一种基于壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610693711.0 (22)申请日 2016.08.22 (71)申请人 陈智毅 地址 510150 广东省广州市荔湾区多宝路 63号 (72)发明人 陈智毅 罗慕华 司徒冰 廖剑艺 余金穗 李冰城 (74)专利代理机构 广东世纪专利事务所 44216 代理人 刘卉 (51)Int.Cl. A61K 49/22(2006.01) (54)发明名称 一种基于壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂 的制备方法 (57)摘要 一种基于壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂 的制备方法， 是通过酰。

2、化反应对羧甲基壳聚糖进 行改性， 合成了具有两亲性的正己酰羧甲基壳聚 糖， 在此基础上加入液态氟碳， 采用超声乳化方 法制得由液态氟碳内核和壳聚糖衍生物外壳构 成的纳米级超声造影剂。 与现有技术相比， 本发 明所用的高分子材料安全无毒， 价格明显低于合 成磷脂， 且造影剂制备工艺简便， 操作条件温和， 具有较好的潜在应用前景。 权利要求书1页 说明书4页 附图5页 CN 106139174 A 2016.11.23 CN 106139174 A 1.一种基于壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的制备方法， 该造影剂由液态氟碳内核和 壳聚糖衍生物外壳构成， 所述壳聚糖衍生物外壳的材料为正己酰羧甲基壳聚糖。

3、， 其特征在 于包括以下步骤： （1） 合成正己酰羧甲基壳聚糖； （2） 配置正己酰羧甲基壳聚糖水溶液； （3） 将液态氟碳滴加到正己酰羧甲基壳聚糖水溶液中， 进行超声乳化处理， 使液态氟碳 包裹在正己酰羧甲基壳聚糖内， 即得到由液态氟碳内核和壳聚糖衍生物外壳构成的纳米级 超声造影剂。 2.根据权利要求1所述基于壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的制备方法， 其特征在于 所述步骤 （1） 的具体操作方法如下： （11） 称取250mg羧甲基壳聚糖， 将其溶解于20ml纯水并搅拌24h后， 加入20ml甲醇搅拌 均匀； （12） 在快速磁力搅拌下逐滴加入0.33ml的正己酸酐, 并维持转速在1000r。

4、pm的搅拌条 件下反应12 h； （13） 用乙醇水溶液 （25% ， v/v） 透析24h， 再用纯水透析24h， 冷冻干燥即得到改性后的 壳聚糖衍生物正己酰羧甲基壳聚糖， 并通过傅里叶红外光谱和氢核磁波谱图分析鉴定 该产物。 3.根据权利要求1所述基于壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的制备方法， 其特征在于 所述步骤 （2） 的具体操作方法如下： 取正己酰羧甲基壳聚糖20mg50mg分散于10ml纯水中溶解。 4.根据权利要求1所述基于壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的制备方法， 其特征在于 所述步骤 （3） 的具体操作方法如下： （31） 取正己酰羧甲基壳聚糖水溶液， 冰浴处理10min后， 加。

5、入100ul200ul液态氟碳； （32） 在冰浴条件下， 对加入了液态氟碳的正己酰羧甲基壳聚糖水溶液进行超声乳化处 理， 即得到壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂， 并将造影剂置于4冰箱中备用； 所述超声满 足如下条件： 超声振幅为20%， 超声总时间为2min， 每超声启动3s ， 间歇时间1s。 5.根据权利要求1所述基于壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的制备方法， 其特征在于： 所述液态氟碳内核的材料为全氟戊烷或全氟己烷。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106139174 A 2 一种基于壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的制备方法 技术领域 0001 本发明属于超声影像诊断技术领域， 具。

6、体是涉及一种基于壳聚糖衍生物纳米级超 声造影剂的制备方法。 背景技术 0002 超声造影剂目前已广泛应用于临床疾病的诊断， 大大提高了超声诊断的准确率， 是超声医学发展史上的一个 “里程碑” 。 相对于常规CT、 MRI等成像方式， 超声造影拥有无创 无辐射、 操作方便、 价格低廉等优势， 成为了当前临床上肿瘤诊断的重要手段。 0003 而安全高效的超声造影剂是超声造影的基础和关键。 目前临床上常用的是 Sonovue为代表的超声微泡造影剂， 为脂质含气超声造影剂， 其稳定性较差， 容易发生自发 破裂。 且其粒径大多集中在210 m范围内， 而毛细血管内皮间隙约为380780nm， 因此常 用。

