克咳胶囊的质量控制方法
技术领域：本发明涉及一种克咳胶囊的质量控制方法，属于对药品进行质量控制的技术 领域。
背景技术：克咳胶囊早在1998年就刊登在《中药成方制剂》十七册中。克咳胶囊主要由 麻黄、罂粟壳、甘草、苦杏仁、莱菔子、桔梗、石膏组成，用于咳嗽，喘急气短等。由于其 疗效确切，深受广大患者的欢迎，是人们日常生活中的常备药品。但克咳胶囊原有的质量标 准中只收载了麻黄和甘草的薄层色谱鉴别，无含量测定指标，存在着质量控制标准简单，不 能很好地控制成品质量的缺点。罂粟壳为本方中的主药，敛肺止咳；主要用于肺虚久咳，纯 虚无邪者。因其有效成分吗啡类生物碱具有成瘾性，不宜过量及持续服用。因此为更好地控 制克咳胶囊的内在质量，对制剂中吗啡的含量检测显得非常必要。
发明内容：
本发明的目的在于：提供一种克咳胶囊的质量控制方法。本发明针对现有质量控制标准 的不足，对克咳胶囊的质量控制方法进行了研究，补充建立了吗啡的含量测定方法，提高了 克咳胶囊的质量控制标准，从而切实保证了该药物的临床疗效和广大患者的身体健康。
本发明所述克咳胶囊是这样构成的：按照重量组份计算：它主要由麻黄120-240、罂粟 壳120-240、甘草120-240、苦杏仁120-240、莱菔子30-80、桔梗30-80和石膏30-80制备而成 。其制备方法为：以上七味，麻黄和罂粟壳粉碎成细粉，过筛，各留细粉83g备用，剩余粗 粉用酸性水溶液(用10％盐酸溶液调PH值至5左右)煎煮二次，每次2小时，滤过，滤液用 10％氢氧化钠溶液调PH值至7，药液备用；其余甘草等五味加水煎煮二次，每次1小时，滤过 ，滤液与上述溶液合并，浓缩至稠膏状，加入麻黄和罂粟壳细粉，加入适量碳酸钙或微晶纤 维素，混匀，在60～70℃干燥，粉碎成细粉或制成颗粒，干燥，装入胶囊，制成1000粒，即 得。
本发明所述质量控制方法主要包括性状、鉴别、检查以及含量测定项目中的部分或全部 ；其中鉴别包括显微观察、麻黄和甘草的薄层色谱鉴别；含量测定是对制剂中罂粟壳所含吗 啡的含量测定。
其中麻黄的鉴别方法是以盐酸麻黄碱对照品为对照，以氯仿∶甲醇∶浓氨试液 ＝5-15∶0.5-4∶0.05-1为展开剂的薄层色谱法。甘草的鉴别方法是以甘草次酸对照品为对照， 以30～60℃石油醚∶苯∶醋酸乙酯∶冰醋酸＝5-15∶10-30∶3-10∶0.2-0.8为展开剂的薄层色谱法
鉴别方法包括以下项目的部分或全部：
(1)取本制剂，置显微镜下观察：外果皮细胞呈五角形或类长方形，壁呈念珠状增厚， 保卫细胞侧面观呈哑铃状。
(2)取本制剂内容物，研细，加氨试液数滴，拌匀，加氯仿，冷浸过夜，滤过，滤液加 稀盐酸，振摇，分取酸水层，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取盐酸麻黄碱 对照品，加甲醇制成溶液，作为对照品溶液；照中国药典附录VI B薄层色谱法试验，吸取上 述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶甲醇∶浓氨试液 ＝5-15∶0.5-4∶0.05-1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.3％茚三酮正丁醇溶液∶醋酸 ＝15-25∶0.5-2混合溶液，在105℃加热5分钟；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上 ，显相同颜色的斑点。
(3)取本制剂内容物，研细，加盐酸与氯仿，置水浴中加热回流，放冷，滤过，滤液蒸 干，残渣加乙醇使溶解，作为供试品溶液；另取甘草次酸对照品，加乙醇制成溶液，作为对 照品溶液；照中国药典附录VI B薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各4ul，分别点于同一 硅胶G薄层板上，以30～60℃石油醚∶苯∶醋酸乙酯∶冰醋酸＝5-15∶10-30∶3-10∶0.2-0.8为展开 剂，展开，取出，晾干，喷以10％磷钼酸乙醇溶液，在105℃加热5分钟；供试品色谱中，在 与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
具体的鉴别方法包括以下项目的部分或全部：
(1)取本制剂，置显微镜下观察：外果皮细胞呈五角形或类长方形，壁呈念珠状增厚， 保卫细胞侧面观呈哑铃状。
(2)取本制剂内容物3g，研细，加氨试液数滴，拌匀，加氯仿20ml，冷浸过夜，滤过， 滤液加稀盐酸5ml，振摇，分取酸水层，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另 取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典附录VI B薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶甲醇 ∶浓氨试液＝5-15∶0.5-4∶0.05-1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.3％茚三酮正丁醇溶液 ∶醋酸＝15-25∶0.5-2混合溶液，在105℃加热5分钟；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的 位置上，显相同颜色的斑点。
