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1、10申请公布号CN104059883A43申请公布日20140924CN104059883A21申请号201310109781322申请日20130319C12N5/10200601C12N15/85200601C12Q1/6820060171申请人翁炳焕地址317300浙江省台州市仙居县环城南路302号仙居县妇女儿童医院72发明人翁炳焕54发明名称一种常见染色体数目异常诊断质控细胞株及其制备方法57摘要本发明涉及一种医学诊断质量控制的常见染色体数目异常诊断质控细胞株及其制备方法，其主要特征是取因临床诊治需要而作染色体病诊断后并已确诊为21三体、18三体、13三体、X或Y染色体异常的剩余的贴壁。
2、生长活细胞，以转基因导入借T4DNA连接酶连接同时经BAMHI酶切的PCDNA31DNA和SV40LTAGDNA所构建的SV40LTAGPCDNA31质粒，使之与细胞DNA整合，G418筛选整合有重组子的细胞株，作传代扩增、冻存，再提取这些染色体数目异常细胞株，按质控所需比例混合，使原先每例细胞株仅有单一染色体数目异常转变为含有一定比例的5种染色体异常的嵌合体质控细胞株，增加了鉴别诊断、嵌合体诊断的难度，备作常见染色体数目诊断的质控细胞株，标本易得且将废弃的多余细胞转化为有效的永生化质控细胞。51INTCL权利要求书2页说明书8页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求。
3、书2页说明书8页附图1页10申请公布号CN104059883ACN104059883A1/2页21一种用于医学实验诊断质量控制的常见染色体数目异常诊断质控细胞株及其制备方法，其主要特征是取因临床诊治需要而作染色体病诊断后并已确诊为常见染色体数目异常的剩余的贴壁生长活细胞，以转基因导入借T4DNA连接酶连接同时经BAMHI酶切的PCDNA31DNA和SV40LTAGDNA所构建的SV40LTAGPCDNA31质粒，使之与细胞DNA整合，G418筛选整合有重组子的细胞株，作传代扩增、冻存，再提取这些染色体数目异常细胞株，按质控所需比例混合，制成疑难的常见染色体数目异常诊断质控细胞株，所用原始细胞易。
4、得，且将废弃的多余细胞转化为可永久生存、无限扩增的永生化质控细胞，可按需复制足够的细胞株以满足质控要求，多种染色体数目异常细胞按质控所需比例混合后使原先每例细胞株仅有单一染色体数目异常转变为含有一定比例的多种染色体数目异常的嵌合体质控细胞株，增加了鉴别诊断、嵌合体诊断的难度，用以染色体数目检测室内质控、室间质评及技术水平考核，具有更有效的质量控制效果。2根据权利要求1所述的一种用于医学实验诊断质量控制的常见染色体数目异常诊断质控细胞株及其制备方法，其特征是常见染色体数目异常包含21三体、18三体、13三体、X和Y染色体数目异常5类。3根据权利要求1所述的一种用于医学实验诊断质量控制的常见染色体。
5、数目异常诊断质控细胞株及其制备方法，其特征是SV40大T抗原DNA与常见染色体数目异常细胞DNA整合制成了能传代至第75代、培养至第9天、仍呈圆形、梭形、铺满瓶底，其细胞生长汇合率达95以上的质控细胞株。4根据权利要求1所述的一种用于医学实验诊断质量控制的常见染色体数目异常诊断质控细胞株及其制备方法，其特征是按质控所需比例混合包含以5例染色体数目异常原液活质控细胞株之比均为11的等浓度、等体积或细胞数进行混合如各取1ML，混合液总体积为5ML，制成等比应用活质控细胞株，理论上21三体、18三体、13三体、X和Y染色体数目异常的核型各占20；以1例原液活质控细胞株与另外的1例、2例、3例或4例按。
6、105、11、12、13、14、15、16、17、18、19、110、12050的体积比例或细胞数比例进行混合，制成不等比应用活质控细胞株，含有不同类型和比例的染色体数目异常；以5例染色体数目异常的原液固定质控细胞，以5例之比均为11的等浓度、等体积或细胞数进行混合如各取1ML，混合液总体积为5ML，制成等比应用固定质控细胞，理论上21三体、18三体、13三体、X和Y染色体数目异常的核型各占20；以1例原液固定质控细胞与另外的1例、2例、3例或4例按105、11、12、13、14、15、16、17、18、19、110、12050的体积比例或细胞数比例进行混合，制成不等比应用固定质控细胞，含有不。
