技术领域
本发明属于家禽疫苗技术领域，具体涉及一种鸡新城疫和传染性支气 管炎二联活疫苗。
背景技术
鸡传染性支气管炎(IB)是由传染性支气管炎病毒（IBV）引起的一种急 性高度接触性呼吸道疾病，以气管啰音、咳嗽、打喷嚏；幼鸡流鼻涕 ，产蛋鸡产蛋量减少和蛋的品质下降为特征；患病鸡常因呼吸道、肾 脏或消化道感染而引起死亡。本病于1931年首先由Schalk等报道于美 国，1936年由Beach和Hudson确定本病的病原为病毒。至今本病在世界 范围内广泛流行，给养鸡业带来严重危害。在我国，邝荣禄(1972)在 广东首次发现本病；到上世纪70年代后期，郑福荣等在杭州、吴志达 等在上海、艾国光等在北京、辛朝安等在广州分别自种用鸡群中分离 出IBV。荣骏弓等（1997）在患有腺胃肿大的病鸡中分离到腺胃型鸡传 染性支气管炎病毒D971株，用该毒株回归SPF雏鸡引起典型肾炎及腺胃 炎病变，并从人工感染SPF雏鸡中回收到鸡传染性支气管炎病毒。王玉 东、范根成等（1998）在山东省某患有腺胃肿大发病鸡群中采集病料 , 通过鸡胚连续传5～6代，经电镜观察、动物回归和免疫保护试验、 用气管环组织培养进行理化特性测定、毒价测定、中和试验等, 证明 目前流行的以腺胃肿大为主要特征的传染病的病原是冠状病毒，将该 毒株命名为腺胃型鸡传染性支管炎病毒QX株。
国外学者在欧洲，首先分别于2001年俄罗斯东部及2002年俄罗斯西部 分离到IBV 类QX株(Bochkov et al，2006)，该毒株能引起鸡患腺 胃炎、肾炎，与QX株相似。从2003年起许多欧洲国家相继分离到IBV类 QX株包括德国、荷兰、比利时、法国、意大利(Worthington et al ，2008； Monne et al，2008)、波兰(Domanska-Blicharz et al，2006)、英国(Gough et al, 2008)和西班牙(Dolz et al， 2009)。各种相关研究报道表明整个欧洲地区都有类QX株病毒的存在。 显然，IB类QX株对于禽养殖来说是很大的威胁，而目前尚无专门针对 IB类QX株的疫苗。国外学者将类QX毒株在鸡胚上连续传代80余代致弱 的IB L1148毒株制成IB类QX株的活疫苗，并进行相关的效力和安全性 试验。表明对于SPF鸡亦或是携有母源抗体的鸡，经IB L1148株制成 的活苗免后对类QX株D388的攻毒都能提供有效保护。
鸡新城疫（newcastle disease，ND）是由鸡新城疫病毒（NDV）引起 的禽类急性传染病，传播速度快，长期以来给我国养禽业带来了巨大 的威胁。鸡新城 疫活疫苗虽然效果好、价格低廉、使用方便，但其免疫期短、免疫易 受母源抗体干扰，且容易引起呼吸道副作用，干扰实验室诊断病毒分 离，因此，1980年以来，使用鸡新城疫灭活疫苗逐渐成为我国鸡场防 治鸡新城疫的常规方法之一。
免疫接种是防治鸡传染性支气管炎的最有效手段。目前，国内外用于 预防腺胃型传染性支气管炎疫苗的研究较多，但均尚未商品化。同时 由于IBV血清型众多，市场上一直未有交叉保护力好的弱毒株，腺胃型 IB得不到有效控制。因此，筛选获得新的具有较好保护力的IB弱毒疫 苗就显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种鸡新城疫和传染性支气管炎二联活疫苗（以 下简称二联苗），即由新的腺胃型鸡传染性支气管炎弱毒疫苗株和新 城疫病毒La Sota株作为抗原制备的疫苗株，本发明的疫苗对目前中 国流行腺胃型鸡传染性支气管炎病毒的攻击和新城疫病毒的攻击能够 提供良好的免疫保护效力。
本发明的二联苗，由抗原和疫苗辅剂组成，其中抗原为保藏编号为CG MCC No.6752的鸡传染性支气管炎病毒和鸡新城疫病毒。
上述的二联苗的制备方法，是将鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病 毒分别接种鸡胚后，收获胚液获得病毒扩大培养液；然后将新城疫病 毒和鸡传染性支气管炎病毒扩大培养液混合后，加入保护剂制成的。
所述的保护剂为蔗糖和明胶，其在疫苗中的终浓度分别为5%和1%。
