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1、10申请公布号CN104066750A43申请公布日20140924CN104066750A21申请号201280067865922申请日2012112211190227620111123EPC07K16/28200601C07K16/3020060171申请人拜耳知识产权有限责任公司地址德国蒙海姆72发明人A哈伦加CC考皮兹S哈默尔F迪特默S高菲尔M特兰特温S布鲁德J弗朗茨B斯特尔特路德维格L林登R芬纳恩S格利文J泰比74专利代理机构北京北翔知识产权代理有限公司11285代理人张广育孙占华54发明名称抗FGFR2的抗体及其用途57摘要本发明提供了抗体或其抗原结合抗体片段或其变体，其在结合至过。
2、表达FGFR2的细胞和表达突变的FGFR2的细胞中的FGFR2之后，降低FGFR2的细胞表面表达。本发明还提供了基于抗体的用于FGFR2相关的疾病或病症例如癌症的疗法。本发明的抗体还可用于诊断领域。本发明还提供了编码前述抗体的核酸序列、含有所述核酸序列的载体、药物组合物和具有使用说明书的试剂盒。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014072386PCT国际申请的申请数据PCT/EP2012/0733252012112287PCT国际申请的公布数据WO2013/076186EN2013053051INTCL权利要求书4页说明书57页序列表109页附图25页19中华人民共和国国家知识。
3、产权局12发明专利申请权利要求书4页说明书57页序列表109页附图25页10申请公布号CN104066750ACN104066750A1/4页21一种分离的抗体或其抗原结合片段，其在结合至过表达FGFR2的细胞系SNU16ATCCCRL5974和MFM223ECACC98050130和表达突变的FGFR2的细胞系AN3CADSMZACC267和MFE296ECACC98031101中的FGFR2之后，降低FGFR2的细胞表面表达。2一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合由SEQIDNO63表示的FGFR2的细胞外N末端表位1RPSFSLVEDTTLEPE15。3权利要求2的分离的抗体或其。
4、抗原结合片段，其中所述抗体与所述细胞外N末端表位SEQIDNO63的结合是通过至少一个选自ARG1、PRO2、PHE4、SER5、LEU6和GLU8残基的表位残基介导的。4权利要求23任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其中通过将FGFR2的N末端表位1RPSFSLVEDTTLEPE15中的至少一个氨基酸残基改变为丙氨酸，所述抗体或其抗原结合片段失去了多于50的其ELISA信号A所述残基选自PRO2、LEU6和GLU8，或B所述残基选自ARG1、PRO2、PHE4和SER5。5权利要求14任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与至少一个选自如下的抗体竞争结合至FGFR2“M04。
5、8D01”、“M047D08”、“M017B02”、“M021H02”、“M054A05”、“M054D03”、“TPP1397”、“TPP1398”、“TPP1399”、“TPP1400”、“TPP1401”、“TPP1402”、“TPP1403”、“TPP1406”、“TPP1407”、“TPP1408”、“TPP1409”、“TPP1410”、“TPP1411”、“TPP1412”和“TPP1415”。6权利要求5任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段的氨基酸序列与“M048D01”、“M047D08”、“M017B02”、“M021H02”、“M054A05”、“M05。
6、4D03”、“TPP1397”、“TPP1398”、“TPP1399”、“TPP1400”、“TPP1401”、“TPP1402”、“TPP1403”、“TPP1406”、“TPP1407”、“TPP1408”、“TPP1409”、“TPP1410”、“TPP1411”、“TPP1412”或“TPP1415”中的至少一个CDR序列至少50、55、60、70、80、90或95相同；或者与“M048D01”、“M047D08”、“M017B02”、“M021H02”、“M054A05”、“M054D03”、“TPP1397”、“TPP1398”、“TPP1399”、“TPP1400”、“TPP14。