(3)取本制剂内容物2g，研细，加盐酸1ml与氯仿20ml，置水浴中加热回流1小时，放冷 ，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草次酸对照品，加乙 醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典附录VI B薄层色谱法试验，吸取上 述两种溶液各4ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以30～60℃石油醚∶苯∶醋酸乙酯∶冰醋酸 ＝5-15∶10-30∶3-10∶0.2-0.8为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％磷钼酸乙醇溶液，在 105℃加热5分钟；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
罂粟壳中吗啡的含量测定方法是以吗啡对照品为对照，以甲醇∶0.5％醋酸铵水溶液∶ 1％三乙胺＝20-30∶60-80∶0.5-2为流动相的高效液相色谱法。
吗啡的具体含量测定方法为：
照中国药典附录VI D高效液相色谱法测定：
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇∶0.5％醋酸铵 水溶液∶1％三乙胺＝20-30∶60-80∶0.5-2为流动相；检测波长为150-280nm；流速为： 0.5-3ml/min；理论板数按吗啡峰计，应不低于3000。
对照品溶液的制备 取吗啡对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含40ug的溶液， 即得。
供试品溶液的制备 取装量差异项下的内容物，研细，置具塞锥形瓶中，加入二氯甲烷 ，氨水，超声处理；放冷，滤过，残渣用少量二氯甲烷洗涤三次，滤过，合并二氯甲烷液， 水浴挥干二氯甲烷，残渣加甲醇使溶解，并定量转移至量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀， 用0.45um微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，计算，即得 。
本胶囊剂每粒含吗啡C17H19O3N为0.03～0.30mg。
更具体的吗啡含量测定方法为：
照中国药典附录VI D高效液相色谱法测定：
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇∶0.5％醋酸铵 水溶液∶1％三乙胺＝20-30∶60-80∶0.5-2为流动相；检测波长为150-280nm；流速为： 0.5-3ml/min；理论板数按吗啡峰计，应不低于3000。
对照品溶液的制备 取吗啡对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含40ug的溶液， 即得。
供试品溶液的制备 取装量差异项下的内容物，研细，取0.5g，精密称定，置50ml具 塞锥形瓶中，加入30ml二氯甲烷，1ml氨水，超声处理30分钟；放冷，滤过，残渣用少量二 氯甲烷洗涤三次，滤过，合并二氯甲烷液，水浴挥干二氯甲烷，残渣加甲醇使溶解，并定量 转移至5ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45um微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，计算，即得 。
本胶囊剂每粒含吗啡C17H19O3N为0.03～0.30mg。
本发明所述质量控制方法包括：
性状：内容物为棕黄色至棕褐色的粉末或颗粒；味微苦。
鉴别：(1)取本制剂，置显微镜下观察：外果皮细胞呈五角形或类长方形，壁呈念珠状 增厚，保卫细胞侧面观呈哑铃状；
(2)取本制剂内容物，研细，加氨试液数滴，拌匀，加氯仿，冷浸过夜，滤过，滤液加 稀盐酸，振摇，分取酸水层，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取盐酸麻黄碱 对照品，加甲醇制成溶液，作为对照品溶液；照中国药典附录VI B薄层色谱法试验，吸取上 述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶甲醇∶浓氨试液 ＝5-15∶0.5-4∶0.05-1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.3％茚三酮正丁醇溶液∶醋酸 ＝15-25∶0.5-2混合溶液，在105℃加热5分钟；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上 ，显相同颜色的斑点；