本发明制备的二联苗可同时预防鸡新城疫和鸡传染性支气管炎病，达 到了一针两防的目的。而且，组成本发明筛选的鸡传染性支气管炎病 毒为多次传代获得的弱毒株，减少了现有传染性支气管炎病毒作为抗 原所带来的副作用。
附图说明
图1：本发明的二联苗的抗体消长规律。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明。本领域的技术人员应该理 解的是，在不偏离本发明精神和范围的前提下可以对本发明技术方案 的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保 护范围。
一、本发明鸡传染性支气管炎弱毒YB160株的筛选
将传染性支气管炎强毒。使用10~11日龄SPF鸡胚对该传染性支气管炎 强毒进行连续传代致弱，每代通过尿囊腔接种4枚SPF鸡胚，连传至16 0代，进行致弱评价。取10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 、110、120、130、140、150、160传代接种的病毒株感染1日龄的SPF 鸡。结果从第80代病毒株 开始无死亡鸡，第90代毒株接种鸡开始无眼观病变，第130代接种鸡开 始无组织学病变。说明IBV第130代已经完全致弱，对鸡只具有良好的 安全性。同时用本发明毒株130、140、150 160代毒分别免疫3日龄S PF鸡，于免疫后14日，用同源强毒攻击。免疫组分毒率0/10～1/10， 保护率9/10～10/10，对照组分毒率10/10。结果说明本发明毒株具有 良好的免疫保护性。为了便于同以前毒株区分，将传代160代弱化的鸡 胚毒定为原始种子E1代，并命名为YB160株。选取IBV YB160株作为疫 苗研制的候选毒株。本发明的鸡传染性支气管炎病毒 (Avian infe ctious bronchitis virus) YB160株，该病毒株于2012年10月31日 保藏在北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所的中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.6752。
二、IBV YB160株的安全性检测
毒力返强试验 利用IBV强毒株在鸡胚上连续传160代，培育出免疫 原性良好的弱毒株IBV-YB160株。该弱毒株E1代在SPF鸡体上人工感染 和同居感染分别连续传5代，试验鸡均一切正常，接种后5天剖检气管 、腺胃、肾脏等均未见肉眼病理变化；试验发现病毒分离气管棉拭子 和腺胃第4代起分不到病毒，肾脏从第3代起分不到病毒，肝脏从第2代 起分不到病毒。试验鸡气管、腺胃、肾脏等组织匀浆中分毒不通器官 病毒分离率不同，气管、腺胃病毒分离率较高，说明该毒株主要在气 管、腺胃两个器官增殖。随着代次的增加病毒向外排泄也逐渐减少， 分毒率逐渐降低。水平感染试验也出现人工感染同样的规律，只是同 居感染同代次分毒率相对人工感染低。以上试验结果证明该毒株无论 人工感染还是水平传播感染在鸡体连续传代，均未见毒力返强现象， 遗传性稳定，符合鸡传染性支气管炎弱毒疫苗株无毒力返强的标准， 可以作为疫苗毒株进行商品化开发。
IBV YB160株毒种安全性试验 取YB160株E2、E4、E7、E10、E13代 毒种以105.0EID50滴鼻1滴（约0.03ml），分别接种1、3日龄SPF鸡，连续 观察10日。结果接种鸡只均健活，均无任何异常反应。结果见表1、2 。
表1 IBV YB160株毒种的安全性试验结果
表2 IBV YB160株毒种的安全性试验结果
上述IBV YB160株毒力返强试验结果和毒种安全性试验结果说明本发 明筛选的鸡传染性支气管炎病毒弱毒疫苗株YB160株是安全的，可以用 来制备疫苗。
三、IBV YB160株的免疫效力检测
