一种茶蜂花粉抗氧化活性成分的提取方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103463134 A (43)申请公布日 2013.12.25 CN 103463134 A *CN103463134A* (21)申请号 201310406113.7 (22)申请日 2013.09.09 A61K 35/64(2006.01) A61P 39/06(2006.01) (71)申请人 浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路 38 号 申请人 宁波源彬蜂业发展有限公司 (72)发明人 胡福良 平舜 张源彬 (74)专利代理机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 代理人 张法高 赵杭丽 (54) 发明名称 一种茶蜂花粉抗氧化活性。

2、成分的提取方法 (57) 摘要 本发明提供一种茶蜂花粉抗氧化活性成分的 提取方法， 是提取茶蜂花粉中具有抗氧化能力的 成分。 本发明提供对茶蜂花粉进行机械破壁， 然后 通过不同的有机溶剂的分步提取等多步提取达到 不同化合物分离的目的， 再用乙酸乙酯萃取， 对萃 取物进行浓缩干燥， 去除茶蜂花粉中富含的脂肪、 蛋白质等物质， 最终获得高浓度的活性成分。 本发 明方法获得的物质具有较强的抗氧化能力。为茶 蜂花粉的药用价值的开发提供了新手段。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4。

3、页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103463134 A CN 103463134 A *CN103463134A* 1/1 页 2 1. 一种茶蜂花粉抗氧化活性成分的提取方法， 其特征在于， 通过以下步骤实现 ： （1） 新鲜茶蜂花粉经冷冻干燥后， 经粉碎机进行机械破壁处理 ； （2） 去除脂类成分处理 ： 加入固液比 1:21:15 的正己烷， 超声波辅助提取 40-80 分钟， 分离提取液体， 将残渣再加入正己烷同法提取与分离 1-3 次， 合并提取液， 回收残渣 ； （3） 用 30%80% 的乙醇按固液比 1:41:10 提取残渣， 加入超声波辅助提取 40-80 分钟， 离心。

4、分离取上清液， 将残渣再加入上述乙醇溶液同法提取与分离 1-3 次， 合并提取液并过 滤 ； （4） 减压浓缩、 沉淀 ： 将提取物浓缩至 1/52/3， 再过滤回收滤液 ； （5） 再用体积比 1:11:4 的乙酸乙酯提取水溶液， 收集乙酸乙酯层， 烘干获得目标物。 2. 根据权利要求 1 所述的一种茶蜂花粉抗氧化活性成分的提取方法， 其特征在于， 步 骤 （2） 改为， 加入固液比 1:4 的正己烷， 超声辅助提取 50 分钟， 分离提取液， 将残渣再加入 正己烷提取与分离 1 次， 合并提取液， 回收残渣。 3. 根据权利要求 1 所述的一种茶蜂花粉抗氧化活性成分的提取方法， 其特征在于。

5、， 步 骤 （3） 改为， 用 50% 乙醇按固液比 1:8 对残渣进行提取， 超声辅助提取 50 分钟， 5000g/ 分 钟， 离心 10 分钟， 收集上清液， 同样方法再提取一次， 合并提取液并过滤。 4. 根据权利要求 1 所述的一种茶蜂花粉抗氧化活性成分的提取方法， 其特征在于， 步 骤 （4） 改为， 水浴温度控制在 50， 将提取物浓缩至原体积 1/2 后， 再过滤回收滤液。 5. 根据权利要求 1 所述的一种茶蜂花粉抗氧化活性成分的提取方法， 其特征在于， 步 骤 （5） 为， 选用体积比为 1:1 的乙酸乙酯提取水溶液， 充分振荡后， 静止 2 小时， 回收乙酸乙 酯层， 同。