(3)取本制剂内容物，研细，加盐酸与氯仿，置水浴中加热回流，放冷，滤过，滤液蒸 干，残渣加乙醇使溶解，作为供试品溶液；另取甘草次酸对照品，加乙醇制成溶液，作为对 照品溶液；照中国药典附录VI B薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各4ul，分别点于同一 硅胶G薄层板上，以30～60℃石油醚∶苯∶醋酸乙酯∶冰醋酸＝5-15∶10-30∶3-10∶0.2-0.8为展开 剂，展开，取出，晾干，喷以10％磷钼酸乙醇溶液，在105℃加热5分钟；供试品色谱中，在 与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
检查：照中国药典附录IX H水分测定法第一法测定，不得超过12.0％；
其它各项应符合中国药典附录IL胶囊剂项下有关的各项规定。
含量测定：照中国药典附录VI D高效液相色谱法测定：
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇∶0.5％醋酸铵 水溶液∶1％三乙胺＝20-30∶60-80∶0.5-2为流动相；检测波长为150-280nm；流速为： 0.5-3ml/min；理论板数按吗啡峰计，应不低于3000；
对照品溶液的制备 取吗啡对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含40ug的溶液， 即得；
供试品溶液的制备 取装量差异项下的内容物，研细，置具塞锥形瓶中，加入二氯甲烷 ，氨水，超声处理；放冷，滤过，残渣用少量二氯甲烷洗涤三次，滤过，合并二氯甲烷液， 水浴挥干二氯甲烷，残渣加甲醇使溶解，并定量转移至量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀， 用0.45um微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，计算，即得 ；
本胶囊剂每粒含吗啡C17H19O3N为0.03～0.30mg。
申请人经研究发现，采用以下质量控制方法将更容易控制克咳胶囊的质量，更利于保证 制剂的临床疗效。故所述质量控制方法还可包括：
性状：内容物为棕黄色至棕褐色的粉末或颗粒；味微苦。
鉴别：(1)取本制剂，置显微镜下观察：外果皮细胞呈五角形或类长方形，壁呈念珠状 增厚，保卫细胞侧面观呈哑铃状；
(2)取本制剂内容物3g，研细，加氨试液数滴，拌匀，加氯仿20ml，冷浸过夜，滤过， 滤液加稀盐酸5ml，振摇，分取酸水层，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另 取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典附录VI B薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶甲醇 ∶浓氨试液＝5-15∶0.5-4∶0.05-1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.3％茚三酮正丁醇溶液 ∶醋酸＝15-25∶0.5-2混合溶液，在105℃加热5分钟；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的 位置上，显相同颜色的斑点；
(3)取本制剂内容物2g，研细，加盐酸1ml与氯仿20ml，置水浴中加热回流1小时，放冷 ，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草次酸对照品，加乙 醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典附录VI B薄层色谱法试验，吸取上 述两种溶液各4ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以30～60℃石油醚∶苯∶醋酸乙酯∶冰醋酸 ＝5-15∶10-30∶3-10∶0.2-0.8为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％磷钼酸乙醇溶液，在 105℃加热5分钟；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
检查：照中国药典附录IX H水分测定法第一法测定，不得超过12.0％；
其它各项应符合中国药典附录IL胶囊剂项下有关的各项规定。
含量测定：照中国药典附录VI D高效液相色谱法测定：