用E2、E4、E7、E10、E13代次YB160株毒种鸡胚尿囊液，以5×102.0EID 50剂量，对1日龄SPF鸡滴鼻，免疫后14日，连同对照鸡，分别采血，分 离血清，进行IB HI抗体效价测定。同时每只鸡用10倍稀释的IB分离 株强毒点眼、滴鼻各1滴，攻毒后第5日，采集每只鸡的气管拭子，经 尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，0.1ml/胚，孵育观察至144小时。结果 显示，免疫组鸡的血清HI抗体效价的几何平均值在1:32～1:39.4之间 ，均≥1:16（微量法）；对照组鸡的血清HI抗体效价均≤1:8（微量法 ）。同时免疫组分毒率在0/10～1/10之间，保护率在9/10～10/10之间 ；对照组分毒率为10/10。说明IBV YB160株毒种在13代以内其免疫原 性基本一致，均具有良好免疫原性，说明IBV YB160株具有良好的免 疫保护性。
四、鸡新城疫和传染性支气管炎二联活疫苗
1 材料
1.1 生产用毒种 制造本品用鸡新城疫病毒La Sota株购自中国兽 医药品监察所；鸡传染性支气管炎病毒YB160株保藏编号为：CGMCC No.6752。
1.2 检验用毒 新城疫强毒北京株（CVCC AV1611株），购自中 国兽医药品监察所。IB分离株强毒，由青岛易邦生物工程有限公司分 离鉴定、保存。
1.3 种蛋及试验鸡
1.3.1 SPF种蛋 购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。
1.3.2 1日龄、10日龄、35日龄SPF鸡 SPF种蛋购北京梅里亚维 通实验动物技术有限公司，购回后自行孵化，出雏后负压隔离器饲养 。
1.4 试验用抗原 鸡新城疫血凝抑制抗原，由青岛易邦生物工程 有限公司提供；IB分离株血凝抑制抗原，实验室制备。
1.5 制苗用其它仪器、试剂 均由青岛易邦生物工程有限公司提 供。
2 方法
2.1 制苗材料选择 选择发育良好的10日龄SPF鸡胚繁殖ND、IB 病毒。
2.2 鸡新城疫病毒的制备
2.2.1 接种 取生产用毒种用灭菌生理盐水稀释10000倍，尿囊 腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1m1。接种后密封针孔，置36～37℃ 继续孵育。
2.2.2 孵育和观察 鸡胚接种后，每日照胚1次，将在60小时前 死亡的鸡胚弃去。60小时后，每4～8小时照胚1次，死亡的鸡胚随时取 出。直至96小时，不论死亡与否，全部取出，气室向上，置于2～8℃ 冷却12～24小时。
2.2.3 收获 将冷却鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无 菌手术剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(勿使卵 黄破裂)，吸取鸡胚液，每若干枚鸡胚的胚液混合为一组。在收获胚液 的同时，应逐个检查鸡胚，如胎儿腐败、胚液浑浊及有任何污染可疑 者弃去不用。收获后的胚液置于灭菌瓶中，2～8℃保存，应不超过5日 。同时取样进行半成品检验。
2.3 鸡传染性支气管炎病毒液的制备
2.3.1 接种 取生产用毒种，用无菌生理盐水稀释100倍，尿囊 腔内接种l0日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置37℃继续 孵育。
2.3.2 孵育和观察 鸡胚接种后，24小时照胚1次，弃去死胚， 将24～36小时的死胚及36小时的活胚，气室向上直立，置于2～8℃中 冷却12～24小时。
2.3.3 收获 将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以 无菌手术剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜（勿 使卵黄破裂），吸取鸡胚液，每若干个鸡胚的胚液混合为一组。在收 获胚液的同时，应逐个检查鸡胚，如胎儿腐败、胚液浑浊及有任何污 染可疑者弃去不用。收获后的胚液置于灭菌瓶中，2～8℃保存，不超 过5日。同时取样进行半成品检验。
2.4 半成品检验
2.4.1 无菌检验 经处理过的胚液，每组分别取样，按2005年版 《中国兽药典》附录方法进行检验。
2.4.2 病毒含量测定
