技术领域
本发明涉及原儿茶酸的制备及其新用途，尤其涉及在制药领域中的用途。
背景技术
原儿茶酸化学名：3,4-二羟基苯甲酸CAS:[99-50-3]，分子式:(HO)2C6H3COOH，分子量:154.12。存在于乌蕨[Stenoloma chusanum(L.)Ching]的叶，冬青(Ilex chinensis Sims)的叶等多种植物、微生物中。具有抗菌作用，祛痰、平喘作用。临床用于治疗慢性气管炎。
发明内容
本发明的目的在于提供一种原儿茶酸在制备治疗雌激素缺乏引起的疾病的新用途。
本发明进一步提供了一种原儿茶酸在制备治疗围绝经期综合征的药中的新用途。
本发明进一步提供了一种原儿茶酸在制备治疗骨质疏松的药中的新用途。
本发明的还提供了一种原儿茶酸在制备治疗心血管疾病的药中的新用途。
所述的原儿茶酸是对雌激素发挥双向调节作用，能与雌激素受体结合产生雌激素和抗雌激素的同时可替代雌激素促进内源性雌激素的分泌的药物，而不仅仅局限于治疗上述病症，
其中原儿茶酸的结构式如下：
所述的原儿茶酸从一切含有原儿茶酸的植物、微生物中分离提取得到。
所述的原儿茶酸经化学合成得到。
为了更好的理解本发明的实质，下面将用原儿茶酸的药理试验及结果来说明其在制药领域中的新用途。
本发明以在微生物中分离提取为例，经多级提取、洗脱、旋蒸分离制备原儿茶酸，具体方法为：
原儿茶酸从忍冬木层孔菌中提取分离，忍冬木层孔菌采于湖北宜昌，经中国科学院微生物研究所卯晓兰教授鉴定为木层孔菌属真菌忍冬木层孔菌(Phellinus lonicerinus (Bond.)Bond.et sing)，95%工业酒精，广州红卫化工厂。
将阴干的忍冬木层孔菌子实体粉碎，取2kg忍冬木层孔菌菌粉经10升95%乙醇超声辅助 提取，提取三次，每次三小时，合并提取液，经45℃减压浓缩获得忍冬木层孔菌醇提物浸膏。用水悬浮浸膏，上大孔吸附树脂富集多酚，95%乙醇梯度洗脱(0、20%、40%、60%、70%、80%、95%)。洗脱液用三氯化铁显色剂定性鉴定多酚，将可能含有多酚的流分合并，经旋转蒸发仪45℃浓缩干，称重，即得忍冬木层孔菌总酚，其中2kg忍冬木层孔菌制得总酚约8g，提取率约为4‰。
忍冬木层孔菌总酚的高效液相色谱图如图1。
将上述95%乙醇梯度洗脱液分别在40℃下经旋转蒸发仪浓缩至无液体（此时不含有机溶剂），移至干净的安剖瓶，经冷冻干燥机冻干，得黄色不定型粉末，此为原儿茶酸。
原儿茶酸的高效液相色谱图如图2。
1原儿茶酸雌激素作用
试验药物分别为：原儿茶酸（自制，纯度≥98%）、17-β雌二醇（苏州尤利特生物医药科技有限公司）。
无酚红RPMI1640培养液的配置：每10.4g干粉型无酚红RPMI1640溶入1000mL超纯水，加入碳酸氢钠(NaHCO3)2.0g，搅拌，待其充分溶解，0.22μm无菌正压过滤器过滤，加入10%胎牛血清，0.5%青霉素、链霉素(100U/mL、100μg/mL)，分装；
L-15培养基的配制方法同上；
胎牛血清：-4℃过夜，56℃30min灭活，分装，-4℃保存备用；
噻唑蓝(MTT)：称取MTT250mg，避光，溶解于50mL的PBS，使终浓度为5mg/mL，过滤除菌分装，-20℃保存备用；
17β-雌二醇(E2)：取2.7mg17β-雌二醇溶于100uL DMSO(10-1M)，吸取10μL加到90μLDMSO(10-2M)，如此重复6次，即为10-7M（第6次使用10%的DMSO，控制DMSO在细胞中的终浓度低于1‰），加药时用培养基稀释至为10-9M；
原儿茶酸：精密称取3.0mg，溶于100uL10%的DMSO中，吸取20μL加入到180uL无菌水中，如此重复操作，配成10-1M，10-2M，10-3M，10-5M。
1.1原儿茶酸对MCF-7细胞增值的影响