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇∶0.5％醋酸铵 水溶液∶1％三乙胺＝20-30∶60-80∶0.5-2为流动相；检测波长为150-280nm；流速为： 0.5-3ml/min；理论板数按吗啡峰计，应不低于3000；
对照品溶液的制备取吗啡对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含40ug的溶液， 即得；
供试品溶液的制备 取装量差异项下的内容物，研细，取0.5g，精密称定，置50ml具塞 锥形瓶中，加入30ml二氯甲烷，1ml氨水，超声处理30分钟；放冷，滤过，残渣用少量二氯 甲烷洗涤三次，滤过，合并二氯甲烷液，水浴挥干二氯甲烷，残渣加甲醇使溶解，并定量转 移至5ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45um微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，计算，即得 ；
本胶囊剂每粒含吗啡C17H19O3N为0.03～0.30mg。
经研究发现，以下质量控制方法为最优选择，更容易控制克咳胶囊的质量，保证其临床 疗效。故所述质量控制方法还可以包括：
性状：内容物为棕黄色至棕褐色的粉末或颗粒；味微苦。
鉴别：(1)取本制剂，置显微镜下观察：外果皮细胞呈五角形或类长方形，壁呈念珠状 增厚，保卫细胞侧面观呈哑铃状；
(2)取本制剂内容物3g，研细，加氨试液数滴，拌匀，加氯仿20ml，冷浸过夜，滤过， 滤液加稀盐酸5ml，振摇，分取酸水层，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另 取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典附录VI B薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶甲醇 ∶浓氨试液＝10∶2∶0.1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.3％茚三酮正丁醇溶液∶醋酸 ＝19∶1混合溶液，在105℃加热5分钟；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相 同颜色的斑点；
(3)取本制剂内容物2g，研细，加盐酸1ml与氯仿20ml，置水浴中加热回流1小时，放冷 ，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草次酸对照品，加乙 醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典附录VI B薄层色谱法试验，吸取上 述两种溶液各4ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以30～60℃石油醚∶苯∶醋酸乙酯∶冰醋酸 ＝10∶20∶7∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％磷钼酸乙醇溶液，在105℃加热5分钟 ；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
检查：照中国药典附录IX H水分测定法第一法测定，不得超过12.0％；
其它各项应符合中国药典附录IL胶囊剂项下有关的各项规定。
含量测定：照中国药典附录VI D高效液相色谱法测定：
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇∶0.5％醋酸铵 水溶液∶1％三乙胺＝25∶74∶1为流动相；检测波长为215nm；流速为：1.0ml/min；理论板数按 吗啡峰计，应不低于3000；
对照品溶液的制备 取吗啡对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含40ug的溶液， 即得；
供试品溶液的制备 取装量差异项下的内容物，研细，取0.5g，精密称定，置50ml具 塞锥形瓶中，加入30ml二氯甲烷，1ml氨水，超声处理30分钟；放冷，滤过，残渣用少量二 氯甲烷洗涤三次，滤过，合并二氯甲烷液，水浴挥干二氯甲烷，残渣加甲醇使溶解，并定量 转移至5ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45um微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，计算，即得 ；
本胶囊剂每粒含吗啡C17H19O3N为0.03～0.30mg。
本发明质量控制方法是经过大量的筛选试验得到的最佳方案，以下实验研究为本发明的 优选过程：
吗啡含量测定方法研究：
1、供试品溶液制备方法研究