2.4.2.1 鸡新城疫病毒含量测定 将含毒鸡胚液用灭菌生理盐水 作10倍系列稀释，取10-7、10-8、10-9 3个稀释度，各尿囊腔内接种10 日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育，48小时以前死亡 的鸡胚弃去不计，在48～120小时内死亡的鸡胚随时取出置2～8℃，至 120小时取出活胚，48～120小时死亡的鸡胚与120小时存活的鸡胚，逐 个收取鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价≥1:128（微量法）者 判为感染，计算EID50。
2.4.2.2 鸡传染性支气管炎病毒含量测定 将含毒鸡胚液用灭菌 生理盐水作10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8 4个稀释度，各尿囊 腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育。24小 时以前死亡的鸡胚弃去不计，在24～144小时内死亡的鸡胚随时取出， 至144小时，取出所有活胚，逐个收取鸡胚液。接种后鸡胚在24～144 小时死胚及144小时存活的鸡胚胎儿出现失水、蜷缩、发育小(接种胎 儿比对照最轻胎儿重量低2g以上)等特异性病痕判为感染，计算EID50。
2.5 配苗及分装 将检验合格的鸡新城疫病毒液和传染性支气管 炎病毒液按等比例混合于同一容器内，按规定羽份加入适量的5%蔗糖 、1%明胶作冻干保护剂，充分摇匀，定量分装。每羽份病毒含量：鸡 新城疫病毒La Sota株≥107.0EID50；鸡传染性支气管炎病毒YB160株≥ 104.0EID50。
对于鸡新城疫病毒液和传染性支气管炎病毒液的比例，只要能够保证 对这两种疾病产生免疫效果即可。
2.6 冻干 分装后迅速进行冷冻真空干燥，批号分别为0801、0 802、0803。
2.7 成品检验
2.7.1 性状 观察疫苗的外观颜色、性状、与瓶壁脱离情况及加 稀释液后溶解情况。
2.7.2 无菌检验 按2005年版《中国兽药典》附录方法进行检验 。
2.7.3 支原体检验 按2005年版《中国兽药典》附录方法进行检 验。
2.7.4 鉴别检验 将疫苗用生理盐水做适当稀释(0.1羽份/0.1m 1)，与等量抗鸡新城疫、传染性支气管炎病毒YB160株特异性血清混合 ，室温中和l小时，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.2ml。置 37℃孵育观察144小时。
2.7.5 外源病毒检验 按2005年版《中国兽药典》附录方法进行 检验。
2.7.6 安全检验 将疫苗用生理盐水稀释后滴鼻接种10日龄SPF 鸡10只，每只0.03m1(含10羽份)，观察14日。
2.7.7 效力检验
2.7.7.1 用鸡胚检验 将疫苗用生理盐水稀释至2羽份/ml，分别 装入两支试管中，每管lml。第一管加入等量的抗鸡新城疫病毒特异性 血清，第二管加入等量的抗鸡传染性支气管炎病毒YB160株特异性血清 。室温中和1小时(中间摇1～2次)，此时病毒含量为0.1羽份/0.1ml。 第一管继续10倍系列稀释，取3个适宜稀释度各尿囊腔内接种10日龄S PF鸡胚5枚，每胚0.1ml，置37℃孵育，观察144小时。根据接种后24～ 144小时死胚及144小时存活的鸡胚中出现失水、蜷缩、发育小(接种胎 儿比对照最轻胎儿重量低2g以上)等特异性病变胚的总和，计算EID50。 第二管继续10倍系列稀释，取3个适宜稀释度各尿囊腔内接种10日龄S PF鸡胚5枚，每胚0.1m1，48小时以前死亡的鸡胚不计，48～120小时死 亡的鸡胚随时取出置2～8℃，至120小时取出活胚，48～120小时死亡 的鸡胚与120小时存活的鸡胚，逐个收获胚液，分别测定1%鸡红细胞凝 集价，凝集价≥1:128 (微量法)判为感染，计算EID50。
2.7.7.2 用鸡检验
2.7.7.2.1 鸡新城疫部分 用35日龄的SPF鸡10只，每只滴鼻接 种1/100羽份二联苗，免后14日，连同条件相同的未免疫对照鸡5只， 每只鸡分别肌肉注射含104.0ELD50的鸡新城疫北京株强毒lml，观察14日 。记录发病死亡情况。