取对数生长期MCF-7细胞(人乳腺癌细胞，对雌激素敏感)，用RPMI1640培养基(含10%小牛血清，0.5%青霉素、链霉素(100U/mL、100μg/mL))培养，当细胞贴壁80%后用0.25%的胰酶消化，稀释细胞浓度至1×104个/mL，接种于96孔板，培养24h使其贴壁。贴壁后将培养基换成无酚红的培养基，然后加入不同浓度药物，阳性对照药用E2(17β–雌二醇)，每个药设5个浓度，设6个复孔。在37℃、5%CO2培养箱中培养48h后，用MTT法测定细胞增殖，每孔加入10μL5mg/mL MTT，培养4h后加入150μL DMSO，在492nm测定OD值。所有的数据都用平均值± 标准差表示，用方差分析进行统计学处理。
表1.原儿茶酸对MCF-7细胞增值的影响
*与空白组比较差异有显著性p﹤0.05(*),p﹤0.01(**)
1.2原儿茶酸对MDA-MB-231细胞增值的影响
人乳腺癌MDA-MB-231(ER-)细胞采用封闭式单层贴壁培养，MDA-MB-231细胞的培养基为L-15培养基(小牛血清10%，青霉素100U/mL,100μg/mL)，恒温37℃，相对饱和湿度。细胞的培养和传代同MCF-7细胞。
MDA-MB-231细胞的检测，除了培养基为L-15及加药前不需要更换培养基外，其它处理方法同上。
表2.原儿茶酸对MDA-MB-231细胞增值的影响
*与空白组比较差异有显著性p﹤0.05(*),p﹤0.01(**)
结果显示：原儿茶酸对雌激素受体阳性乳腺癌细胞株具有同雌激素一样的促进细胞增殖作用。但相同浓度下对雌激素受体阴性的乳腺癌细胞增殖没有影响。表明原儿茶酸具有雌激素作用，其雌激素作用主要是通过雌激素受体发挥作用。
2.原儿茶酸的抗雌激素作用
原儿茶酸的抗雌激素样作用：MCF-7细胞的培养方法同上，在将培养基换成无酚红培养 基时，同时向体系中加入2.5ul 10-7mol/L 17β-雌二醇，以及各种浓度受试药物，在同等条件下进行培养。
MDA-MB-231细胞的抗雌激素样作用检测方法除了培养基为L-15及加药前不需要更换培养基外，其它处理方法同上。
2.1实验方法与结果
样品的抗雌激素样作用：MCF-7细胞的培养方法同上，在将培养基换成无酚红培养基时，同时向体系中加入2.5ul 10-9mol/L 17β-雌二醇，每个药设5个浓度，以它莫西芬作用对照。，在同等条件下进行培养。
表3.药物对MCF-7细胞增值的影响
*表式与对17β–雌二醇组比较差异有显著性p﹤0.05(*),p﹤0.01(**)
实验表明：原儿茶酸具有雌激素双向调节功能。当内源性雌激素缺乏时，显示雌激素活性;当雌激素过多时，又具有抗雌激素作用。
3.计算原儿茶酸与雌激素受体的结合能力
3.1分子对接法计算：基于几何互补、电性互补的原则，采用分子对接法计算不同化合物与雌激素受体的结合能力，预测雌激素调节作用以及不同化合物与雌激素受体间的相互作用模式。雌激素α、β受体三维结构坐标从Protein Data Bank下载(PDB Code:3ERT、1NDE)。化合物分子结构构建后采用量子化学半经验算法PM3进行能量最小化。分子对接采用薛定谔软件中半柔性对接模块Glide，设置结合位点盒子大小为以打分值Gscore判断化合物与雌激素受体间相互作用强弱，Gscore值越负，表示化合物活性越好。
3.2实验结果
通过分子对接计算得，如图3（图3为原儿茶酸与雌激素α受体的分子对接结果），原儿茶酸的3位羟基与雌激素受体α谷氨酸残基353、亮氨酸残基346，4位羟基与雌激素受体α谷氨酸残基353、亮氨酸残基387以及精氨酸残基394以氢键的方式结合。原儿茶酸的官能团苯环与雌激素受体α甲硫氨酸残基388、亮氨酸残基391、苯丙氨酸残基404及丙氨酸残基350之间有疏水作用力。如图4（图4原儿茶酸与雌激素受体的分子对接结果）。原儿茶酸与 雌激素β受体之间结合自由能为-6.67kcal/mol，原儿茶酸3位羟基、4位羟基与雌激素受体β谷氨酸残基305，4位羟基与亮氨酸残基346以氢键的方式结合；苯环与雌激素受体β甲硫氨酸残基340、亮氨酸残基343、亮氨酸残基343及苯丙氨酸残基356之间有疏水作用力。原儿茶酸与雌激素α受体之间结合自由能为-6.46kcal/mol。