7、同类型和比例的染色体数目异常，如某1例取1ML与另1例取50ML混合，则理论上前者的嵌合体比例为2，后者为98。5根据权利要求1、4所述的一种用于医学实验诊断质量控制的常见染色体数目异常诊断质控细胞株及其制备方法，其特征是每1份质控细胞包含有15种不同的染色体数目异常，可同时用于相对应的15种染色体数目异常检测的质量控制，无需备用多份质控物，使用方便、经济。6根据权利要求1、4所述的一种用于医学实验诊断质量控制的常见染色体数目异常诊断质控细胞株及其制备方法，其特征是每1份质控细胞由15种不同比例的染色体数权利要求书CN104059883A2/2页3目异常细胞组合而成，能设定染色体数目异常检出率。
8、百分比的界限和质量指标；5种染色体数目异常质控细胞之间以及与正常细胞之间可配制2100的某1种或数种染色体数目异常的嵌合体质控细胞，能反映、控制低比例染色体数目异常的检测质量，或达到与低比例染色体数目异常的实际病例的同步检测，具有更有效的质量控制和质量评价效果。7根据权利要求1所述的一种用于医学实验诊断质量控制的常见染色体数目异常诊断质控细胞株及其制备方法，其特征是染色体数目异常永生化质控细胞库包含以固定液甲醇冰醋酸31的为媒介的、20保存的、按年、月、日的制备日期及标本来源地址的大写英文字母编号的、细胞浓度为105/ML的、由原液固定质控细胞和应用固定质控细胞构成的固定质控细胞；以冻存液5二。
9、甲亚砜、95胎牛血清为媒介的、196液氮保存的、按年、月、日的制备日期及标本来源地址的大写英文字母编号的、细胞浓度为105/ML的、由原液活质控细胞系和应用活质控细胞系构成的活质控细胞系。8根据权利要求1所述的一种用于医学实验诊断质量控制的常见染色体数目异常诊断质控细胞株及其制备方法，其特征在于，涉及以染色体结构异常、除5种常见染色体数目异常以外的第1号至第22号染色体数目异常的细胞为原始细胞所制备的质控细胞株。权利要求书CN104059883A1/8页4一种常见染色体数目异常诊断质控细胞株及其制备方法技术领域0001本发明涉及一种常见染色体数目异常诊断质控细胞株及其制备方法，主要应用于医学领。
10、域的产前诊断实验室作常见染色体数目异常诊断的技术考核、室内质控和室间质评。背景技术0002染色体是细胞核中的遗传物质，人类有23对染色体，其中22对为常染色体，1对为决定男女性别的性染色体。染色体上载有遗传信息的基因，其中DNA占90以上，RNA含量随细胞周期及生长情况而有所变化，一般占110。0003染色体结构异常、数目异常及嵌合体，临床上表现为染色体病，属于常见的出生缺陷，如先天愚型、原发性闭经、两性畸型等。染色体结构异常包括染色体易位、缺失、倒位、环状等；染色体数目异常是指多出或缺少1条或数条染色体；嵌合体核型是指同一病例个体并存数种染色体核型。目前诊断染色体结构和数目异常的常规方法是染。
11、色体核型分析，即用被检的组织或细胞，经过细胞培养、002L/ML秋水仙素终止细胞生长、分离中期细胞、0075MOL/LKCL低渗、甲醇冰乙酸31固定等染色体制片程序后，再经胰酶消化、G显带、染色体核型分析，从而作出染色体结构和数目是否异常的判断，但染色体核型分析需经细胞培养和制片，一般需23周后才能作出诊断报告，不能达到快速诊断的目的。近年来开展的荧光原位杂交技术，能快速作出常见染色体数目是否异常的诊断，一般在24小时就能作出诊断报告，因为产前诊断中的重大遗传病如21三体、18三体、13三体、性染色体数目异常均属常见染色体数目异常，均可经荧光原位杂交作出快速诊断，所以近年来荧光原位杂交技术已被。
12、越来越广泛地应用于被定义为常见染色体数目异常的21三体、18三体、13三体、性染色体异常X与Y染色体的产前诊断。0004作为所开展的各类实验诊断项目，均应有相应规范的质量控制措施。实验室的质量控制是确保实验诊断结果准确性的前提，已成为政府行为。为了加强实验室的质量控制，我国于1982年成立了卫生部临床检验中心，下设室间质评办公室，专职从事于实验诊断项目的质量控制。卫生部卫医发1997第31号文件、临床实验室管理办法、医院评审标准实施细则以及大量的文献均指出，实验室必须有规范的质量控制标准，所开展的实验诊断项目必须参加卫生部临床检验中心组织的室间质评。自1982年以来，在临床检验学科先后开展了临。