7、微泡超声造影剂是无法穿透血管内皮间隙而到达肿瘤组织， 缺乏对血管外肿瘤组织细胞 的特异性， 且对于乏血供的肿瘤容易漏检， 这大大限制了超声造影对肿瘤等疾病的诊断能 力。 0004 高分子聚合物材料具有生物相容性好， 可生物降解等优点， 应用其制备的超声造 影剂， 粒径分布较均匀， 稳定性高， 抗压性能较好， 已成为目前超声造影剂研究的热点。 而长 氟碳链的全氟碳化合物在低温时呈液态， 即液态氟碳， 当外界压力降低或温度升高至其沸 点时， 其会发生液气相变， 由液体变成气体。 其中， 全氟戊烷在常压下的沸点为29， 而人体 温度为37， 故其是一种较适于制备液气相变型超声造影剂的氟碳材料。 发明。

8、内容 0005 本发明的目的在于针对上述存在问题和不足， 提供一种包裹液态氟碳， 制备工艺 简便、 安全无毒、 价格低廉、 生物相容性好的基于壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的制备方 法。 0006 本发明的技术方案是这样实现的： 本发明所述基于壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的制备方法， 该造影剂由液态氟碳内 核和壳聚糖衍生物外壳构成， 所述壳聚糖衍生物外壳的材料为正己酰羧甲基壳聚糖， 其特 点是包括以下步骤： （1） 合成正己酰羧甲基壳聚糖； （2） 配置正己酰羧甲基壳聚糖水溶液； （3） 将液态氟碳滴加到正己酰羧甲基壳聚糖水溶液中， 进行超声乳化处理， 使液态氟碳 包裹在正己酰羧甲基壳聚糖内， 。

9、即得到由液态氟碳内核和壳聚糖衍生物外壳构成的纳米级 超声造影剂。 0007 其中， 所述步骤 （1） 的具体操作方法如下： （11） 称取250mg羧甲基壳聚糖， 将其溶解于20ml纯水并搅拌24h后， 加入20ml甲醇搅拌 均匀； 说 明 书 1/4 页 3 CN 106139174 A 3 （12） 在快速磁力搅拌下逐滴加入0.33ml的正己酸酐, 并维持转速在1000rpm的搅拌条 件下反应12 h； （13） 用乙醇水溶液 （25% ， v/v） 透析24h， 再用纯水透析24h， 冷冻干燥即得到改性后的 壳聚糖衍生物正己酰羧甲基壳聚糖， 并通过傅里叶红外光谱和氢核磁波谱图分析鉴定 该。

10、产物。 0008 所述步骤 （2） 的具体操作方法如下： 取正己酰羧甲基壳聚糖20mg50mg分散于10ml纯水中溶解。 0009 所述步骤 （3） 的具体操作方法如下： （31） 取正己酰羧甲基壳聚糖水溶液， 冰浴处理10min后， 加入100ul200ul液态氟碳； （32） 在冰浴条件下， 对加入了液态氟碳的正己酰羧甲基壳聚糖水溶液进行超声乳化处 理， 即得到壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂， 并将造影剂置于4冰箱中备用； 所述超声满 足如下条件： 超声振幅为20%， 超声总时间为2min， 每超声启动3s ， 间歇时间1s。 0010 所述液态氟碳内核的材料为全氟戊烷或全氟己烷。 0011。

11、 本发明与现有技术相比， 具有以下优点： 本发明所用的材料是由天然高分子聚合物壳聚糖改性后制得的， 材料安全无毒、 生物 相容性良好、 价格低于合成磷脂； 而且， 本发明的制备工艺简便， 应用范围广， 可通过对聚合 物进行修饰， 使其具有靶向特性， 制备成靶向超声造影剂； 同时， 该聚合物可用作为药物和 基因载体。 0012 下面结合附图对本发明作进一步的说明。 附图说明 0013 图1为本发明所述正己酰羧甲基壳聚糖的傅里叶红外光谱图。 0014 图2为本发明所述正己酰羧甲基壳聚糖的核磁共振氢谱图。 0015 图3为本发明所述正己酰羧甲基壳聚糖的细胞毒性分析图。 0016 图4为本发明所述纳米。