方法1：取克咳胶囊的内容物，研细，取0.5g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，加入 30ml二氯甲烷，1ml氨水，超声处理30分钟。放冷，滤过，残渣用少量二氯甲烷洗涤三次， 滤过，合并二氯甲烷液，水浴挥干二氯甲烷，残渣加甲醇使溶解，并定量转移至5ml量瓶中 ，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用微了L滤膜(0.45um)滤过，取续滤液，即得。
方法2：取克咳胶囊内容物，研细，取0.5g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，加入 1ml氨水，25ml氯仿，超声处理1h。放冷，滤过，残渣用少量氯仿洗涤3次，滤过，合并氯仿 液，水浴挥干氯仿，残渣加甲醇使溶解，并定量转移至5ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇 匀，用微孔滤膜(0.45um)滤过，取续滤液作为供试品溶液。
样品 方法1(mg/g) 方法2(mg/g) 1 0.0658 0.0452 2 0.0629 0.0495 3 0.0680 0.0510
根据试验结果可知，采用方法1制备供试品溶液，吗啡提取更为完全。
2、流动相的选择：
流动相1：以0.012mol·L-1磷酸二氢钾乙腈(90∶10，含0.05mmol·L-1三乙胺)为流 动相
流动相2：以甲醇-0.5％醋酸铵水溶液-1％三乙胺(25∶74∶1)为流动相
流动相3：以0.1mol·L-1磷酸二氢钠-甲醇(78∶22)为流动相
流动相4：以A为含0.15％的醋酸的0.01mol/L的庚烷磺酸钠溶液，B为10％乙腈和90％甲醇 的混合溶液，A：B＝40：60为流动相
结果：以甲醇-0.5％醋酸铵水溶液-1％三乙胺(25∶74∶1)为流动相；阴性样品色谱图 在吗啡位置处无干扰峰，吗啡和相近的杂质峰分离完全(分离度＞1.5)，即在该条件下吗 啡与其他组分分离完全。因此最佳流动相为：甲醇-0.5％醋酸铵水溶液-1％三乙胺(25∶74∶ 1)。
3、重复性实验：
取克咳胶囊，按本发明所述质量控制方法含量测定项下供试液的制备方法制备5份供试 液，按上述色谱条件进行测定，吗啡平均含量0.0669mg/g，其中RSD％＝0.88％，方法重现性良 好。
制剂供试品中吗啡的重现性试验
进样次数 1 2 3 4 5 平均值 RSD(％) 含量(mg/g) 0.0676 0.0662 0.0678 0.0674 0.0658 0.0669 0.88
根据结果可见，该方法重现性良好。
4、回收率实验
取已知含量的样品5份，每份约0.3g，精密称定，置50ml具塞三角瓶中，分别精密添加 吗啡对照品溶液(0.0104mg/ml)2ml，照供试品溶液制备方法操作，制作加样回收供试品液 。测定吗啡含量，测得平均加样回收率为97.21％，RSD％＝1.55％。
实验 次数 样品量 (g) 含吗啡量 (mg) 加入吗啡量 (mg) 测得量 (mg) 回收率 (％) 平均回收率 (％) RSD(％) 1 2 3 4 5 0.3012 0.2988 0.3010 0.2985 0.2978 0.0201 0.0199 0.0201 0.0199 0.0199 0.0208 0.0399 0.0397 0.0394 0.0398 0.0393 97.55 97.54 96.33 97.78 96.56 97.15 1.55
本申请人还进行了如下的实验：
吗啡成瘾性研究
1材料与方法
(1)动物分组：大鼠Wistar种，70只，♀♂各半，体重180～220g，分为7组，每组 10只。一组为空白对照组，其余为实验组，自由摄食、饮水。
(2)给药方法：灌胃实验组大鼠40％的盐酸吗啡，1～6组每组每次分别灌胃5ul、10ul 、25ul、50ul、100ul、125ul，每天2次，连续4d。对照组灌胃等体积生理盐水。
(3)判断大鼠吗啡成瘾的指标：每只大鼠观察戒断症状20min。直接记录戒断症状：咬 牙的阵数、直立、理毛、湿狗样抖动、伸展、舔阴等的次数。
2结果
观察吗啡成瘾大鼠与对照组戒断症状的结果，见下表。
吗啡成瘾大鼠和对照组戒断症状(x±s)
与对照组相比较*P＜0.05，**P＜0.01。
由结果可见，第6组大鼠钠洛酮诱发戒断症状结果与对照组结果统计学处理显示组间差 异很显著P＜0.01；2、3、4、5组大鼠钠洛酮诱发戒断症状结果与对照组结果统计学处理显 示P＜0.05；第1组与对照组无显著差异。
克咳胶囊药效学研究
1试验
受试药物 本发明控制的克咳胶囊
试验对照药
(1)空白对照：等体积生理盐水。
(2)已知阳性对照药：原质量标准控制的克咳胶囊
造模药：1％毛果芸香碱溶液。
2受试动物
昆明种小鼠，♀♂各半，体重为18～22g；大鼠Wistar种，体重150～200g，♀♂各半。
3试验方法