7、01”、“TPP1402”、“TPP1403”、“TPP1406”、“TPP1407”、“TPP1408”、“TPP1409”、“TPP1410”、“TPP1411”、“TPP1412”或“TPP1415”的VH或VL序列至少50、60、70、80、90、92或95相同。7权利要求56任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含表9和表10所示的至少一个CDR序列或者至少一个可变重链或轻链序列。8权利要求17任一项的抗体或抗原结合片段，其包含A由SEQIDNO57表示的可变重链CDR序列和由SEQIDNO810表示的可变轻链CDR序列，或B由SEQIDNO1517表示的可变重链C。
8、DR序列和由SEQIDNO1820表示的可变轻链CDR序列，或C由SEQIDNO2527表示的可变重链CDR序列和由SEQIDNO2830表示的可变轻链CDR序列，或D由SEQIDNO3537表示的可变重链CDR序列和由SEQIDNO3840表示的可变轻链CDR序列，或权利要求书CN104066750A2/4页3E由SEQIDNO4547表示的可变重链CDR序列和由SEQIDNO4850表示的可变轻链CDR序列，或F由SEQIDNO5557表示的可变重链CDR序列和由SEQIDNO5860表示的可变轻链CDR序列，或G由SEQIDNO7577表示的可变重链CDR序列和由SEQIDNO7880表。
9、示的可变轻链CDR序列，或H由SEQIDNO8587表示的可变重链CDR序列和由SEQIDNO8890表示的可变轻链CDR序列，或I由SEQIDNO9597表示的可变重链CDR序列和由SEQIDNO98100表示的可变轻链CDR序列，或J由SEQIDNO105107表示的可变重链CDR序列和由SEQIDNO108110表示的可变轻链CDR序列，或K由SEQIDNO115117表示的可变重链CDR序列和由SEQIDNO118120表示的可变轻链CDR序列，或L由SEQIDNO125127表示的可变重链CDR序列和由SEQIDNO128130表示的可变轻链CDR序列，或M由SEQIDNO13513。
10、7表示的可变重链CDR序列和由SEQIDNO138140表示的可变轻链CDR序列，或N由SEQIDNO145147表示的可变重链CDR序列和由SEQIDNO148150表示的可变轻链CDR序列，或O由SEQIDNO155157表示的可变重链CDR序列和由SEQIDNO158160表示的可变轻链CDR序列，或P由SEQIDNO165167表示的可变重链CDR序列和由SEQIDNO168170表示的可变轻链CDR序列，或Q由SEQIDNO175177表示的可变重链CDR序列和由SEQIDNO178180表示的可变轻链CDR序列，或R由SEQIDNO185187表示的可变重链CDR序列和由SEQID。
11、NO188190表示的可变轻链CDR序列，或S由SEQIDNO195197表示的可变重链CDR序列和由SEQIDNO198200表示的可变轻链CDR序列，或T由SEQIDNO205207表示的可变重链CDR序列和由SEQIDNO208210表示的可变轻链CDR序列，或U由SEQIDNO215217表示的可变重链CDR序列和由SEQIDNO218220表示的可变轻链CDR序列。9权利要求18任一项的抗体或抗原结合片段，其包含A由SEQIDNO1表示的可变重链序列和由SEQIDNO2表示的可变轻链序列，或B由SEQIDNO11表示的可变重链序列和由SEQIDNO12表示的可变轻链序列，或C由SEQ。
12、IDNO21表示的可变重链序列和由SEQIDNO22表示的可变轻链序列，或D由SEQIDNO31表示的可变重链序列和由SEQIDNO32表示的可变轻链序列，或权利要求书CN104066750A3/4页4E由SEQIDNO41表示的可变重链序列和由SEQIDNO42表示的可变轻链序列，或F由SEQIDNO51表示的可变重链序列和由SEQIDNO52表示的可变轻链序列，或G由SEQIDNO73表示的可变重链序列和由SEQIDNO74表示的可变轻链序列，或H由SEQIDNO83表示的可变重链序列和由SEQIDNO84表示的可变轻链序列，或I由SEQIDNO93表示的可变重链序列和由SEQIDNO94。