13、床实验的室内质控、室间质评。包括了对各检验项目的实验前、中、后以及仪器、试剂和实验人员的质量控制。质量控制已渗透到临检、生化、微生物、免疫、基因、细胞形态学诊断等各个实验项目。实验室的质量控制已成为开展实验诊断项目的准入制度、成为医院等级评审的重要标准。0005产前诊断的质量控制已引起日益重视。随着我国对生殖健康和出生缺陷工作的是益重视，近年来各省市均建立了产前诊断中心，开展了21三体综合症、18三体综合征、神经管畸形等重大出生缺陷的产前筛查和产前诊断，其中与重大出生缺陷相关的胎儿羊水染色体异常的诊断已成为目前产前诊断的主要项目。由于产前诊断是新开展的学科，大多说明书CN104059883A2。
14、/8页5专业人员的技术经验较为缺乏，特别是对于疑难、罕见病例、国内外首报病例以及如猫叫综合症等染色体异常不明显但临床后果严重的病例，误诊现象时有发生。我国国家主席令1994年10月27日第三十三号公布的“产前诊断法规标准”以及国务院办公厅国发办199915号转发卫生部“关于做好提高出生人口素质工作意见”的通知中均强调指出，“各省、市产前诊断中心必须加强产前诊断的质量控制、严把质量关”。0006产前诊断的质量控制是许多学者致力于研究的重要课题。国外有较多的文献报道了产前诊断质量控制的重要性，SIKKEMARADDATZB等对产前细胞遗传学诊断的细胞培养及制片过程的影响因素作了深入的研究，提出了室。
15、内质量控制的方法；FRIESN和MERZE等提出了影像学产前诊断的质量控制方法；PIHLK等认为必须加强产前筛查的质量控制；在20022004年期间，BASTIENP等对法国23家实验室作了弓形虫产前分子诊断的室间质量评价，认为室间质评对促进实验室间的技术交流、发现问题、提高实验诊断质量起到重要的作用。0007虽然我国行政主管部门以及学术界十分重视产前诊断的质量控制包括室内质控和室间质评，但因没有可行的质控物，所以无法开展实质性的质量控制。也就是说，要开展产前诊断的室间质评和室内质控，首先必须要有质控物。研制可行的质控物、开展产前诊断质量控制是质量管理人员以及本专业技术人员长期以来想方设法解决。
16、但始终没有解决的难题。0008我们经长期的研究和探索，设想如果能成功研发常见染色体数目异常永生化质控细胞，再将这种细胞由主管部门分发到各级产前诊断实验室，同步于产前诊断的染色体病诊断，开展质量控制，考核各实验人员对常见色体病数目异常的诊断能力，对增加专业人员对疑难病例的诊断经验、控制实验条件、减少误诊、提高产前诊断的准确性，具有重要的意义。0009国外文献报道，猴肾病毒40SV40可以使某些人类细胞发生永生化。SV40T抗原基因的导入能加快转化细胞的生长速率，永生化细胞在体外多次传代后，仍具有相对稳定的增殖特性和功能状态。0010在产前诊断中，常有一些诊断报告后剩余的病例活细胞，本可用作质量控。
17、制细胞，但因为这类细胞未作特殊处理，很易死亡、难以大规模扩增以供许多实验室反复多次作质控使用，所以就难以用作质控细胞。发明内容0011为了解决产前诊断实验室作常见染色体数目异常诊断中无可行质控物的问题，本发明人提出了本发明。0012本发明的目的是要提供一种用于医学领域的产前诊断实验室作技术考核、室内质控和室间质评的常见染色体数目异常诊断质控细胞株及其制备方法。0013本发明的目的是这样实现的取因临床诊治需要而作染色体病诊断后并已确诊为常见染色体数目异常之一的21三体、18三体、13三体、X或Y染色体异常的剩余的呈贴壁生长的原代或传代活细胞，以转基因技术导入借T4DNA连接酶连接同时经BAMHI。
18、酶切的PCDNA31DNA和PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳分离的SV40LTAGDNA所构建的SV40LTAGPCDNA31重组质粒，使重组子与细胞DNA整合，以G418筛选整合有重组子的说明书CN104059883A3/8页6细胞株，作传代扩增后冻存细胞株，然后提取这些常见染色体数目异常的细胞株，按质控所需比例混合，使原先每例细胞株仅有单一染色体数目异常转变为含有一定比例的5种染色体异常的嵌合体质控细胞株，集中保存，备作荧光原位杂交等常见染色体数目异常诊断的质控细胞株。0014本发明以因临床诊治需要而作染色体病诊断后并已确诊为常见染色体数目异常之一的21三体、18三体、13三体、X或Y染色体异常。