6、法再重复一次， 合并乙酸乙酯层， 50烘干， 得到茶蜂花粉抗氧化活性成分。 6. 根据权利要求 1 所述的一种茶蜂花粉抗氧化活性成分的提取方法在茶蜂花粉中提 取抗氧化活性成分中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103463134 A 2 1/4 页 3 一种茶蜂花粉抗氧化活性成分的提取方法 技术领域 0001 本发明属天然产物的开发提取领域， 涉及一种茶蜂花粉抗氧化活性成分的提取方 法， 通过多步提取而获得高浓度的活性成分。 背景技术 0002 蜂花粉是主要的蜂产品之一， 是蜜蜂从被子植物雄性花药和裸子植物小孢子叶上 的小孢子囊采集的花粉粒， 经过蜜蜂加工而成的花粉团状物。 作为一种自然资源。

7、， 蜂花粉中 不仅含有非常丰富的蛋白质、 脂肪、 糖类、 微量元素、 维生素， 还含有对生物体生理功能具有 特殊功效的核酸、 黄酮类、 激素等生物活性物质， 被誉为 “全能营养库” 、“完全营养品” 。 0003 茶树 (Camellia sinensis) 是我国重要的经济作物之一， 在全国都有大面积的种 植。因此， 茶蜂花粉也是我国主要的蜂花粉之一。茶叶中富含茶多酚、 儿茶素和咖啡碱等 生物活性物质， 具有抗菌、 抗病毒和抗氧化等功效。但是， 同样来源于茶树的茶蜂花粉却鲜 有生物学活性的报道。 究其原因主要是茶蜂花粉中富含蛋白质、 脂肪和碳水化合物等物质， 而这些物质在抗氧化等方面的作用甚。

8、微， 起主要作用的往往是黄酮和酚酸类物质。传统的 蜂花粉活性成分提取都是采用单步醇法提取， 其在获得黄酮酚酸类物质的同时也提取了脂 肪、 醇溶性蛋白等物质， 造成活性成分浓度过低无法发挥应有的生物学活性。 如何获得高浓 度的黄酮酚酸类物质， 是困扰蜂花粉生物学活性深入开发的重要原因之一。 0004 研究一种合理的提取方法， 可以去除蜂花粉中对抗氧化效果不强的成分， 提高目 标成分的浓度， 从而为蜂花粉的生物学活性开发奠定基础， 对提高蜂产品的附加值， 促进蜂 产业发展具有重要意义。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种茶蜂花粉抗氧化活性成分的提取方法， 是提取茶蜂花粉 中具有抗氧化能力的。

9、成分， 通过多步提取， 去除茶蜂花粉中富含的脂肪、 蛋白质等物质， 获 得高浓度的目标成分并具有较强的抗氧化能力， 为茶蜂花粉的药用价值的开发奠定基础。 0006 本发明方法通过以下步骤实现 ： （1） 新鲜茶蜂花粉经冷冻干燥后， 经粉碎机进行机械破壁处理 ； （2） 去除脂类成分处理 ： 加入固液比 （W:V） 1:21:15 之间的正己烷， 超声波辅助提取 40-80 分钟， 分离提取液体， 将残渣再加入正己烷同法提取与分离 1-3 次， 合并提取液， 回收 残渣 ； （3） 用 30%80% 的乙醇按固液比 （W:V） 1:41:10 之间提取残渣， 加入超声波辅助提取 40-80 分钟。

10、， 离心分离取上清液， 将残渣再加入上述乙醇溶液同法提取与分离 1-3 次， 合并 提取液并过滤。 0007 （4） 减压浓缩、 沉淀 ： 将提取物浓缩至 1/52/3， 再过滤回收滤液。 0008 （5） 再用 （V:V） 1:11:4 的乙酸乙酯提取水溶液， 收集乙酸乙酯层， 烘干获得目标 物 （茶蜂花粉抗氧化活性成分） 。 说 明 书 CN 103463134 A 3 2/4 页 4 0009 优选的在步骤 （2） 中， 加入固液比 （W:V） 1:4 的正己烷， 超声辅助提取 50 分钟， 分 离提取液， 将残渣再加入正己烷提取与分离 1 次， 合并提取液， 回收残渣 ； 优选的在步骤。