13、表示的可变轻链序列，或J由SEQIDNO103表示的可变重链序列和由SEQIDNO104表示的可变轻链序列，或K由SEQIDNO113表示的可变重链序列和由SEQIDNO114表示的可变轻链序列，或L由SEQIDNO123表示的可变重链序列和由SEQIDNO124表示的可变轻链序列，或M由SEQIDNO133表示的可变重链序列和由SEQIDNO134表示的可变轻链序列，或N由SEQIDNO143表示的可变重链序列和由SEQIDNO144表示的可变轻链序列，或O由SEQIDNO153表示的可变重链序列和由SEQIDNO154表示的可变轻链序列，或P由SEQIDNO163表示的可变重链序列和由SE。
14、QIDNO164表示的可变轻链序列，或Q由SEQIDNO173表示的可变重链序列和由SEQIDNO174表示的可变轻链序列，或R由SEQIDNO183表示的可变重链序列和由SEQIDNO184表示的可变轻链序列，或S由SEQIDNO193表示的可变重链序列和由SEQIDNO194表示的可变轻链序列，或T由SEQIDNO203表示的可变重链序列和由SEQIDNO204表示的可变轻链序列，或U由SEQIDNO213表示的可变重链序列和由SEQIDNO214表示的可变轻链序列。10前述权利要求任一项的抗体，其为IGG抗体。11前述权利要求任一项的抗原结合片段，其为SCFV、FAB、FAB片段或FAB。
15、2片段。12前述权利要求任一项的抗体或抗原结合片段，其为单克隆抗体或抗原结合片段。13前述权利要求任一项的抗体或抗原结合片段，其为人、人源化或嵌合抗体或抗原结合片段。14一种抗体药物缀合物，其包含权利要求113任一项的抗体或其抗原结合片段。15一种分离的核酸序列，其编码权利要求113任一项的抗体或抗原结合片段。16一种载体，其包含权利要求15的核酸序列。17一种分离的细胞，其表达权利要求113任一项的抗体或抗原结合片段和/或包含权利要求15的核酸或权利要求16的载体。18权利要求17的分离的细胞，其中所述细胞为原核细胞或真核细胞。19一种产生权利要求113任一项的抗体或抗原结合片段的方法，所述。
16、方法包括培养权利要求18的细胞和纯化所述抗体或抗原结合片段。20权利要求113任一项的抗体或抗原结合片段或权利要求14的抗体药物缀合物作为药物。21权利要求113任一项的抗体或抗原结合片段作为诊断试剂。22权利要求113任一项的抗体或抗原结合片段或权利要求14的抗体药物缀合物作为用于治疗癌症的药物。23一种药物组合物，其包含权利要求113任一项的抗体或抗原结合片段或权利要求14的抗体药物缀合物。24权利要求23的药物组合物与一种或多种治疗活性化合物的结合物。25一种用于治疗与不希望存在的FGFR2相关的疾病或病症的方法，所述方法包括给权利要求书CN104066750A4/4页5予有需要的受试者。
17、有效量的权利要求23的药物组合物或权利要求24的结合物。权利要求书CN104066750A1/57页6抗FGFR2的抗体及其用途技术领域0001本发明提供特异性针对成纤维细胞生长因子受体2FGFR2的重组抗原结合区域和抗体以及含有这类抗原结合区域的功能片段。0002因此，所述抗体可用于治疗与FGFR2的表达相关的肿瘤和其他障碍和病症。本发明还提供了编码前述抗体的核酸序列、含有所述核酸序列的载体、药物组合物和具有使用说明书的试剂盒。背景技术0003基于抗体的疗法被证明可非常有效的治疗多种癌症，包括实体瘤。例如，已经被成功用于治疗乳腺癌，在B细胞相关的癌症类型中有效。开发成功的基于抗体的疗法的关键。
18、是分离抗优先在肿瘤细胞上表达的细胞表面蛋白的抗体。0004成纤维细胞生长因子受体是酪氨酸受体激酶RTK，在哺乳动物中已知其中的四种FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4。鉴定了22种作为配体的人成纤维细胞生长因子FGFESWARAKUMARANDSCHLESSINGER,CYTOKINEGROWTHFACTORREVIEWS2005,16139149；SHIMADAETAL,PROCNATLACADSCIUSA2001,9865006505。FGFR由3个细胞外的免疫球蛋白IG样结构域D1D3，其中结构域2和3为配体结合所必需，单个跨膜结构域和含有催化蛋白酪氨酸激酶核心的细胞质结构域组。