2.7.7.2.2鸡传染性支气管炎部分 用3日龄SPF鸡10只，每只滴鼻1 羽份的二联苗。同时设10只不免疫作对照。免疫后14日，连同对照鸡 每只鸡分别采血，分离血清，按附录进行HI抗体效价测定。同时每只 鸡用10倍稀释的IB分离株强毒点眼、滴鼻各1滴，攻毒后第5日，采集 每只鸡的气管拭子，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，0.1ml/胚，37℃孵 育观察至144小时。统计病毒分离情况。
2.7.8 剩余水分测定 按2005年版《中国兽药典》附录方法进行 。
2.7.9 真空度测定 按2005年版《中国兽药典》附录方法进行。
3 结果
3.1 半成品生产及检验结果
3.1.1 无菌检验 按现行《中国兽药典》附录方法进行检验，均 无细菌生长。结果见表1。
3.1.2 病毒含量测定
3批NDV病毒液病毒含量分别为108.7EID50/0.1ml、108.7EID50/0.1ml、108.9E ID50/0.1ml，3批IBV病毒液病毒含量分别为106.9EID50/0.1ml、 106.7EID50/0.1ml、106.5EID50/0.1m。结果见表3。
表3 半成品检验结果
3.2 成品检验结果
3.2.1 性状
外观 3批二联苗检验样品外观均为微黄色海绵状疏松团块，上下摇 晃时，样品很容易与瓶壁脱离。3批二联苗分别加入稀释液后均迅速溶 解。结果见表4。
表4 二联苗性状检验结果
3.2.2 无菌检验 3批二联苗分别每批任抽5瓶分别用无菌生理盐 水恢复至2ml，按2005年版《中国兽药典》附录方法进行。结果显示， 均无细菌、霉菌生长，3批二联苗无菌检验均合格，结果详见表5。
表5 二联苗无菌检验结果
3.2.3 支原体检验 3批二联苗每批任抽5瓶分别用无菌生理盐水 恢复至2ml并混匀，按2005年版《中国兽药典》附录方法进行检验。结 果显示，3批 二联苗均无支原体生长，支原体检验均合格。结果详见表6。
表6 二联苗支原体检验结果
3.2.4 鉴别检验 3批二联苗用无菌生理盐水做适当稀释(0.1羽 份/0.1m1)，分别与等量抗鸡新城疫、传染性支气管炎病毒YB160株特 异性血清混合，室温中和l小时，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚10枚， 每胚0.2ml，置37℃孵育，观察144小时。结果显示，接种鸡胚均为10 /10健活，且鸡胚液对1%鸡红细胞凝集试验均为阴性，说明疫苗鉴别检 验合格。结果见表7。
表7 二联苗鉴别检验结果
3.2.5 外源病毒检验
3.2.5.1 鸡胚检查法 3批二联苗分别取样3瓶，同批样品混合后 用无菌生理盐水做适当稀释，与等量抗鸡新城疫、传染性支气管炎病 毒YB160株特异性血清混合，室温中和l小时。接种鸡胚进行检验。结 果显示，检验鸡胚每组均10/10存活，胎儿均发育正常，绒毛尿囊膜均 无病变，鸡胚液对1%鸡红细胞凝集试验均为阴性。结果见表8。
表8 二联苗外源病毒检验（鸡胚法）结果
3.2.5.2 细胞检查法
3.2.5.2.1 3批二联苗分别取样3瓶，同批样品混合后用无菌生理盐 水做适当稀释，与等量抗鸡新城疫、传染性支气管炎病毒YB160株特异 性血清混合，在室温中和l小时。取处理过的样品各接种2瓶已长成良 好单层的鸡胚成纤维细胞各0.2ml，观察7日。检验均无细胞病变，且 无红细胞吸附现象。
3.2.5.2.2 禽白血病病毒检验 3批二联苗分别取样3瓶，同批样 品混合后用无菌生理盐水做适当稀释，与等量抗鸡新城疫、传染性支 气管炎病毒YB160株特异性血清混合，在室温中和l小时。取处理过的 样品各接种2瓶已长成良好单层的鸡胚成纤维细胞各2ml，同时设阴性 对照（正常细胞）和阳性病毒作对照, 同样品连传3代，取3代细胞培 养物（包括样品和所有对照组）冻融3次，并作上标记，用禽白血病病 毒试剂盒进行ELISA检测。样品检验结果均为阴性。结果见表9。
表9 二联苗外源病毒检验（细胞法）结果
3.2.5.3 鸡检查法 3批二联苗分别取样3瓶，样品混合后用无菌 生理盐水做适当稀释后，接种20日龄的SPF鸡各20只，其中滴鼻、点眼 各接种10羽份，肌肉注射100羽份，免后21日，再重复接种1次，于第 1次接种后42日采血，分离血清，进行有关病原的血清抗体检测并记录 临床症状。结果显示，检验疫苗接种鸡后42日，鸡只均健康，无呼吸 道症状及临床反应。且血清仅与鸡新城疫抗原和传支抗原发生反应， 而与其他病原抗原均不发生反应。结果见表10。