从附图上的计算机模拟可以看出，原儿茶酸与雌激素受体α、β之间具有较强的氢键和疏水场作用，但其选择性不高，其主要作用位点均为3位羟基和4位羟基及苯环，这就从理论上阐明了原儿茶酸与雌激素受体的可能作用模式及亲和力大小。据文献报道，桑黄中多种酚均具有这一结构特点，推测原儿茶酸可能也具有与雌激素受体结合的能力。
4.酵母双杂交实验
采用重组人雌激素受体基因片段(hER)及共激活因子GRIP1的双杂交酵母(Y191)（日本富山大学馈赠）实测化合物与雌激素受体的结合能力。
转雌激素受体酵母细胞加10mL的选择性培养基（缺少色氨酸和亮氨酸）于摇床30℃过夜（200r/min培养16～24h）。取每50μL培养液加入200μL新培养基加入药物2.5μL继续培养4h。取150μL放入96孔板，于600nm测OD值作为酵母细胞密度。余下部分用于测定β-半乳糖苷酶的活性。
β-半乳糖苷酶的活性测定：
1、离心：12000rpm，离心5min。小心吸去上清液，收集酵母细胞。
2、破壁：酵母细胞加入200μL Z缓冲液中（0.1M磷酸钠[pH7.0]，10mM KCl,1mM MgSO4)，用前加入zymolyaseg致终浓度1mg/mL，振匀，37℃温育15min。
3、酶反应：加入40μL 4mg/mL浓度的2-硝基苯β-D-半乳糖苷开始酶促反应30min。
4、酶活性测定：加入100μL 1MNa2CO3停止反应。取150μL加入96孔板中测定OD值，按下列公式计算酶活性。
U=1000×(OD420-1.75×OD55)/(t×v×OD600)
注：T反应时间（min)，v用于测定的培养液体积(mL)，OD600细胞测定时的密度，OD4202-硝基苯反应完后的吸光度，OD550反应完后的吸光度。结果见表4。
表4药物对双杂交酵母系统中β-半乳糖苷酶的活性的影响
*与空白组比较差异有显著性p﹤0.01(**)
结果表明：原儿茶酸与α、β受体均有很强的结合能力，并呈现剂量依赖性。原儿茶酸与β受体的结合能力高于α受体。通过与雌激素受体结合而产生雌激素和抗雌激素双向调节作用，是一种作用较强的天然雌激素调节剂。
5.小鼠子宫增重实验
子宫增重试验，是最早建立的检测雌激素活性的经典方法，目前仍被广泛应用。子宫含有丰富的ERs，当外来化合物与ERs结合后，可使子宫的雌激素诱导蛋白(IPs)含量增加，刺激子宫生长。因此，测定动物子宫重量或计算其脏器系数，可评价受试物的雌激素活性及其强度。
昆明雌性小鼠，9～12g，华中科技大学同济医学院实验动物学部提供，生产许可证：XR(鄂)2009-0007。
5.1实验方法与结果
取雌性小鼠32只，随机分为4组，分别为空白组、阳性组（17β-雌二醇）、原儿茶酸高、低剂量组，每组8只。饲喂无大豆的特殊饲料，小鼠适应性饲养一周后称取体重。末次给药前一天禁食不禁水12h。
2)体重系数的计算
末次给药后半小时，称取体重，计算体重系数[(用药后体重-用药前体重)/用药前体重×100]；
3)子宫系数的计算
立即分离子宫，用电子天平称湿质量，计算子宫指数(mg/g)。子宫指数=子宫湿重(mg)/体重(g)×100
4）小鼠E2、ρ测定方法
眼眶取血于EP管内，1400r·min-1离心10min，小心吸取血清置另外EP管内，再次离心，吸取血清，于-20℃保存备用；将-20℃保存的血清放至室温，按小鼠E2酶联免疫试剂盒说明书测定OD值。
5）统计学处理
采用SPSS10.0统计软件对数据处理。先进行数据的正态分布检验，方差齐性检验，组间 比较采用方差分析。计量数据用均数±标准差表示，组间差异用单因素方差分析，多个样本均数间每两个均数的比较采用Q检验。P<0.05说明有差异，P<0.01为有显著性差异。