12、级超声造影剂的透射电镜图。 0017 图5为本发明所述纳米级超声造影剂的粒径分布图。 0018 图6为本发明所述纳米级超声造影剂的电位图。 0019 图7为本发明所述纳米级超声造影剂的体外超声成像图。 具体实施方式 0020 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。 0021 实施例1： 合成壳聚糖衍生物正己酰羧甲基壳聚糖 称取250 mg羧甲基壳聚糖， 该羧甲基壳聚糖的分子量为20 KD， 将其溶解于20ml纯水并 搅拌24 h后， 加入20ml甲醇搅拌均匀； 然后在快速磁力搅拌条件下逐滴加入0.33 ml正己酸 酐, 并在1000 rpm转速下搅拌反应12h； 然后用乙醇水溶液 （25%。

13、 ， v/v） 透析24 h， 再用纯水 透析24 h， 冷冻干燥即得到改性后的壳聚糖衍生物正己酰羧甲基壳聚糖， 并通过傅里 叶红外光谱和氢核磁波谱图分析鉴定该产物。 0022 羧甲基壳聚糖和正己酰羧甲基壳聚糖的红外谱图如图1所示， 由于羧甲基壳聚糖 脱乙酰度高， 所以对应于伯氨基上N-H的弯曲振动， 掩盖酰胺I带和II带的吸收峰。 产物在 说 明 书 2/4 页 4 CN 106139174 A 4 1500-1550cm-1出现吸收峰， 且谱带明显增强， 2960cm-1和2870cm-1属于甲基的伸缩振动， 其 吸收峰增强， 说明碳链已连接到氨基上。 0023 正己酰羧甲基壳聚糖的氢核磁。

14、波谱图如图2所示， 其化学位移为1.9-2.9ppm为乙 酰化基团， 化学位移为3.6-4.0ppm为糖环上的氢位， 2.0 ppm 为羧甲基壳聚糖-COCH3上的 氢。 化学位移0.8ppm 、 1.2 ppm 、 1.5 ppm 、 2.2ppm 为连接在氨基上己烷上甲基和亚甲基。 0024 实施例2： 正己酰羧甲基壳聚糖的细胞毒性实验 分别设置不同浓度 （1mg、 5mg、 10mg） 的正己酰羧甲基壳聚糖材料对A2780细胞的毒性作 用。 用含10%血清的培养基对正己酰羧甲基壳聚糖材料进行分散， 配制成浓度分别1 mg/ml， 5 mg/ml， 10 mg/ml； 对A2780细胞进行。

15、复苏并传代待其到指数生长期时， 进行细胞计数， 根 据需要调整细胞密度； 用96孔板铺种细胞， 每孔细胞悬液100ul， 每孔分别接种 1*104 个细 胞， 在37培养箱中培养24h； 用PBS对板内细胞进行清洗， 加入3种不同浓度的正己酰羧甲 基壳聚糖材料， 每种浓度设置6个复孔， 对照组加入不含纳米粒的空白培养基， 细胞与纳米 粒孵育 24 h ； 配置10% CCK-8培养基吸取原培养板上的培养基， 加入含有10%的 CCK-8 到 含10%血清的培养基， 放回培养箱继续培养 1h。 在全自动酶标仪上测定450 nm处吸光度 A。 按照公式计算， 细胞存活率= （实验组 OD 值调零组。

16、 OD 值） / （对照组 OD 值-调零组OD 值） 100%。 0025 图3结果显示： 随着材料浓度增大， 正己酰羧甲基壳聚糖的细胞毒性随之增大， 存 活率减小， 但增大到10mg/ml时， 其细胞存活率仍在90%以上， 说明该材料的生物安全性较 好， 无明显体外细胞毒性作用。 0026 实施例3： 制备正己酰羧甲基壳聚糖包裹液态氟碳的纳米级超声造影剂， 其步骤如 下： （1） 合成壳聚糖衍生物正己酰羧甲基壳聚糖； （2） 配置正己酰羧甲基壳聚糖水溶液， 其方法是： 取正己酰羧甲基壳聚糖20 mg50 mg 分散于10 ml纯水中溶解形成为壳聚糖衍生物胶束水溶液， 且壳聚糖衍生物胶束水溶。