表10 二联苗外源病毒检验（鸡检查法）结果
综上所述，鸡胚检法结果、细胞检法及鸡检法结果均说明3批二联苗外 源病毒检验合格。
3.2.6 安全检验 3批二联苗每批任抽3瓶分别用无菌生理盐水适 当稀释后滴鼻接种10只10日龄SPF鸡，每只0.03m1(含10羽份)，观察1 4日。结果显示，接种鸡只均无任何不良反应，且10/10健活。结果见 表11。
表11 二联苗安全检验结果
3.2.7 效力检验
3.2.7.1 鸡胚检查法 3批二联苗每批任抽1瓶分别用无菌生理盐 水稀释至2羽份/1ml，分别装入两支试管中，每管lml。按2.7.7.1方法 进行检验。结果显示，鸡新城疫部分每羽份病毒含量分别为106.7EID50、 106.9EID50和106.9EID50，均≥106.7EID50；鸡传染性支气管炎部分每羽份病毒 含量分别为103.9EID50、103.7EID50和103.7EID50，均≥103.7EID50。说明二联苗 效力检验（鸡胚法）检验合格。结果见表12。
表12 二联苗效力检验（鸡胚法）结果
3.2.7.2 鸡检查法 3批二联苗每批任抽1瓶分别用无菌生理盐水 稀释。
（1）鸡新城疫部分 用35日龄的SPF鸡10只，每只滴鼻接种l/100羽 份，同时设5只不免疫作为对照鸡，免后14日，采血测ND HI抗体效价 。结果显示，用鸡新城疫北京株强毒攻毒后，免疫组均10/10保护，对 照组5/5发病死亡。结 果见表13。
表13 二联苗效力检验（鸡检查法）新城疫部分结果
（2）鸡传染性支气管炎部分 用3日龄SPF鸡10只，每只滴鼻1羽份 的疫苗，同时设10只不免疫作对照。免疫后14日，采血测IBV-HI抗体 效价；同时用10稀释的IB分离株强毒攻毒。结果显示，免疫组IBV-HI 抗体效价几何平均值为1:36.8～1:52，对照组IBV-HI抗体效价均≤1: 8；用IB分离株强毒攻毒后，免疫组分毒率为0/10～1/10，保护率为9 /10～10/10，对照组分毒率为8/10。结果见表14。
表14 二联苗效力检验（鸡检查法）传支部分结果
3.2.8 剩余水分测定 3批二联苗每批任抽4瓶用真空干燥法进行 检验。结果检验样品剩余水分含量在2.0～2.7%之间，均≤4%。说明二 联苗剩余水分测定检验均合格。结果见表15。
3.2.9 真空度测定 3批二联苗分别用真空检漏仪进行检验。结 果检验样品均呈紫色辉光。说明二联苗真空度测定检验均合格。结果 见表15。
表15 二联苗剩余水分及真空度检验结果
本发明制备的鸡新城疫和传染性支气管炎二联活疫苗单剂量接种、单 剂量重复接种和一次超剂量接种安全性试验
1 材料
1.1 10、70、180日龄SPF鸡 SPF种蛋购自从北京梅里亚维通实 验动物技术有限公司，购回后自行孵化，出雏后负压隔离器内饲养。
1.2 疫苗 二联苗，批号为0801、0802、0803实验室试制。
2 方法
2.1 取样方法 将3批二联苗分别取样3瓶复溶后混合，再用无菌 生理盐水做适当稀释。
2.2 单剂量接种SPF鸡安全性试验 取10日龄SPF鸡30只，随机分 为A、B、C 3组，每组10只，A组滴鼻接种0801批疫苗，B组点眼接种 0801批疫苗，1羽份/只，C组不接种作对照组，同条件隔离饲养，仔细 观察试验鸡免疫后的采食、饮水、精神、生长发育情况，免疫后连续 观察14日，记录试验鸡结果。
2.3 单剂量重复接种SPF鸡安全性试验 取10日龄SPF鸡 30只， 随机分为A、B、C 3组，每组10只，A组滴鼻接种0801批疫苗，B组点 眼接种0801批疫苗，1羽份/只，分别于接种后7日，按上述相同的方法 统同剂量进行重复接种，C组不接种作对照组，每组在同条件下分别隔 离饲养，仔细观察试验鸡的免疫后的采食、饮水、精神、生长发育情 况，第二次免疫后连续观察14日，记录结果。
2.4 一次超剂量接种SPF鸡安全性试验 取10日龄SPF鸡 70只， 随机分为A、B、C、D、E、F、G等7组，每组10只，A、B、C组分别滴鼻 接种0801、0802、0803批疫苗，D、E、F组分别点眼接种0801、0802、 0803批疫苗，10羽份/只，G组不接种作对照组，每组在同条件下分别 隔离饲养，仔细观察试验鸡的接种后的采食、饮水、精神、生长发育 情况，连续观察14日。观察结束后剖检接种鸡，无菌采集腺胃、肾脏 ，做病理切片观察，并记录结果。