11、 （3） 中， 用 50% 乙醇按固液比 （W:V） 1:8 对残渣进行提取， 超声辅助提取 50 分钟， 5000g/ 分钟， 离心 10 分钟， 收集上清液， 同样方法在提取一次， 合并提取液并过 滤 ； 优选的在步骤 （4） 中， 水浴温度控制在低于 55， 选用 50， 将提取物浓缩至原体积 1/2 后， 过滤， 取滤液 ； 优选的在步骤 （5） 中， 选用体积比为1:1的乙酸乙酯提取水溶液， 充分振荡后， 静止2小 时， 回收乙酸乙酯层， 同法再重复一次， 合并乙酸乙酯层， 50烘干， 得到目标物 （茶蜂花粉 抗氧化活性成分） ； 本发明所述的一种茶蜂花粉抗氧化活性成分的提取方法在茶。

12、蜂花粉中提取抗氧化活 性成分中的应用。将步骤 （5） 中获得的目的物， 通过以芦丁为对照比色法测定总黄酮， 其 含量达到 132.8514.77 g/mg， 通过以绿原酸为对照比色法测定总酚酸， 其含量达到了 255.2321.43 g/mg。通过 ABTS 法测定自由基清除率， 发现其 IC50值为 53.93 g/ml ； 而通过甲醇提取获得的提取物的 IC50值为 700.21 g/ml。本发明方法的提取物其抗氧化 能力是甲醇提取法提取物的 12.98 倍。 0010 本发明通过多次提取去除了花粉中广泛存在的色素、 脂质、 蛋白质和糖类等抗氧 化能力较弱的物质， 通过有机溶剂与目标提取物。

13、的理化特性有针对性的提取酚酸和黄酮类 物质， 从而获得较高浓度的该类物质， 为进一步蜂花粉的相关生物学活性研究及开发奠定 基础。 附图说明 0011 图 1 是实施例 1 中提取物 ABTS 自由基清除力与甲醇法提取物结果。 0012 图 2 是实施例 2 中提取物 ABTS 自由基清除力与甲醇法提取物结果。 0013 图 3 是实施例 3 中提取物 ABTS 自由基清除力与甲醇法提取物结果。 具体实施方式 0014 为了本领域的技术人员能够更好地理解本发明所提供的技术方案， 下面结合具体 实施例作进一步的说明。 0015 实施例 1 本发明对于茶蜂花粉抗氧化活性成分的提取方法， 包括如下步骤。

14、 ： （1） 新鲜茶蜂花粉经冷冻干燥后， 经粉碎机进行机械破壁处理 ； （2） 去除脂类成分处理 ： 加入固液比 （W:V） 1:4 的正己烷， 超声波辅助提取 50 分钟， 分 离提取液体， 将残渣再加入正己烷同法提取与分离 1 次， 合并提取液， 回收残渣 ； （3） 用 50% 的乙醇按固液比 （W:V） 1:8 之间提取残渣， 加入超声波辅助提取 50 分钟， 5000g/ 分钟， 离心 10 分钟， 收集上清液， 同样方法在提取一次， 合并提取液并过滤 ； （4） 减压浓缩、 沉淀 ： 将提取物在 50水浴， 真空浓缩至原体积的 1/2， 再过滤回收滤 液 ； （5） 再将滤液用体积。

15、比 （V:V） 1:1 的乙酸乙酯提取可溶物， 充分振荡后， 静止 2 小时， 回 收乙酸乙酯层， 同法再重复一次， 合并乙酸乙酯层， 50烘干， 得到目标物。 说 明 书 CN 103463134 A 4 3/4 页 5 0016 通过以芦丁为对照比色法测定总黄酮， 其含量达到 132.8514.77 g/mg， 通过 以绿原酸为对照比色法测定总酚酸， 其含量达到了255.2321.43 g/mg。 通过ABTS法测 定自由基清除率， 发现其 IC50值为 53.93 g/ml ； 而通过甲醇提取获得的提取物的 IC50值 为 700.21 g/ml。本发明方法的提取物其抗氧化能力是甲醇提取。