表5 原儿茶酸对幼鼠子宫系数的的影响
*与空白组比较差异有显著性p﹤0.01(**)，p﹤0.05(*)
表6 原儿茶酸对雌性幼鼠体血清雌二醇和孕酮的影响
结果表明：原儿茶酸低浓度和高浓度都能够促进小鼠体重的增加，增加子宫重量，提高子宫指数，增加血清雌二醇含量，且高浓度的药物增重效果更加明显，但与空白组相比差异无显著性。
6.药物对去势大鼠血清激素水平的影响
清洁级SD雌性大鼠，体重为210±10g，华中科技大学同济医学院实验动物学部提供，生产许可证：XR(鄂)2009-0007。
取雌性大鼠，适应性喂养3天，禁食，做卵巢摘除手术，其中8只做假手术。注射青霉素，每天1次，连续3d，防止术后感染。分组给药，去大豆饲料喂养。每天记录大鼠状态。持续8周，禁食24小时候后，处死前动物禁食不禁水，处死前股动脉采血，取血，分离血清。按酶免试剂盒说明书测定血清雌二醇（E2）、孕酮（P）含量，计算子宫系数。
表7 药物对去势大鼠血清激素水平的影响
*表式与模型组比较差异有显著性p﹤0.01(**)，p﹤0.05(*)
结果表明：原儿茶酸在体内具有雌激素样作用，当内源性雌激素缺乏时，具有促进内源性雌激素分泌作用，同时具有雌激素样作用，能促进大鼠子宫增殖。作用较雌二醇弱。表明其作用对雌激素缺乏更有效。
7.去卵巢大鼠骨质疏松实验
1)实验原理
绝经后骨质疏松症骨代谢的特点是骨转化率增加，骨吸收大于骨形成。去除卵巢骨质疏松造模法是通过摘除动物双侧卵巢模拟人类绝经后雌激素缺乏的体内环境而造成的骨质疏松。本实验通过检测忍冬木层孔菌及其提取物对骨质疏松模型大鼠的作用，从而评价其在动物水平上对骨质疏松的影响。
2)仪器与材料
2.1药物
同上。
2.2试剂
碱性磷酸酶(AKP)检测试剂盒，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)试剂盒，无机钙(Ca)、磷(P)试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供；
脱氧吡啶啉ELISA试剂盒购自北京惠丰生物科技有限公司；
血清骨钙素(s-BGP)委托北京福瑞生物工程公司检测。
2.3仪器
酶联免疫检测仪Stat Fax-2100，(AWARENESS TECHNOLOGY INC)。
3)方法与结果
3.1实验方法
去卵巢大鼠骨质疏松大鼠模型的建立
取体重210±10g的清洁级雌性SD大鼠，禁食12h(不禁水)，于腹部剪毛，酒精消毒，苯巴比妥腹腔注射麻醉。其后沿腹中线向下做纵行切口，长约2-3cm，切开皮肤后，即可见位于两侧肾脏外下方呈粉红色的卵巢及紧密相连的子宫角，结扎并切断子宫角，将卵巢摘除。另取10只SD大鼠，仅从两侧卵巢旁边切除少许脂肪组织，不做卵巢摘除，作为假手术组。缝合前手术处用注射器淋浇庆大霉素，缝合腰肌及皮肤。术后1.6万U/100g肌肉注射青霉素，每天1次，连续3d，防止术后感染，给予去大豆特殊饲料饲养3个月，使用RX-36双 能X射线骨密度测定仪检测大鼠的右侧胫骨骨密度，淘汰造模失败的大鼠。
分组及给药方法
将上述模型大鼠随机分为6组，每组10只。另设假手术组10只。
给药方法：阳性药组己烯雌酚片(0.053mg/kg)，原儿茶酸低剂量组(0.05mg/kg)，原儿茶酸高剂量组(0.2mg/kg)，模型组及假手术组灌胃给予等量消毒饮用水，连续给药三个月。
检测指标
样品采集方法
处死前动物禁食不禁水，放于代谢笼中收集12h尿液，收集到的尿液过滤后稀释5倍后检测。最后一次灌胃给药后0.5h，麻醉，骨动脉采血，室温下静置1h后离心，1000r/m，5min，-20℃下保存。测定时，每组随机选5只测定。
用放射免疫分析法测定：血清骨钙素(BGP)、钙(Ca)、磷(P)含量。ELISA法检测尿液中脱氧吡啶啉(Dpd)的含量。