2.5 一次超剂量接种70日龄SPF蛋鸡安全性试验 取70日龄SPF鸡 70只，随机分为A、B、C、D、E、F、G等7组，每组10只，A、B、C组 分别滴鼻接种0801、0802、0803批疫苗，D、E、F组分别点眼接种080 1、0802、0803批疫苗，10羽份/只，G组不接种作对照组，每组在同条 件下分别隔离饲养，仔细观察试验鸡的接种后的采食、饮水、精神、 生长发育情况，连续观察30日。观察结束后剖检接种鸡，观察腺胃、 肾脏有无病变以及卵巢、输卵管发育情况，并记录结果。
2.6 一次超剂量接种180日龄SPF蛋鸡安全性试验 取180日龄商 品蛋鸡70只，分为A、B两组，A组50只滴鼻接种0801批疫苗，10羽份/ 只，B组20只不接种作对照组，每组在同条件下分别隔离饲养，仔细观 察试验鸡的接种后的采食、饮水、精神，统计接种后30日内试验组和 对照组产蛋率变化及产蛋质量，并记录结果。
3 结果
3.1 单剂量（1羽份/只）接种SPF鸡安全性试验结果 试验鸡采 用滴鼻、点眼两种途径分别接种0801批疫苗1羽份后，观察14日。结果 显示，试验鸡的精神、食欲、粪便、生长发育均正常。结果见表16。
表16 单剂量接种SPF鸡安全性试验结果
3.2 单剂量（1羽份/只）重复接种SPF鸡的安全性试验结果 试 验鸡采用滴鼻、点眼两种途径分别接种0801批疫苗1羽份/只，在首次 接种后7日进行重复接种1羽份/只，观察14日。结果显示，试验鸡采食 、饮水、精神、生长发育情况均良好。结果见表17。
表17 单剂量重复接种SPF鸡的安全性试验结果
3.3 一次超剂量（10羽份/只）接种SPF鸡安全性试验结果 试验 鸡采用滴鼻、点眼两种途径接种0801、0802、0803批疫苗10羽份/只， 观察14日，试验鸡的精神、食欲、粪便、生长发育均正常。结果见表 18。观察14日后，对试验鸡剖检观察未见异常，采集腺胃、肾脏制备 切片，组织学观察腺胃、肾脏均未见异常。
表18 一次超剂量接种SPF鸡安全性试验结果
3.4 一次超剂量（10羽份）接种70日龄SPF蛋鸡安全性试验结果 试验鸡采用滴鼻途径接种0801批疫苗10羽份/只，观察30日。结果显 示，试验鸡的精神、食欲、粪便、生长发育均正常。观察14日后，对 试验鸡剖检观察腺胃、肾脏无病变，卵巢、输卵管发育均正常。结果 见表19。
表19 一次超剂量（10羽份）接种70日龄SPF蛋鸡安全性试验结果
3.5 一次超剂量接种180日龄SPF蛋鸡安全性试验结结果 试验鸡 采用滴鼻途径接种0801批疫苗10羽份/只，观察30日。结果显示，试验 鸡的精神、食欲、粪便均正常，试验鸡产蛋率为86.0%，对照鸡产蛋率 85.0%，均未见畸形蛋、软壳蛋、沙壳蛋等。结果见表20。
表20 一次超剂量（10羽份）接种180日龄SPF蛋鸡安全性试验结果
4 结论
4.1 二联苗以滴鼻途径分别以单剂量、单剂量重复和一次性超剂量 分别接种10日龄的SPF鸡，连续观察14日。在接种后观察期内，采食、 饮水、精神、生长发育情况均正常。
4.2 蛋鸡一般在70~120日龄是输卵管发育成熟期，因此选择70日龄 蛋鸡进行一次性超剂量试验以便观察下超剂量接种对蛋鸡输卵管发育 是否有影响。试验中连续观察了30日试验鸡采食、饮水、精神均正常 ，剖检腺胃、肾脏、卵巢、输卵管未见异常，说明超剂量接种未对蛋 鸡输卵管发育产生不良影响。。
4.3 因大日龄SPF蛋鸡成本高，饲养占隔离器多，难饲养。因此二 联苗对产蛋鸡的安全性试验只用了一种途径，一个批次疫苗进行。以 滴鼻途径一次性超剂量接种180日龄SPF蛋鸡，连续观察30日，试验鸡 采食、饮水、精神均正常，试验鸡产蛋率为86.0%，对照鸡产蛋率为8 5.0%，均未见畸形蛋、软壳单、沙壳蛋等，说明超剂量免疫未影响鸡 产蛋性能。
以上试验结果说明二联苗是安全的。
本发明制备的鸡新城疫和传染性支气管炎二联活疫苗抗体消长规律及 免疫持续期的试验
1 材料