16、法提取物的 12.98 倍。 结果参见附图 1。 0017 实施例 2 本发明对于茶蜂花粉抗氧化活性成分的提取方法， 包括如下步骤 ： （1） 新鲜茶蜂花粉经冷冻干燥后， 经粉碎机进行机械破壁处理 ； （2） 去除脂类成分处理 ： 加入固液比 （W:V） 1:2 的正己烷， 超声波辅助提取 30 分钟， 分 离提取液体， 将残渣再加入正己烷同法提取与分离 2 次， 合并提取液， 回收残渣 ； （3） 用 30% 的乙醇按固液比 （W:V） 1:4 之间提取残渣， 加入超声波辅助提取 40 分钟， 5000g/ 分钟， 离心 10 分钟， 收集上清液， 合并提取液并过滤 ； （4） 减压浓缩、 。

17、沉淀 ： 将提取物在 50水浴， 真空浓缩至原体积的 2/3 左右， 再过滤回收 滤液 ； （5） 再将滤液用体积比 （V:V） 1:2 的乙酸乙酯提取可溶物， 充分振荡后， 静止 2 小时， 回 收乙酸乙酯层， 同法再重复一次， 合并乙酸乙酯层， 50烘干， 得到目标物。 0018 通过以芦丁为对照比色法测定总黄酮， 其含量达到 112.748.62 g/mg， 通过以 绿原酸为对照比色法测定总酚酸， 其含量达到了 208.739.53 g/mg。通过 ABTS 法测定 自由基清除率， 发现其 IC50值为 94.38g/ml ； 而通过甲醇提取获得的提取物的 IC50值为 700.21 g。

18、/ml。本发明方法的提取物其抗氧化能力是甲醇提取法提取物的 7.42 倍。结果 参见图 2。 0019 实施例 3 为了本领域的技术人员能够更好地理解本发明所提供的技术方案， 下面结合具体实施 例进行阐述。 0020 本发明对于茶蜂花粉抗氧化活性成分的提取方法， 包括如下步骤 ： （1） 新鲜茶蜂花粉经冷冻干燥后， 经粉碎机进行机械破壁处理 ； （2） 去除脂类成分处理 ： 加入固液比 （W:V） 1:15 的正己烷， 超声波辅助提取 80 分钟， 分 离提取液体， 将残渣再加入正己烷同法提取与分离 3 次， 合并提取液， 回收残渣 ； （3） 用 80% 的乙醇按固液比 （W:V） 1:10。

19、 之间提取残渣， 加入超声波辅助提取 80 分钟， 5000g/ 分钟， 离心 10 分钟， 收集上清液， 同样方法在提取 3 次， 合并提取液并过滤 ； （4） 减压浓缩、 沉淀 ： 将提取物在 50水浴， 真空浓缩至原体积的 1/5， 再过滤回收滤 液 ； （5） 再将滤液用体积比 （V:V） 1:4 的乙酸乙酯提取可溶物， 充分振荡后， 静止 2 小时， 回 收乙酸乙酯层， 同法再重复一次， 合并乙酸乙酯层， 50烘干， 得到目标物。 0021 通过以芦丁为对照比色法测定总黄酮， 其含量达到 114.8511.21 g/mg， 通过 以绿原酸为对照比色法测定总酚酸， 其含量达到了229.。

20、6217.34 g/mg。 通过ABTS法测 定自由基清除率， 发现其 IC50值为 73.94 g/ml ； 而通过甲醇提取获得的提取物的 IC50值 为 700.21 g/ml。本发明方法的提取物其抗氧化能力是甲醇提取法提取物的 9.47 倍。结 果参见图 3。 0022 对所公开的实施例的上述说明， 使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。 说 明 书 CN 103463134 A 5 4/4 页 6 对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的， 本文中所定义的 一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下， 在其它实施例中实现。 因此， 本发明 将不会被限制于本文所示的这些实施例， 而不是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相 一致的最宽的范围。 说 明 书 CN 103463134 A 6 1/1 页 7 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103463134 A 7 。