19、成参见图1的图示。细胞外部分另外包含酸性盒AB和肝素结合位点HBS参见图1。RTK的FGFR家族的重要标志是存在多种可变剪接的变体。全长FGFR2称作FGFR2，而缺少D1的同种型ISOTYPE称作FGFR2图1。结构域3中的可变剪接导致2种不同的变体，即含有外显子7和8的FGFE2IIIB，和含有外显子7和9的FGFR2IIIC图1。后者的剪接影响配体结合，导致特异性模式。FGFR2IIIC主要由间充质细胞表达，FGFR2IIIB主要由上皮细胞表达。FGF7也被称作角化细胞生长因子KGF，仅结合FGFR2IIIB，因此FGFR2IIIB也被称作KGFR。FGF与其受体结合后，随后发生FGFR。
20、的二聚化作用和磷酸化作用以及经由FRSGRB2停靠蛋白复合体的下游信号传导至RASMAPK信号传导级联和PI3KAKT信号传导级联。所述第一个信号传导级联参与细胞生长和分化，后者参与细胞存活和命运决定KATOHANDKATOH,INTJONCOL2006,29163168。0005所有四种受体FGFR1FGFR4及其剪接变体通过不同的FGF进行的协调信号传导是胚胎发育过程中适当的器官发生所必需的ORNITZETAL,GENOMEBIOL2001,23005。在FGFR2的情形中，缺少所有FGFR2变体可导致胎盘和肢芽形成方面的缺陷，因而在E105导致死亡。特异性敲除FGFR2IIIB还导致死亡。
21、在P0，这与肺、垂体前叶、甲状腺、牙齿和四肢的发育不全相关，而破坏FGFR2IIIC变体是能存活的，同时显示出骨化延迟、成比例的矮小和颅底的骨连结ESWARAKUMARANDSCHLESSINGER,2005。人的FGFR2的种系活化突变在胚胎发生过程中导致严重的畸形，例如阿佩尔综合征或斐弗综合征中的冠状颅缝早闭和颅缝早闭ROBINETAL,INGENEREVIEWS,NCBIBOOKSHELFWASHINGTON,EDTSPAGONET说明书CN104066750A2/57页7AL,1993。在成年人中，FGFR2信号传导参与伤口愈合、上皮修复以及皮肤和粘膜的细胞保护作用BRAUNETAL,。
22、PHILTRANSRSOCLONDB2004,359753757，以及损伤肝脏的再生STEILINGETAL,ONCOGENE2003,2243804388；DISSERTATION,SWISSFEDERALINSTITUTEOFTECHNOLOGYZURICH,2009。FGFR2信号传导在梗死形成后心外膜衍生细胞EPDC向心脏中迁移的过程中的作用尚在讨论中，这是因为在胚胎发生过程中，FGF10/FGFR2信号传导是EPDC在致密心肌膜中迁移所必需的，该过程是完整的心脏发育所必需的VEGAHERNNDEZETAL,DEVELOPMENT201133313340；WINTERANDDEGROO。
23、T,CELLMOLLIFESCI2007,64692703。0006相反，通过FGFR2进行的种系非依赖性信号传导参与不同病症，例如痤疮KATOH,JOFINVESTDERMATOL2009,12918611867、银屑病FINCHETAL,AMJPATHOL1997,15116191628；XUETAL,JINVESTDERMATOL201113115211529、牙周炎LIETAL,JPERIDONTALRES2005,40128138、晒斑SOLARLENTIGINELINETAL,JOURNALDERMATOLSCI2010,599197、肠病BRAUCHLEETAL,JPATHOL1。
24、996,149521529、子宫内膜异位TANIGUCHIETAL,FERTILSTERIL2008,89478480、胆脂瘤YAMAMOTOFUKUDAETAL,EURARCHOTORHINOLARYNGOL200826511731178；DALESSANDROETAL,OTOLNEUROTOL2010SEP；31711639、胆脂瘤型慢性中耳炎YAMAMOTOFUKUDAETAL,OTOLNEUROTOL2010JUL；31574551、动脉粥样硬化CHEETAL,AMJPHYSIOLHEARTCIRCPHYSIOL300H154H161,2011和癌症参见下文。0007已公开了数篇研究，。
25、强调了FGFR2表达与癌症患者的不良结果之间的较强关联0008FGFR2和/或KGF的过表达与胃癌的扩张性生长和患者的更短存活时间相关MATSUNOBUETAL,INTJCANCER2006,28307314；TOYOKAWAETAL,ONCOLREPORTS2009,21875880。因此在31365的所有测试的胃癌样品中检测到FGFR2的过表达MATSUNOBUETAL,INTJCANCER2006,28307314；TOYOKAWAETAL,ONCOLREPORTS2009,21875880。腺癌所有胃癌的70进一步分为两种不同的病理学类型，即肠型胃癌和弥散型胃癌。有趣的是，前一种攻击性。