19、的剩余的呈贴壁生长的原代或传代活细胞为原始细胞，标本易得如2012年本室发现21三体43例、18三体28例、13三体7例、X染色体数目异常15例、Y染色体数目异常12例且将废弃的剩余细胞转化为有效的质控细胞株；以转基因技术导入SV40LTAGPCDNA31重组质粒建成的质控细胞株具有永久生存、无限扩增的性能，可按需复制足够的细胞株以满足质控要求；将5类各具单一染色体数目异常的细胞株按质控所需比例混合后，使原先每例细胞株仅有单一染色体数目异常转变为并存一定比例的5类染色体异常的易误诊的嵌合体细胞株，从而增加了鉴别诊断、染色体嵌合体诊断的难度和复杂性，以疑难病例考核诊断水平、作室内质控和室间质评，。
20、对及时发现质量问题、制定改进预案、提高诊断水平具有意想不到的效果。附图说明0015图1是本发明制备的一种18三体绒毛组织细胞代表性细胞的质控细胞系。0016图2是本发明提出的5种染色体数目异常细胞等比例混合的质控细胞株的荧光原位杂交结果模拟图。0017如图1，细胞传代至第75代、培养至第9天时，呈圆形、梭形、铺满瓶底，其细胞生长汇合率达95以上。0018如图2，包含有5个细胞，其中细胞1为18三体细胞，11、12、13各代表1条18号染色体，比正常细胞多了1条18号染色体；细胞2为少1条性染色体的细胞，21代表1条X染色体，正常细胞应还有1条X染色体或1条Y染色体；细胞3为多1条Y染色体的细胞。
21、，31、32各代表1条Y染色体，正常细胞只有1条Y染色体；细胞4为13三体细胞，41、42、43各代表1条13号染色体，细胞内多了1条13号染色体，正常细胞为2条13号染色体；细胞5为21三体细胞，51、52、53各代表1条21号染色体，细胞内多了1条21号染色体，正常细胞为2条21号染色体。具体实施方式00191、原始细胞所用的原始细胞来源于因临床诊治需要而作染色体病诊断后并已确诊为常见染色体数目异常之一的21三体、18三体、13三体、X或Y染色体异常的剩余的呈贴壁生长的原代或传代活组织细胞；其原代或传代活组织细胞也可以涉及染色体结构异常的活组织细胞或除5种常见染色体数目异常以外的第1号至第。
22、22号染色体数目异常活组织细胞。细胞类型为胎儿羊水、绒毛组织等细胞。00202、SV40大T抗原DNA的提取SV40DNA酶切从市售购买含有大T抗原基因的SV40冰冻干粉或SV40质粒，溶解于适量的H2O或TE缓冲液中，加2UL10酶切缓冲液和18ULH2O，加限制性内切酶BAMHI15U/UGDNA，37温育1H，75加热15MIN，灭活酶，加入5UL电泳加样缓冲液也可通过加入05MOL/LEDTA终止反应以备电泳。SV40DNA电说明书CN104059883A4/8页7泳取电泳级琼脂糖以电泳缓冲液配成10琼脂糖凝胶，倒入已封好的凝胶灌制平台上，插上样品梳，待胶凝固后从制胶平台上除去封带，拔。
23、出梳子，放入加有足够电泳缓冲液的电泳槽中，缓冲液高出凝胶表面约1MM，用适量的10加样缓冲液制备DNA样品，然后用移液器将样品加入样品孔中，并同时做合适的DNA分子量标准对照物，接通电极，使DNA向阳极移动，在110V/CM凝胶的电压下电泳至足够分离DNA片段的距离时，关闭电源。从琼脂糖中分离约2600BPSV40大T抗原DNA在300360NM长波紫外光源下使用长波紫外光源以防止DNA损伤将含目标DNA片段的凝胶条带切下装入透析袋中，向透析袋内加入2ML电泳缓冲液，使之浸没凝胶，并排空汽泡，将透析袋水平放入电泳槽长度方向与电泳平行，加入适量缓冲液将透析袋浸没约67MM，接通电源，150伏电洗。
24、，在紫外灯下观察待DNA全部移出凝胶，改变电场方向继续通电1分钟，从透析袋中吸出缓冲液于15MLEPPENDORF管中，加入15倍体积正丁醇，混匀抽提去EB，在台式离心机上最高速2分钟，吸去上层正丁醇溶液，如此重复二次，自下层言DNA的溶液中加入等体积酚氯仿2个抽提2次，上清转入另一EPPENDORF管中加入1/10倍体积3MNAAC、2倍体积预冷无水乙醇，于20过夜，12000G，4下离心10分钟，得DNA沉淀，弃上清，加70乙醇洗涤2次，弃干乙醇，加入50LTE溶解DNA。00213、SV40大T抗原DNA与PCDNA31基因载体的连接取9L上述DNA成份015G、10L2连接缓冲液、1L。