(1)小鼠氨水引咳法 将实验小鼠按体重随机均分为5组，每组10只，♀♂各半，按下 列方法分组。生理盐水组：用与给药同体积的生理盐水灌胃给药0.2ml/10g，连续14天，于 末次给药后1小时进行试验，本发明控制的克咳胶囊和原质量标准控制的克咳胶囊各为一组 ，连续灌胃给药14天，于末次给药后1小时进行试验，将各组小鼠分别依次放入装有用 0.5ml，25％～28％氢氧化铵注入的0.25g棉球的500ml倒置杯中，倒置烧杯时应迅速，以免气 体遗漏。立即观察小鼠，以其腹肌收缩(缩胸)同时张大嘴为准，有时有咳声的表现为咳嗽 观察指标。以放入氨水棉球开始直至首次发生咳嗽所需秒数作为咳嗽潜伏期。仔细观察和详 细记录小白鼠3分钟内咳嗽次数和咳嗽潜伏期，统计各组同生理盐水组之间的差异，根据下 列公式计算其镇咳百分率和潜伏期延长率。
镇咳百分率(％)＝(N-N0)/N0×100％
(N0：生理盐水组咳嗽次数均值，N：给药组咳嗽次数均值)
潜伏期延长率(％)＝(S-S0)/S0×100％
(S0：生理盐水组潜伏期均值，S：给药组潜伏期均值)
(2)小鼠酚红祛痰法试验 小鼠共分5组，每组10只，♀♂各半，给药方法同镇咳试 验，生理盐水对照组、本发明控制的克咳胶囊组和原质量标准控制的克咳胶囊组在末次给药 后30分钟后腹腔注射0.5％酚红溶液0.5ml/只，注射后30分钟脱颈椎处死小鼠，仰位固定于手 术板上，剪开颈正中皮肤，分离气管，用1ml注射器、7号钝针头吸取5％的NaHC3C溶液0.5ml 灌洗呼吸道，3回，每回灌洗呼吸道3次，将灌洗液注入一比色管中，如此共用1.5mlNaHC3C ，抽洗9次，将每回3次的灌洗液合并，置比色管中，与标准酚红比色管进行比色。
4试验结果
(1)小鼠氨水引咳法 试验结果表明，本发明控制的克咳胶囊同原质量标准控制的 克咳胶囊比较，经生物统计分析，结果表明其差异均有非常显著的意义。止咳(P＜0.01) 和延长咳嗽潜伏期作用(P＜0.01)，结果见下表。
克咳胶囊止咳作用(n＝10，X±sD)
药物 剂量(g/kg·d) 咳嗽次数(次/3分钟) 镇咳百分率(％) 生理盐水 等容积 106.00±15.30 原克咳胶囊 0.004 47.80±24.27* 56.84* 本发明克咳胶囊 5.00 37.90±16.84* 64.58* 本发明克咳胶囊 2.50 48.90±17.43* 55.62* 本发明克咳胶囊 1.25 52.41±22.95* 50.26*
*与原克咳胶曩组比较，P＜0.01。
克咳胶囊延长咳嗽潜伏期作用(n＝10，X±SD)
药物 剂量(g/kg·d) 咳嗽潜伏期(s) 潜伏期百分率(％) 生理盐水 等容积 6.80±3.26 原克咳胶囊 0.004 46.80±41.05* 625.26* 本发明克咳胶囊 5.00 53.60±9.10* 702.12* 本发明克咳胶囊 2.50 49.50±13.25 638.89* 本发明克咳胶囊 1.25 29.20±10.22* 325.88*
*与原克咳胶囊组比较，P＜0.01。
(2)小鼠酚红祛痰法试验 试验结果表明，本发明控制的克咳胶囊同原质量标准控制 的克咳胶囊比较，经生物统计分析，结果表明其差异均有非常显著的意义(P＜0.01)。见 下表。
克咳胶囊祛痰作用(n＝10，X±SD)
药物 剂量(g/kg·d) 气管酚红排泌量(ug/ml) P值 生理盐水 等容积 1.200±0.953 P＜0.01 原克咳胶囊 0.004 6.460±2.783 P＜0.01 本发明克咳胶囊 5.00 7.210±1.286 P＜0.01 本发明克咳胶囊 2.50 6.920±1.055 P＜0.01 本发明克咳胶囊 1.25 5.560±2.369 P＜0.01
通过上述实验证明：本发明对于克咳胶曩中吗啡的含量检测以及控制能够达到非常有效 的效果；本发明控制的克咳胶囊同原质量标准控制的克咳胶囊比较，经实验分析，结果表明 其差异均有非常显著的意义。通过本发明可以控制产品从生产原料的购进、生产工艺的要求 、质量控制等环节，从而保证克咳胶囊的质量。
与现有技术相比，本发明质量控制方法精密度高，重现性好，回收率高，测量结果准确 ，提高了克咳胶囊的质量控制标准，可有效地控制产品质量，从而确切保证了其临床疗效和 广大患者的身体健康。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
本发明的实施例1：克咳胶囊的质量控制方法包括：
性状：内容物为棕黄色至棕褐色的粉末或颗粒；味微苦。
鉴别：(1)取本制剂，置显微镜下观察：外果皮细胞呈五角形或类长方形，壁呈念珠状 增厚，保卫细胞侧面观呈哑铃状。