26、较小的类型与活化的ERBB2致癌通路相关，而后一种攻击性更强的表型在FGFR2/PI3K通路中包含畸变YAMASHITAETAL,SURGTODAY2011,412438。大约60的胃腺癌属于弥散型，其余40属于肠型WERNERETAL,JCANCERRESCLINONCOL2001,127207216。FGFR2过表达存在于53的弥散型胃癌样品中YAMASHITAETAL,SURGTODAY2011,412438。综合所有数据，HER2和FGFR2过表达似乎发生在2种不同的患者群体中。可能地，FGFR2的表达部分地是由于基因扩增引起的，这是因为FGFR2的扩增可存在于大约710的原发性胃癌中。
27、KUNIIETALCANCERRES2008,6823402348。此外，FGFR2不仅只是在转移癌中存在，而且甚至在转移癌中比在原发性肿瘤中更强YAMASHITAETAL,SURGTODAY2011,412438。0009在乳腺癌中，FGFR2IIIB表达存在于57的肿瘤样品中，但几乎不存在于健康组织中TAMARUETAL2004,8414601471。KGFFGF7存在于45的样品中，通常与FGFR2IIIB同时存在。当与既不表达FGF7也不表达FGFR2IIIB的原发性乳腺癌相比时，FGF7和其唯一的受体FGFR2IIIB的共表达与原发性肿瘤中的凋亡细胞数目显著减少相关TAMARUETA。
28、L2004,8414601471。与在胃癌中相同，在乳腺癌中基因扩增也存在说明书CN104066750A3/57页8于4的三阴性乳腺癌TNBC中TURNERETALONCOGENE2010,2920132023。在乳腺癌中鉴定出一些小核多态性SNP，SNP与增加的乳腺癌风险相关HUNTERETALNATUREGENETICS2007,6870874。如果SNP位于内含子2中，则导致FGFR2的转录上调KATOHEXPERTREVIEWS2010,1013751379。有趣的是，FGFR1优先在ER阳性的乳腺癌中上调，而FGFR2优先在ER阴性的乳腺癌中上调KATOH,EXPERTREVIEWS。
29、2010,1013751379。0010在胰腺癌中，FGFR2IIIB和/或FGF7的过表达与静脉浸润强相关CHOETAL,AMJPATHOL17019641974，借此FGFR2和FGF7的共表达存在于肿瘤细胞中，但是甚至更加大量的存在于与肿瘤细胞相邻的间充质细胞中ISHIWATAETAL,AMJPATHOL1998,153213222。0011在上皮卵巢癌中，与正常组织相比，80的测试情形中存在FGFR2的上调，70的测试情形中FGF7存在于腹水中STEELEETAL,ONCOGENE2058785887。0012FGFR2蛋白存在于所有测试的浸润性宫颈癌中，在肿瘤的浸润性前端强烈表达KA。
30、WASEETAL,INTJONCOL2010,36331340。0013在肺腺癌中，FGF7和FGFR2的共表达存在于516的测试的情形中，与较低的分化等级、更高的增殖率、淋巴结转移和更短的5年存活率相关YAMAYOSHIETAL,JPATHOL2004,204110118。0014在子宫内膜癌中，FGFR2的最频繁的活化突变存在于大约16的子宫内膜癌中POLLOCKETAL,ONCOGENE2007,2671587162。0015在食管癌EC中，癌细胞中的FGF7和FGFR2的共表达存在于26的患者中，这与更短的存活趋势相关YOSHINOETAL,INTJONCOL2007,31721728。
31、。0016在肝细胞癌中，FGFR2表达在低分化的肿瘤中被上调了47倍。该表达与门静脉浸润的发生和更短的无疾病生存时间相关HARIMOTOETAL,ONCOLOGY2010,78361368。0017一些具有体外和体内的实验数据的出版物证实异常的FGFR2信号传导和肿瘤进展之间的因果关系0018敲低和/或抑制胃TAKEDAETAL,CLINCANCERRES2007；1330513057；KUNIIETAL,CANCERRES2008；6823402348、乳腺TURNERETALONCOGENE2010,2920132023、卵巢COLEETAL,CANCERBIOLTHER2010,1049。