25、10MMOL/LATP、T4DNA连接酶20500粘性末端单位或大肠杆菌DNA连接酶、PCDNA31空载体混合，15温育24H，构建成SV40T/PCDNA31重组子。00224、SV40T/PCDNA31重组子的扩增、分离与鉴定大肠杆菌感受态的制备其基本方法是用冰预冷的CACL2或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化，用CACL2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞，常用于成批制备感受态细菌，本法适用于大多数大肠杆菌菌株，操作过程简述如下从37培养1620H的新鲜平板中挑取一个单菌落如大肠杆菌DH52，或1ML新鲜的1620H过夜培养物，转到一个含有100MLLB培养基的1L或50。
26、0ML烧瓶中，于37剧烈振摇培养约23H旋转摇床200300R/MIN，每隔2030MIN测量OD600值04，在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ML聚丙烯离心管中，在冰上放置1020MIN，于4用SORVALLGS2转头或与其离心管相配的转头以4000R/MIN离心10MIN，以回收细胞，倒数培养液，将管倒置1MIN以使最后残留的痕量培养液流尽，以10ML用冰预冷的01MMCACL2重悬每份沉淀，放于冰上，于4用SORVALLGS3转头或与其相应的转头以4000R/MIN离心10MIN，以回收细胞，倒出培养液，将管倒置1MIN以使最后残留的痕量培养液流尽，每50ML初始培养物用2M。
27、L冰预冷的01MCACL2重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，70贮存备用，用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200L转移到无菌的微量离心管中，每管加入DNA或连接反应混合物体积10L，DNA50NG，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30MIN，将离心管放到预加温到40的循环水浴中的试管架上，放置90S2MIN，不要摇动试管，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却12MIN，每离心管加800LSOC培养基，用水浴将培养基加温到37，然后将管转移到37摇床上，温育45MIN使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因，将适当体积每个90MM平板可达200L已转化的感受。
28、态细胞转移到含200MMOL/LMGSO4和相应抗生素的SOB培养基上，将平板置于室温至液体被吸收，倒置平说明书CN104059883A5/8页8皿，于37培养，1216H后可出现菌落。重组子的筛选、扩增与提取用无菌牙签或灭菌接种针挑选单个菌落接种于5ML无菌的LB培养基或丰富培养基如超级肉汤或TB超级肉汤培养基中，培养过夜后，再加入到500ML含LB培养基含有适当抗生素的2L烧瓶中，再于37培养至饱和状态OD6004，为提高产量，应采用表面积较大及带折流板的烧瓶以尽量增大通气度，振摇速度应大于400R/MIN，于4，6000G离心10MIN，用4MLGTL溶液重悬沉淀，并转移到一个容积20M。
29、L的高速离心管中细菌沉淀可以在20或70无限期保存，加入1ML新配的含25MG/ML溶菌酶的GTE溶液，重悬沉淀，于室温放置10MIN，加入10ML新配NAOH/SDS溶液，并且轻轻混匀直至液体变得均一、清亮而粘稠，于冰上放置10MIN，加入75ML乙酸溶液，用吸管轻轻搅拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置10MIN，于4，20000G离心10MIN，将上清轻轻倒入至另一个干净的离心管中，如果有可见的飘浮物可用数层纱布过滤，加入06倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置510MIN，于室温，1500G离心10MIN，加入2ML70乙醇轻轻洗涤沉淀，然后短暂快速离心，吸去乙醇，并真空干燥沉淀可。