(2)取本制剂内容物3g，研细，加氨试液数滴，拌匀，加氯仿20ml，冷浸过夜，滤过， 滤液加稀盐酸5ml，振摇，分取酸水层，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另 取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典附录VI B薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶甲醇 ∶浓氨试液＝10∶2∶0.1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.3％茚三酮正丁醇溶液∶醋酸 ＝19∶1混合溶液，在105℃加热5分钟；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相 同颜色的斑点。
(3)取本制剂内容物2g，研细，加盐酸1ml与氯仿20ml，置水浴中加热回流1小时，放冷 ，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草次酸对照品，加乙 醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典附录VI B薄层色谱法试验，吸取上 述两种溶液各4ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以30～60℃石油醚∶苯∶醋酸乙酯∶冰醋酸 ＝10∶20∶7∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％磷钼酸乙醇溶液，在105℃加热5分钟 ；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
检查：照中国药典附录IX H水分测定法第一法测定，不得超过12.0％；
其它各项应符合中国药典附录IL胶囊剂项下有关的各项规定。
含量测定：照中国药典附录VI D高效液相色谱法测定：
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇∶0.5％醋酸铵 水溶液∶1％三乙胺＝25∶74∶1为流动相；检测波长为215nm；流速为：1.0ml/min；理论板数按 吗啡峰计，应不低于3000。
对照品溶液的制备 取吗啡对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含40ug的溶液， 即得。
供试品溶液的制备 取装量差异项下的内容物，研细，取0.5g，精密称定，置50ml具塞 锥形瓶中，加入30ml二氯甲烷，1ml氨水，超声处理30分钟；放冷，滤过，残渣用少量二氯 甲烷洗涤三次，滤过，合并二氯甲烷液，水浴挥干二氯甲烷，残渣加甲醇使溶解，并定量转 移至5ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45um微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，计算，即得 。
本胶囊剂每粒含吗啡C17H19O3N为0.03～0.30mg。
本发明的实施例2：克咳胶囊的质量控制方法可以包括：
性状：内容物为棕黄色至棕褐色的粉末或颗粒；味微苦。
鉴别：(1)取本制剂，置显微镜下观察：外果皮细胞呈五角形或类长方形，壁呈念珠状 增厚，保卫细胞侧面观呈哑铃状。
(2)取本制剂内容物3g，研细，加氨试液数滴，拌匀，加氯仿20ml，冷浸过夜，滤过， 滤液加稀盐酸5ml，振摇，分取酸水层，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另 取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典附录VI B薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶甲醇 ∶浓氨试液＝5∶4∶0.05为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.3％茚三酮正丁醇溶液∶醋酸 ＝15∶2混合溶液，在105℃加热5分钟；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相 同颜色的斑点。
含量测定：照中国药典附录VI D高效液相色谱法测定：
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇∶0.5％醋酸铵 水溶液∶1％三乙胺＝20∶80∶0.5为流动相；检测波长为150nm；流速为：0.5ml/min；理论板 数按吗啡峰计，应不低于3000。
对照品溶液的制备 取吗啡对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含40ug的溶液， 即得。
供试品溶液的制备 取装量差异项下的内容物，研细，取0.5g，精密称定，置50ml具塞 锥形瓶中，加入30ml二氯甲烷，1ml氨水，超声处理30分钟；放冷，滤过，残渣用少量二氯 甲烷洗涤三次，滤过，合并二氯甲烷液，水浴挥干二氯甲烷，残渣加甲醇使溶解，并定量转 移至5ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45um微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，计算，即得 。