32、5504和头颈鳞状上皮细胞MARSHALLETAL,CLINCANCERRES2011,1750165025的癌细胞中的FGFR2，导致肿瘤细胞的增殖降低和/或凋亡增加。同样，在肿瘤异种移植物中，在过表达FGFR2的肿瘤细胞系中敲低FGFR2和抑制FGFR2，显示对胃TAKEDAETAL,CLINCANCERRES2007；1330513057和卵巢COLEETAL,CANCERBIOLTHER2010,10495504癌细胞系的生长抑制。此外，仅激活FGFR2的FGF7可在体外和在体内增加胃SHINETAL,JCANCERRESCLINONCOL2002,128596602、乳腺ZHANGE。
33、TAL,ANTICANCERRES1998,1825412546和卵巢COLEETAL,CANCERBIOLTHER2010,10495504癌细胞系的增殖。此外，在含有具有激活突变的FGFR2的子宫内膜癌细胞系中敲低FGFR2还导致细胞周期停止并诱导细胞死亡BYRONETAL,CANCERRES2008,6869026907。0019FGFR2信号传导在体外促进胃SHINETAL,JCANCERRESCLINONCOL2002,128596602、乳腺ZHANGETAL,ANTICANCERRES1998,1825412546和胰腺癌细胞系NOMURAETAL,BRJCANCER2008,9。
34、9305313；NIUETAL,JBIOL说明书CN104066750A4/57页9CHEM2007,28266016011的迁移和侵入。0020在食管癌中，FGFR2是肿瘤相关的成纤维细胞中上调最高的基因。分离的肿瘤相关的成纤维细胞释放出促进食管癌细胞增殖的可溶性因子ZHANGETAL,HUMCANCERBIOL2009,1540174022，表明由间充质细胞表达的FGFR2也可促进肿瘤进展。0021仅报道了有限量的抗FGFR2的抗体。FORTINETALJNEUROSCI2005,2574707479描述了封闭性的抗FGFR2的抗体。WEIETALHYBRIDOMA2006,2511512。
35、4展示了仅特异性针对FGFR2IIIB的可抑制FGF诱导的细胞增殖的抗体。在WO2007/144893中，公开了结合FGFR2和FGFR3的抑制性抗体。在WO2010/054265和ZHAOETALCLINCANCERRES2010,1657505758中，公开了抑制FGF结合的抗体。BAIETALCANCERRES2010,7076307639描述了特异性针对FGFR2IIIB的抗体。RDSYSTEMS出售在FGFR2测定法中中和活性的抗FGFR2的抗体。0022总之，已知一些FGFR2剪接变体。此外，已知FGFR2相关的疾病是由于FGFR2的异常表达例如过表达或扩增引起的，或是由于多种突变。
36、的FGFR2蛋白引起的。但是，仍然缺乏可以解决多种不同的FGFR2相关疾病的疗法。发明内容0023本发明涉及提供抗体或其抗原结合抗体片段或其变体，其在结合至过表达FGFR2的细胞和表达突变的FGFR2的细胞中的FGFR2之后，降低FGFR2的细胞表面表达。本发明还提供了基于抗体的疗法，所述疗法用于FGFR2相关的疾病或病症，例如癌症，特别是用于表达FGFR2的肿瘤，例如胃癌、乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌、肾细胞癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、非小细胞肺癌NSCLC、子宫内膜癌、食管癌、头颈癌、肝细胞癌、黑色素瘤和膀胱癌。0024本发明还涉及编码本发明的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸，表达本发明。
37、的抗体或其抗原结合片段的细胞，用于产生本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，用于使用本发明的抗体或其抗原结合片段抑制发育异常的细胞的生长的方法，用于使用本发明的抗体或其抗原结合片段治疗和检测癌症的方法。0025本发明描述了抗体，其与现存的FGFR2抗体的区别在于它们在与过表达FGFR2的细胞和表达突变的FGFR2的细胞中的FGFR2结合之后，降低FGFR2的细胞表面表达。本发明的实施方案是结合FGFR2的细胞外N末端表位1RPSFSLVEDTTLEPE15SEQIDNO63的抗体或其抗原结合片段。本发明的抗体或其抗原结合片段A在短时间内激活FGFR2，B诱导FGFR2的内化，C导致有效的降解，D。