30、在4长期保存。重组子的鉴定上述从感受态大肠杆菌中提取的DNA含重组子SV40T/PCDNA31，同上法用限制性内切酶BAMHI进行酶切，10G/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得大小约2600BP及5600BP的2条带，前者符合GENBANK中SV40T片段的大小。00235、SV40T/PCDNA31重组子导入染色体异常组织细胞及其阳性克隆的筛选与扩增染色体异常组织细胞的收集与培养以无菌操作提取在作其他实验或其他检查后多余、废弃的染色体异常组织细胞，以细胞终浓度约为1105/ML备用，取上述呈单个分散的细胞或经处理后成为单个分散的细胞接种于含510NMOL/L胰岛素、20胎牛血清的RPMI1640液。
31、中或接种于含20胎牛血清、510NMOL/L胰岛素的低糖DMEM细胞培养基中，置于37，体积分数5CO2培养箱内，细胞贴壁培养约34天、细胞形态为梭形、小园形细胞不到10、贴壁细胞的汇合率达7585、处于刚进入对数生长期时，即考虑收集培养细胞，先吸干净培养瓶中的培养液，加入12ML001的胶原酶II液以消化液能覆盖整个瓶底为准，静置210MIN显微镜下动态监测，吸去胶原酶II液，加入低糖DMEM或RPMI1640培养液，用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液，转入离心管离心沉淀，去上清液，细胞沉淀用上述培养液清洗2次后，制成悬液，用作重组子导入。SV40T/PCDNA31的导入在。
32、上法分离所得细胞中，选用脂质体转染法，将上述2105个细胞接种于35MM培养皿中，在37CO2培养箱培养2436H，使细胞生成单层、细胞形态为梭形、仅见少于10小园形细胞、贴壁细胞的汇合率达5565、处于将进入或刚进入对数生长期时，即转染重组子SV40T/PCDNA31，在15ML微量离心管中制备下列溶液管A，将SV40T/PCDNA31溶于100L无血清培养液中；管B，将20LLIPOFECTAMINE溶于80L无血清培养液中，将管A和管B混匀，室温下置45MIN，吸去细胞培养液后，用无血清培养液洗涤细胞2次，在LIPOFECTAMINESV40T/PCDNA31混合物中加入1ML无血清培养。
33、液，轻轻混匀，再滴加至细胞培养皿内，然后加入1ML无血清培养液，在CO2培养箱培养10H，吸出转染液，加4ML完全培养液继续培养16H，弃去培养液，更换浓度为400MGL1的G418培养液继续培养，810天后选择单个细胞集落进行亚克隆，扩大培养后再加大G418浓度到800MGL1，将能在高浓度的G418环境中稳定生长的克隆进行传代扩增，另外染色体异常组织细胞与SV40或EB病毒共同培养后，感染了病毒DNA并发生整合的染色体异常组织说明书CN104059883A6/8页9细胞进行传代扩增。00246、染色体数目异常组织细胞株的传代、扩增收集上述经脂质体转染法导入SV40大T抗原基因的阳性单克隆细。
34、胞集落，以低糖DMEM或RPMI1640培养基配成约1105/ML的细胞悬液，接种于数瓶2050CM2培养瓶中，加入5ML含20ML/L胎牛血清、10NMOL/L胰岛素的低糖DMEM或RPMI1640培养基，如图1所示，使细胞贴壁生长，至汇合率达8085、处于对数生长期的前期时收集细胞，再按上述步骤传代培养，如此反复传代接种、培养，记录代数并观察细胞生长特点。如图1所示，细胞传代至第75代、培养至第9天时，呈圆形、梭形、铺满瓶底，其细胞生长汇合率达95以上，从第76代以后，传代细胞生长减慢、贴壁稀疏。00257、原液质控细胞株的制备1原液活质控细胞株的制备取生长状态良好、处于对数生长期的不同世。
35、代的贴壁细胞，经过消化、终止和离心分离1200R/MIN，6MIN，用含二甲亚砜的冻存液051ML重悬细胞，细胞密度为5105个/ML，加入冻存管，经4，05H；20，2H；70，过夜，入196液氮冻存。2原液固定质控细胞的制备1终止培养、收获细胞前23H，加入浓度为20G/ML的秋水仙素，每5ML培养基中用7号针头，加34滴使最终浓度为01G/ML。轻轻摇匀后，再放入恒温箱内，继续培养23H，以积累较多停止在中期的分裂象。2收获细胞由恒温箱取出培养瓶，以025胰蛋白酶消化贴壁细胞5分钟，每次收获1瓶，用吸管充分吹打培养瓶瓶壁，使细胞全部脱离瓶壁，然后将细胞液移至锥形离心管内，1500转/MI。