17、液的 浓度为2 mg/ml； （3） 取正己酰羧甲基壳聚糖水溶液冰浴处理10 min后， 加入100 ul200ul液态氟碳， 所述液态氟碳为全氟戊烷或全氟己烷， 而在本实施例中， 液态氟碳为全氟戊烷， 且正己酰羧 甲基壳聚糖与全氟戊烷的比例为1mg： 10 l； 然后在冰浴条件下， 对加入液态氟碳的壳聚糖 衍生物胶束水溶液进行超声乳化处理， 使液态氟碳包裹在正己酰羧甲基壳聚糖内， 即得到 壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂， 并置于4冰箱中备用； 所述超声满足如下条件： 超声振幅为 20%， 总超声时间为2min， 超声启动3s ， 间歇时间 1s。 0027 实施例4： 纳米级超声造影剂的表征 。

18、（1） 采用光学显微镜及透射电镜进行表面形貌和构成观察 用生理盐水将纳米级超声造影剂进行稀释后， 在倒置显微镜下观察， 对其加热至37， 可观察到到造影剂液滴分散良好， 表面光滑透明， 大小较均匀。 透射电镜下观察制备得到的 超声造影剂呈圆形， 表面光滑透亮， 如图4所示。 0028 （2） 粒径与电位： 将制得的包裹液态氟碳的纳米超声造影剂， 取超纯水稀释后， 用动态光散射法测定其 说 明 书 3/4 页 5 CN 106139174 A 5 粒径并使用激光粒度仪检测其Zeta电位， 结果显示其平均粒径为 （205.945.31） nm， 如图5 所示， Zeta电位值为 （-31.96.0。

19、8） mV， 如图6所示。 0029 实施例5： 包裹全氟戊烷的纳米级超声造影剂的体外超声造影实验 在水槽中倒满37脱气水， 用注射器抽取4 ml的超声造影剂悬液到斯巴达吸管， 放置 于脱气水下预热5 min， 超声探头浸没于水面下并正对斯巴达吸管， 用Philips IU-22 型超 声诊断仪 （探头型号L12-5） 进行超声成像， 分别比较在不同载体浓度 （2mg-5mg） 、 不同PFP体 积比 （1-2%） 、 不同时间段 （0-12min） 及同一浓度下， 在不同机械指数 （MI=0.4-0.6） 观察其成 像效果。 可见斯巴达吸管内回声增强， 成密集细点状回声图， 如图7所示。 0。

20、030 此外， 本发明制备的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂中发现： 改变壳聚糖和液态 氟碳的比例、 超声功率与时间等都会影响造影剂的产量、 粒径分布及造影效果。 0031 而且， 本发明是采用纳米粒自组装方式制备了具有两亲性的壳聚糖衍生物胶束水 溶液 （正己酰羧甲基壳聚糖水溶液） ， 在低温条件下将液态氟碳与该具有两亲性的壳聚糖衍 生物胶束水溶液混合， 采用超声细胞破碎仪或超声波清洗机进行乳化， 成功制备了以两亲 性壳聚糖衍生物正己酰羧甲基壳聚糖为外壳， 包裹液态氟碳的纳米级超声造影剂。 0032 本发明是通过实施案例来描述的， 但并不对本发明构成限制， 参照本发明的描述， 所公开的实施例的其他变化， 如对于本领域的专业人士是容易想到的， 这样的变化应该属 于本发明权利要求限定的范围之内。 说 明 书 4/4 页 6 CN 106139174 A 6 图1 说 明 书 附 图 1/5 页 7 CN 106139174 A 7 图2 图3 说 明 书 附 图 2/5 页 8 CN 106139174 A 8 图4 说 明 书 附 图 3/5 页 9 CN 106139174 A 9 图5 图6 说 明 书 附 图 4/5 页 10 CN 106139174 A 10 图7 说 明 书 附 图 5/5 页 11 CN 106139174 A 11 。