38、使表达FGFR2的癌细胞或肿瘤细胞脱敏以及E最终导致这些抗体在体内肿瘤实验中的抗肿瘤活性。本发明的这些和其他目的在本文中更加详细地描述。0026本发明的抗体可以与已知药物共同给药，在一些实例中所述抗体自身可以被修饰。例如，抗体可缀合至细胞毒性试剂、免疫毒素、毒性基团或放射性同位素，以有可能进一步增加效能。0027本发明还提供了构成用于诊断恶性或发育不良病症的工具的抗体，在所述病症中，FGFR2表达与正常组织相比有所提高，或者FGFR2从所述细胞表面脱落并且变得可以在血清中检测到。提供了缀合至可检测的标记物的抗FGFR2的抗体。优选的标记物为放射性说明书CN104066750A5/57页10标记。
39、、酶、生色团或荧光剂。0028本发明还涉及编码本发明的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸，表达本发明的抗体或其抗原结合片段的细胞，用于产生本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，用于使用本发明的抗体或其抗原结合片段抑制发育不良的细胞的生长的方法，和使用本发明的抗体或其抗原结合片段用于治疗和检测癌症的方法。0029本发明还涉及分离的核酸序列，每个所述分离的核酸序列可编码上述的特异性针对FGFR2的表位的抗体或其抗原结合片段。本发明的核酸适用于重组生产抗体或抗原结合抗体片段。因此，本发明还涉及含有本发明的核酸序列的载体和宿主细胞。0030本发明的组合物可用于治疗性或预防性的应用。因此，本发明包括药物组合物。
40、，所述药物组合物包含本发明的抗体或其抗原结合片段和可药用的载体或赋形剂。在相关方面中，本发明提供了用于治疗与不希望存在的表达FGFR2的细胞相关的疾病或病症的方法。在优选的实施方案中，前述的疾病为癌症。这类方法包括给予有需求的受试者有效量的所述药物组合物的步骤，所述药物组合物包含本文记载的或考虑到的本发明的抗体。0031本发明还提供了用于使用抗体文库以分离特异性结合FGFR2的一个或多个这类文库的成员的说明。附图说明0032图1FGFR2结构的示意图。比较性地示出了SEQIDNO61和SEQIDNO62剪接变体。所述图示出了3个IG样结构域D1、D2和D3、跨膜结构域TM和细胞内激酶结构域。标。
41、明了肝素结合位点HBS、酸性盒AB和可变的IIIB/IIIC部分结构域。氨基末端由N标记，羰基末端由C标记。本发明的抗体的结合表位用条纹表示。0033图2与10G/ML的抗FGFR2的抗体短时间15MIN孵育后，MFM223中磷酸化FGFR2PFGFR2水平的诱导。Y为“未处理的对照细胞的”。如图所示，与未处理的对照细胞相比，抗体M048D01HIGG1和M047D08HIGG1使PFGFR2的ELISA信号增加了4倍。与之相反，在短时间孵育后所述对照IGG抗体和可商购自RD的抗FGFR2的抗体MAB665、MAB684、MAB6843都未表现出任何对PFGFR2水平的显著效应。这些结果揭示了。
42、在短时间孵育后本发明中描述的抗FGFR2的抗体对FGFR2的对抗效应。0034图3与10G/ML的抗FGFR2的抗体长时间24小时孵育后，MFM223细胞对FGF725NG/ML，15MIN介导的对PFGFR2水平的诱导脱敏。Y为“未处理的对照细胞的”。如图所示，抗体M048D01HIGG1和M047D08HIGG1非常显著地降低了FGF7刺激后可达到的PFGFR2的水平。在不用抗体处理方法处理的细胞中以及在用同种型对照IGG处理的细胞中，使用FGF7的刺激导致PFGFR2水平增加约4倍。与之相反，在用抗FGFR2的抗体预处理24小时的样品中，FGF7仅将PFGFR2水平诱导了13714倍。0。
43、035总之，这些结果表明延长细胞与本发明的抗FGFR2的抗体的孵育时间导致对使用FGF7的刺激的脱敏作用。0036图4与10G/ML的抗FGFR2的抗体孵育45小时后，具有FGFR2过表达MFM223、SNU16或FGFR2突变AN3CA、MFE296的细胞系中FGFR2表面表达的下调通过FACS分析测量。Y为“对照细胞的”。如图所示，抗体M048D01HIGG1和M047D08HIGG1是仅有的在过表达FGFR2的细胞系MFM223、SNU16和具有FGFR2突变的细胞系AN3CA、说明书CN104066750A106/57页11MFE296中降低FGFR2表面表达的抗体。抗体例如MAB68。