36、N，离心10MIN，去上清液。3低渗处理加入37预温的0075MOL/LKCL8ML，反复吹打约一百次后，置37水浴箱中低渗处理25MIN左右。4预固定加入新鲜制备固定液1ML甲醇冰醋酸31，轻轻混匀。5离心2000转/MIN，离心10MIN，吸弃上清液。6固定沿离心管壁慢慢加入固定液8ML，轻轻混匀，固定10MIN。7离心同上，吸去上清液。8再固定加固定液8ML，混匀，固定10MIN。9离心同上，吸去上清液。10制备原液质控细胞悬液根据细胞量多少，加入适量固定液，充分混匀，制成浓度为105/ML的细胞悬液，保存备用。00268、应用质控细胞株的制备1应用活质控细胞株的制备提取5例在不同时间制。
37、备的、冻存于196液氮中的染色体数目异常的原液活质控细胞株，以5例之比均为11的等浓度、等体积或细胞数进行混合如各取1ML，混合液总体积为5ML，制成等比应用活质控细胞株，理论上21三体、18三体、13三体、X和Y染色体数目异常的核型各占20；另外根据需要，取1例原液活质控细胞株与另外的1例、2例、3例或4例按105、11、12、13、14、15、16、17、18、19、110、12050的体积比例或细胞数比例进行混合，制成不等比应用活质控细胞株，含有不同类型和比例的染色体数目异常，如某1例取1ML与另1例取50ML混合，则理论上前者的嵌合体比例为2，后者为98；如某1例取1ML与另外1例染色。
38、体正常的同浓度细胞悬液50ML混合，则理论上前者的嵌合体比例为2。此外，应活质控细胞株还可进行传代扩增后使用。2应用固定质控细胞的制备提取5例在不同时间制备的染色体数目异常的原液固定质控细胞，以5例之比均为11的等浓度、等体积或细胞数进行混合如各取1ML，混合液总体积为5ML，制成等比应用固定质控细胞，理论上21三体、18三体、13三体、X和Y染色体数目异常的核型各占20；另外根据需要，取1例原液固定质控细胞与另外的1例、2例、3例或4例按105、11、12、13、14、15、16、17、18、19、110、120说明书CN104059883A7/8页1050的体积比例或细胞数比例进行混合，制。
39、成不等比应用固定质控细胞，含有不同类型和比例的染色体数目异常，如某1例取1ML与另1例取50ML混合，则理论上前者的嵌合体比例为2，后者为98；如某1例取1ML与另外1例染色体正常的同浓度细胞悬液50ML混合，则理论上前者的嵌合体比例为2。经如此反复传代扩增和混合不同病例的染色体数目异常细胞所制备的质控细胞株，不但数量足够的多，达到用之不尽，而且使原先一般每份原液活质控细胞株或原液固定质控细胞中只有一种染色体数目异常转变为具有在同一份应用活质控细胞株或应用固定质控细胞中同时含有多种不同比例的、不同类型的易误诊染色体数目异常的特征，从而增加了鉴别诊断、染色体嵌合体诊断的难度和复杂性，标本易得且将。
40、废弃的多余细胞转化为可用于染色体核型分析的技术考核、室内质控及室间质评，在室内质量控制、室间质量评价、提高诊断水平的应用中具有显著的效果。00279、染色体数目异常永生化质控细胞库的建立将上述在不同时间制备的固定质控细胞原液固定质控细胞和应用固定质控细胞以甲醇冰醋酸31的固定液配成浓度为105/ML的细胞悬液，经分装、加满固定液至管口和封口后，按年、月、日的制备日期及标本来源地址的大写英文字母编号，集中保存于20，备作染色体数目诊断的质量控制之用。同时将相应的5种染色体数目异常核型的标准描述、按照年、月、日的制备日期以及标本来源地址的大写英文字母编号录入计算机，使用时从计算机中抽取待用质控细胞。
41、编号，然后从质控细胞库中找出相应的质控细胞作质量评价；活质控细胞株原液活质控细胞株和应用活质控细胞株以冻存液5二甲亚砜、95胎牛血清配成浓度为105/ML的细胞悬液，经每管1ML分装后，按年、月、日的制备日期及标本来源地址的大写英文字母编号，集中保存于196液氮中，备作染色体数目诊断的质量控制之用。同时将相应的各种染色体数目异常核型的标准描述、按照年、月、日的制备日期以及标本来源地址的大写英文字母编号录入计算机，使用时从计算机中抽取待用质控细胞编号，然后从质控细胞库中找出相应的质控细胞作质量评价002810、室内质控中的应用从计算机中抽取质控细胞编号，然后从质控细胞库中找出相应的质控细胞，发送。