本胶囊剂每粒含吗啡C17H19O3N为0.03～0.30mg。
本发明的实施例3：克咳胶囊的质量控制方法可以包括：
性状：内容物为棕黄色至棕褐色的粉末或颗粒；味微苦。
鉴别：取本制剂内容物2g，研细，加盐酸1ml与氯仿20ml，置水浴中加热回流1小时，放 冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草次酸对照品，加 乙醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典附录VI B薄层色谱法试验，吸取 上述两种溶液各4ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以30～60℃石油醚∶苯∶醋酸乙酯∶冰醋 酸＝5∶30∶3∶0.8为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％磷钼酸乙醇溶液，在105℃加热5分 钟；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
检查：照中国药典附录IX H水分测定法第一法测定，不得超过12.0％；
其它各项应符合中国药典附录IL胶囊剂项下有关的各项规定。
含量测定：照中国药典附录VI D高效液相色谱法测定：
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇∶0.5％醋酸铵 水溶液∶1％三乙胺＝30∶60∶2为流动相；检测波长为280nm；流速为：3ml/min；理论板数按 吗啡峰计，应不低于3000。
对照品溶液的制备 取吗啡对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含40ug的溶液， 即得。
供试品溶液的制备 取装量差异项下的内容物，研细，取0.5g，精密称定，置50ml具塞 锥形瓶中，加入30ml二氯甲烷，1ml氨水，超声处理30分钟；放冷，滤过，残渣用少量二氯 甲烷洗涤三次，滤过，合并二氯甲烷液，水浴挥干二氯甲烷，残渣加甲醇使溶解，并定量转 移至5ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45um微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，计算，即得 。
本胶囊剂每粒含吗啡C17H19O3N为0.03～0.30mg。
本发明的实施例4：克咳胶囊的质量控制方法可以包括：
性状：内容物为棕黄色至棕褐色的粉末或颗粒；味微苦。
鉴别：(1)取本制剂，置显微镜下观察：外果皮细胞呈五角形或类长方形，壁呈念珠状 增厚，保卫细胞侧面观呈哑铃状。
(2)取本制剂内容物3g，研细，加氨试液数滴，拌匀，加氯仿20ml，冷浸过夜，滤过， 滤液加稀盐酸5ml，振摇，分取酸水层，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另 取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典附录VI B薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶甲醇 ∶浓氨试液＝15∶0.5∶1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.3％茚三酮正丁醇溶液∶醋酸 ＝25∶0.5混合溶液，在105℃加热5分钟；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显 相同颜色的斑点。
(3)取本制剂内容物2g，研细，加盐酸1ml与氯仿20ml，置水浴中加热回流1小时，放冷 ，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草次酸对照品，加乙 醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典附录VI B薄层色谱法试验，吸取上 述两种溶液各4ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以30～60℃石油醚∶苯∶醋酸乙酯∶冰醋酸 ＝15∶10∶10∶0.2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％磷钼酸乙醇溶液，在105℃加热5分 钟；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
检查：照中国药典附录IX H水分测定法第一法测定，不得超过12.0％；
其它各项应符合中国药典附录IL胶囊剂项下有关的各项规定。