44、4和MAB6843RD仅在不过表达FGFR2的细胞系中降低FGFR2表面表达。抗体例如GALFR21在具有FGFR2突变的细胞系中不降低FGFR2表面表达。0037图5在SNU16细胞中用抗FGFR2的抗体进行长时间96小时孵育后总FGFR2水平的下调。Y为“对照细胞的”。X为“抗体浓度G/ML”。如图所示，抗体M048D01HIGG1白色和M047D08HIGG1条纹在96小时后以剂量依赖的方式显著降低了总FGFR2水平。未结合的对照抗体黑色未表现出任何效应。这些结果表明抗FGFR2的抗体M048D01HIGG1和M047D08HIGG1不仅导致表面FGFR2水平的短期降低，还导致总FGFR。
45、2水平的长期降低。0038图6M048D01HIGG1和M047D08HIGG1在结合至表达内源性FGFR2的细胞后特异性内化作用的时间进程的显微评价。Y为“颗粒计数/细胞”。X为“时间MIN”。在乳腺癌细胞系SUM52PE上研究了抗体25G/ML的内化作用。在乳腺癌细胞系SUM52PE上研究抗体的内化作用。颗粒计数/细胞是以动态方式中测量。如图所示，增加的颗粒计数/细胞表明，抗体M048D01HIGG1黑色正方形和实线和M047D08HIGG1黑色三角形和虚线表现出快速的内化。同种型对照抗体星型和虚线未表现出任何内化。0039图7M048D01HIGG1A,B和M047D08HIGG1C,D。
46、在SUM52PE细胞中的内化作用表现出与RAB7A,C的共染色，而未与RAB11B,D共染色。GALFR21E,F和GALFR22G,H在SUM52PE细胞中的内化作用表现出与RAB11F,H的共染色，而未与RAB7E,G共染色。0040图8与PBS实心圆，实线和对照IGG的处理实心三角，实线相比，在用2MG/KGM017B02HIGG1空心三角，实线进行的腹膜内处理的情况下皮下SNU16异种移植物的生长。标绘了平均值标准偏差。X为“肿瘤接种后的时间天”。Y为“肿瘤面积MM2”。用M017B02HIGG1进行的处理导致非常显著的肿瘤生长抑制。0041图9与PBS实心圆，实线和对照IGG的处理实。
47、心三角，实线相比，在用2MG/KGM021H02HIGG1空心三角，实线进行的腹膜内处理的情况下皮下SNU16异种移植物的生长。标绘了平均值标准偏差。X为“肿瘤接种后的时间天”。Y为“肿瘤面积MM2”。用M021H02HIGG1进行的处理导致非常显著的肿瘤生长抑制。0042图10与PBS实心圆，实线和对照IGG的处理实心三角，实线相比，在用2MG/KGM048D01HIGG1空心三角，实线进行的腹膜内处理的情况下皮下SNU16异种移植物的生长。标绘了平均值标准偏差。X为“肿瘤接种后的时间天”。Y为“肿瘤面积MM2”。用M048D01HIGG1进行的处理导致非常显著的肿瘤生长抑制。0043图11。
48、与PBS实心圆，实线和对照IGG的处理实心三角，实线相比，在用2MG/KGM054A05HIGG1空心三角，实线进行的腹膜内处理的情况下皮下SNU16异种移植物的生长。标绘了平均值标准偏差。X为“肿瘤接种后的时间天”。Y为“肿瘤面积MM2”。用M054A05HIGG1进行的处理导致非常显著的肿瘤生长抑制。0044图12与PBS实心圆，实线相比，在用2MG/KGM054D03HIGG1空心三角，实线进行的腹膜内处理的情况下皮下SNU16异种移植物的生长。标绘了平均值标准偏差。X为“肿瘤接种后的时间天”。Y为“肿瘤面积MM2”。用M054D03HIGG1进行的处理导致非常显著的肿瘤生长抑制。说明书。
49、CN104066750A117/57页120045图13与PBS实心圆，实线相比，在用2MG/KGM047D08HIGG1空心三角，实线进行的腹膜内处理的情况下皮下SNU16异种移植物的生长。标绘了平均值标准偏差。X为“肿瘤接种后的时间天”。Y为“肿瘤面积MM2”。用M047D08HIGG1处理导致非常显著的肿瘤生长抑制。0046图14在肿瘤细胞接种后的第13天肿瘤变得坏死前的最后时间点，皮下4T1肿瘤的肿瘤面积的点图。在该时间点，小鼠接受单独使用PBS的治疗A，每周2次静脉注射的5MG/KG的M048D01HIGG1的治疗B，口服的100MG/KG拉帕替尼LAPATINIB的治疗C，或每周2次静脉注射的5MG/KG的M048D01HIGG1和口服的100MG/KG拉帕替尼的治疗D。Y为第13天的肿瘤面积MM2，虚线表示平均值，实线表示中值。单独使用M048D01HIGG1的治疗导致肿瘤面积显著减小，而单独使用拉帕替尼未显著影响肿瘤面积。M048D01HIGG1与拉帕替尼的组合导致显著增加的抗肿瘤活性。0047图15在肿瘤细胞接种后的第13天肿瘤变得坏死前的最后时间点，皮下4T1肿瘤的肿瘤面积的点图。在该时间点，小鼠接受单独使用PBS的治疗A，每周2次静脉注射的5MG/KG的M048D。