统计学方法
采用SPSS10.0统计软件对数据处理。先进行数据的正态分布检验，方差齐性检验，组间比较采用方差分析。计量数据用均数±标准差表示，组间差异用单因素方差分析，多个样本均数间每两个均数的比较采用Q检验。P<0.05说明有差异，P<0.01为有显著性差异。
3.2实验结果
(1)原儿茶酸对去势大鼠血清骨钙素(BGP)的影响
结果见表8，原儿茶酸降低了大鼠血清中的BGP的含量，与模型组相比差异有显著性(P<0.05)。
表8 原儿茶酸对去势大鼠血清中BGP含量的影响
与模型组比较*P<0.05
（2)原儿茶酸对大鼠尿液中Dpd含量的影响
结果如表9所示，原儿茶酸可以降低大鼠尿液中Dpd含量，从而降低骨吸收活性，与模型组相比差异有显著性(P<0.05或P<0.01)。
表9 原儿茶酸对去势大鼠尿液中Dpd含量的影响
与模型组比较*P<0.05,**P<0.01
（3）原儿茶酸对去势大鼠血清Ca、P的测定
结果见表10，从表中可以看出，与模型组相比，原儿茶酸可以提高血清中的Ca含量，与模型组相比差异有显著性(P<0.01)。与正常对照组相比，模型组的P含量显著降低，原儿茶酸能提高大鼠血清中的P的含量，但与模型组比差异无显著性。
表10 原儿茶酸对去势大鼠血清中Ca、P含量的影响
与模型组比较*P<0.05,**P<0.01.
实验表明，与模型组相比，原儿茶酸能降低血清中BGP含量降低，表明骨转换的程度下降。原儿茶酸能降低大鼠尿液中Dpd含量，降低骨吸收活性。原儿茶酸在提高大鼠血清Ca含量的情况下，还能降低尿液中Ca的流失，有利于骨Ca的沉积。
以上的检测指标都表明，原儿茶酸可以降低骨转换程度，抑制骨吸收活性，从而治疗骨质疏松症。
本发明的优点在于：
1）本发明对已知化合物原儿茶酸发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。
2）本发明的原儿茶酸安全无毒，药理作用强，预示着很好的药用前景。
3）本发明的物质原料来源丰富、价廉、无毒副作用，制备工艺简单，可做成各种口服剂型，片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液等，实用方便。
4）本发明的物质制成的药物具有显著治疗和预防围绝经期综合征的作用，能够改善围绝经期综合症患者的系列症状，升高血清E2水平，降低FSH和LH水平；降低血脂中TC、TG及LDL-C含量，升高HDL-C水平，且无毒副作用。
5）本发明的物质制成的药物具有显著治疗和预防骨质疏松的作用，在提高大鼠血清Ca含量的情况下，还能降低尿液中Ca的流失，有利于骨Ca的沉积，抑制骨吸收活性， 从而治疗骨质疏松症。
6）本发明的物质制成的药物具有显著治疗和预防心血管疾病的作用，与雌激素相比具有双向调节作用，所以替代雌激素应用更安全，副作用小。
附图说明
图1忍冬木层孔菌总酚的高效液相色谱图。
图2原儿茶酸的高效液相色谱图。
图3原儿茶酸与雌激素α受体的分子对接结果。
图4原儿茶酸与雌激素受体的分子对接结果。
具体实施方式
实施例1
将阴干的忍冬木层孔菌子实体粉碎，取2kg忍冬木层孔菌菌粉经10L95%乙醇超声辅助提取，提取三次，每次三小时，合并提取液，经40～45℃减压浓缩获得忍冬木层孔菌醇提物浸膏。用水悬浮浸膏，上大孔吸附树脂富集多酚，95%乙醇梯度洗脱(0、20%、40%、60%、70%、80%、95%)。洗脱液分别在40～45℃下经旋转蒸发仪浓缩至无液体，移至干净的安剖瓶，经冷冻干燥机冻干，得黄色不定型粉末，此为原儿茶酸。消毒制成产品，分装成0.1～3mg/1mL的口服液或按相等剂量冲压成片剂。
实施例2
按本领域公知常识的方法将香草醛经碱熔、酸化得到的原儿茶酸100～300mg溶于1000mL水中制成0.1～0.3%浓度的水溶液，加热溶解，混合均匀后，装入药瓶中密封，消毒制成产品或按相等剂量冲压成片剂。