1.1 疫苗 鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗（La Sota株 +YB160株），实验室试制，批号为0801、0802、0803。
1.2 1日龄SPF鸡 种蛋购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公 司，购回后自行孵化，出雏后负压隔离器内饲养。
1.3 检验用强毒 新城疫强毒北京株（CVCC AV1611株），购自 中国兽医药品监察所；IB分离株强毒，由青岛易邦生物工程有限公司 分离、鉴定、保存。
1.4 试验用抗原 鸡新城疫血凝抑制抗原、传染性支气管炎YB1 60株血凝抑制抗原，均由青岛易邦生物工程有限公司提供。
2 方法 将3批二联苗分别按注明羽份用无菌生理盐水稀释后， 每批取1日龄SPF鸡175只，其中100只免疫疫苗，滴鼻1羽份/只（0.03 ml），另75只不免疫作对照，同条件下隔离饲养。
2.1 上述免疫鸡于免疫后4、7、14、21、28、42、56、70、84、9 8、112、 126、140日随机抽取10只，采血，分离血清，测定ND和IB HI抗体效 价。
2.2 将上述3批二联苗免疫鸡于接种后7、90、120、150日，每批随 机抽取20只免疫鸡，其中10只连同对照组5只，各肌肉注射104.0ELD50的 鸡新城疫强毒北京株1.0ml，观察14日。另10只连同对照组10只用10倍 稀释的IB分离株强毒各点眼、滴鼻各1滴，攻毒后第5日，采集每只鸡 的气管拭子，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，0.1ml/胚，孵育观察至1 44小时。接种后鸡胚在24～144小时死亡，以及存活鸡胚胎儿出现失水 、蜷缩、发育小（接种胎儿比对照最轻胎儿重量低2g以上）等特异性 病痕判为感染。如果每组棉拭样品有一枚鸡胚出现上述病例特征，即 可判病毒分离阳性。
3 结果
3.1 二联苗免疫后ND和IB HI抗体效价检测结果 用二联苗接种 后，鸡新城疫部分4日产生抗体，抗体效价的几何平均值达3.1log2， 接种后7日抗体效价的几何平均值达4.0；接种后14日抗体效价的几何 平均值达到高峰5.8log2。鸡传染性支气管炎部分4日后产生抗体，抗 体效价的几何平均值达3.0log2，接种后7日抗体效价的几何平均值达 4.1；接种后14日抗体效价的几何平均值达到高峰5.7log2。70日后ND 和IB抗体开始缓慢下降。结果见表21。
表21 二联苗ND和IB HI抗体效价检测结果
3.2 用3批二联苗分别免疫1日龄SPF鸡，于免后7、90、120、150日 时，分别抽取试验鸡进行攻毒保护试验。二联苗在免后7日时对ND强毒 攻击保护率达到9/10以上，对IB分离株强毒攻击分毒率为1/10～2/10 ，保护率达到8/10~9/10；120日时对ND强毒攻击保护率达到9/10，对 IB分离株强毒攻击分毒率为0/10～2/10，保护率达到8/10~10/10；而 150日时对ND强毒攻击保护率仅为6/10，对IB分离株强毒攻击分毒率为 3/10～5/10，保护率仅为5/10～7/10。结果见表22。
表22 二联苗免疫后的攻毒保护试验结果
4 结论 实验室试制的3批鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫 苗（La Sota株+YB160株）接种后4日后可产生抗体，14日抗体达到高 峰，维持70日后平缓降低；同时在免后7日时对ND强毒攻击保护率达到 9/10以上，对IB分离株强毒攻击分毒率为1/10～2/10，保护率达到8/ 10~9/10；120日时对ND强毒攻击保护率达到9/10，对IB分离株强毒攻 击分毒率为0/10～2/10，保护率达到8/10～10/10；而150日时对ND强 毒攻击保护率仅为6/10，对IB分离株强毒攻击分毒率为3/10～5/10， 保护率仅为5/10～7/10。所以在接种后120日内对SPF鸡仍能够达到理 想的保护效果。为了确保疫苗的免疫效果，将鸡新城疫、传染性支气 管炎二联活疫苗（La Sota株+YB160株）免疫期确定为3个月。以上结 果说明所制备的二联苗安全有效，可以推广应用。