杨酸，摇匀，于37℃水浴加热15min后取出，测定其吸光度A0。然后 分别加入浓度为2％的上述实施例1制备的植物美白剂0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml 和1.0ml，然后再分别加入蒸馏水0.8ml、0.6ml、0.4ml、0.2ml、0ml，摇匀，继续 水浴加热15min，取出测定其吸光度Ax。为消除后加的共1.0ml植物美白剂和蒸馏 水所造成的体系吸光度值的降低，采用上述相同方法，恒温15min后测定其吸光度 值A00，然后再加入1ml蒸馏水，摇匀后再测一次其吸光度Axx，A降低＝A00—Axx。
植物美白剂对·OH清除率为：·OH清除率(％)＝100(A0—Ax—A降低)/A0。
上述实施例1制备的植物美白剂对羟自由基的清除作用结果如图4所示。结果 表明，当加入0.8ml(Vc含量为148.8μg)稀释50倍的上述实施例1制备的植物美 白剂后，对羟自由基的清除率达到92.2％；而加入Vc含量为148.8μg的标准Vc溶 液后，对羟自由基的清除率仅为63.6％。从图4中可以看出，相同的Vc含量，上 述实施例1制备的植物美白剂对羟自由基的清除能力明显高于标准Vc溶液。
4、清除DPPH自由基(DPPH·)实验
DPPH·是一种很稳定的以氮为中心的自由基，若提取物能将其清除，则提示提取 物具有降低羟自由基、烷自由基或氧化自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链反应 的作用。DPPH·在有机溶剂中非常稳定，呈紫色，在517nm处有一个特征吸收峰，当 其遇到自由基清除剂时，DPPH·的孤电子被配对，使其颜色变浅，在最大吸收波长处 的吸光度变小。因此，可通过测定吸光度的变化来评价其对DPPH·的清除效果。
准确称取20mg DPPH·(sigma公司)，用无水乙醇定容至250ml容量瓶中，得到 浓度为20mmol/L的DPPH·溶液，将上述实施例1制备的植物美白剂分别用蒸馏水稀 释成不同浓度的测试液。分别取2ml不同浓度的测试液及2ml 20mmol/L DPPH·，混 匀后反应30min，测定517nm波长下吸光度的变化，对照溶剂用无水乙醇代替，按下 式计算抑制率。
抑制率(％)＝[1-(Ai—Aj)/Ac]×100。
式中，Ai为2ml DPPH·液与2ml不同浓度的测试液组成的混合液的吸光度；Aj为2ml不同浓度的测试液与2ml无水乙醇组成的混合液的吸光度；Ac为2ml DPPH·液 与2ml无水乙醇组成的混合液的吸光度。
上述实施例1制备的植物美白剂对DPPH·的清除作用结果如图5所示。结果表 明，上述实施例1制备的植物美白剂的浓度越大，对DPPH·的清除能力越强，当植 物美白剂中的Vc含量为18.6μg时，即植物美白剂稀释500倍，对DPPH·的清除率 为57％，而达到同样的DPPH·清除率，标准Vc溶液中Vc的含量需要为27.9μg。 并且Vc含量在37.2μg以下时，植物美白剂对DPPH·的清除率要明显高于标准Vc 溶液，这表明上述实施例1制备的植物美白剂具有很好的清除DPPH·的能力，同时 也表明，上述实施例1制备的植物美白剂中不但有Vc在起作用，也可能含有其他 抗氧化成分，是它们共同作用的结果。通过以上实验可以看出，低浓度的上述实施 例1制备的植物美白剂即具有很好的抗衰老功效。