42、到各实验室或相关专业技术人员，在收到质控细胞后，作为室内质控物，与临床待作染色体数目异常诊断的标本在相同条件下作同步染色体数目诊断。如果质控细胞的染色体数目诊断结果没有达到要求，则说明诊断方法的试剂、仪器、操作方法等方面有问题，应查明原因、重新检测后报告结果。002911、室间质评中的具体应用0030准备质控细胞取1例或数例质控细胞，按需要的例次或比例混合，混合的质控细胞株还可经扩增后发放使用。现以5例染色体数目异常质控细胞株等比例细胞数混合为例，每种染色体数目异常的细胞各占20。然后将质控细胞发送到各受试对象做室间质量评价。0031荧光原位杂交FISH检测质控细胞染色体数目及结果判定各受试对。
43、象收到质控细胞后，如为活质控细胞株，则可酌情对质控细胞株进行传代扩增后测试，以增加细胞数；如为固定质控细胞，则直接测试。试剂采用瑞士雅培制药有限公司的ANEUVYSION试剂盒，含有两个不同的杂交区域，共完成5条染色体的数目分析第18号SPECTRUMAQUA，青色、XSPECTRUMGREEN，绿色、YSPECTRUMORANGE，红色号染色体为计数探针CHROMOSOMEENUMERATINGPROBE，CEP，混合后杂交第1个区域；第13号SPECTRUM说明书CN104059883A108/8页11GREEN，浅绿色和21SPECTRUMORANGE，紫红色号染色体为区域特异性探针LO。
44、CUSSPECIFICIDENTIFIER，LSI，混合后杂交第2个区域。方法是取13和21号染色体为位点特异探针，18、X和Y染色体为着丝粒探针，将质控细胞株与实验室被检标本同步，经2000R/MIN离心10MIN，去上清，留沉淀02ML，离心管中加入4ML胶原酶37温浴30MIN，2000R/MIN离心10MIN，去上清，然后加入5ML预温的15MOL/LKCL，在37水浴中低渗25MIN，2000R/MIN离心10MIN，去上清。加入新配制的固定液甲醇冰醋酸31固定10MIN，离心2000R/MIN离心10MIN去上清，反复两次。滴片，自然干燥老化。将制备好的标本片自冰柜中取出，依次放人。
45、70、85、100乙醇中脱水，室温干燥，预处理好的玻片置73，70甲酰胺中5MIN。在暗室中将两种探针混合液各10L加在玻片的靶区域，盖上盖玻片，避免产生气泡，封片胶将盖玻片封好，置暗湿盒中42杂交过夜，清洗，在高倍镜下观察杂交效果，每例标本计数60100个细胞，记录杂交信号数目并采集图像，要求细胞核膜必须完整，核内杂交信号明亮清晰无重叠，信号弥散及微弱均不作统计。0032测试结果经探针杂交后，细胞内的18号染色体显示青色的点，每条18号显示1个青色的点，2条则显示2个青色的点，3条则显示3个青色的点；细胞内X女性染色体显示绿色的点，每条X染色体显示1个绿色的点，2条则显示2个绿色的点，3条则。
46、显示3个绿色的点；细胞内Y男性染色体显示红色的点，每条Y染色体显示1个红色的点，2条则显示2个红色的点，3条则显示3个红色的点；细胞内的13号染色体显示浅绿色的点，每条13号显示1个浅绿色的点，2条则显示2个浅绿色的点，3条则显示3个浅绿色的点；细胞内的21号染色体显示紫红色的点，每条21号显示1个紫红色的点，2条则显示2个紫红色的点，3条则显示3个紫红色的点。0033图2为5种染色体数目异常质控细胞等浓度等量混合、制片、荧光原位杂交所得结果模拟图，如图2所示，细胞1为18三体细胞，11、12、13各代表1条18号染色体，细胞内多了1条18号染色体，有3个青色的点，正常细胞为2条18号染色体、。
47、2个青色的点；细胞2为少1条性染色体的细胞，21代表1条X染色体，只有1个绿色的点，正常细胞应还有1条X染色体1个绿色的点或1条Y染色体1个红色的点；细胞3为多1条Y染色体的细胞，31、32各代表1条Y染色体，正常细胞只有1条Y染色体、1个红色的点；细胞4为13三体细胞，41、42、43各代表1条13号染色体，细胞内多了1条13号染色体，有3个浅绿色的点，正常细胞为2条13号染色体、2个浅绿色的点；细胞5为21三体细胞，51、52、53各代表1条21号染色体，细胞内多了1条21号染色体，有3个紫红色的点，正常细胞为2条21号染色体、2个紫红色的点。0034结果评价各受试实验室将结果包括染色体数目异常的种类、比例回报室间质评组织者，由组织者对各室结果作统一评比成绩，找出误诊原因、讨论改正措施，以动态发现质量问题、加强质量管理、提高诊断质量。说明书CN104059883A111/1页12图1图2说明书附图CN104059883A12。