九香虫总生物碱在制备具有抗菌、消炎、解热和免疫促进功能的药物或保健品中的应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103301160 A (43)申请公布日 2013.09.18 CN 103301160 A *CN103301160A* (21)申请号 201310244040.6 (22)申请日 2013.06.19 A61K 35/64(2006.01) A23L 1/29(2006.01) A61P 31/04(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61P 37/04(2006.01) (71)申请人 中国人民解放军第三军医大学第一 附属医院 地址 400038 重庆市沙坪坝区高滩岩正街 30 号 (72)发明人 孙凤军 夏培元 王显凤 陈剑鸿 冯伟。

2、 (74)专利代理机构 北京同恒源知识产权代理有 限公司 11275 代理人 赵荣之 (54) 发明名称 九香虫总生物碱在制备具有抗菌、 消炎、 解热 和免疫促进功能的药物或保健品中的应用 (57) 摘要 本发明公开了九香虫总生物碱在制备具有抗 菌、 消炎、 解热和免疫促进功能的药物或保健品中 的应用， 九香虫总生物碱的生物活性检测结果显 示， 九香虫总生物碱对肺炎双球菌、 金黄色葡萄球 菌、 甲型溶血型链球菌、 乙型溶血型链球菌和变形 杆菌都有不同程度的抑制作用， 对肺炎双球菌和 金黄色葡萄球菌有显著的抑制作用， 对二甲苯所 致小鼠耳肿胀有明显的抗炎作用， 对干酵母所致 大鼠的发热反应有明显。

3、的解热作用， 并能显著增 强小鼠网状内皮系统的吞噬功能， 具有免疫促进 作用， 且毒性低， 使用安全。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 (10)申请公布号 CN 103301160 A CN 103301160 A *CN103301160A* 1/1 页 2 1. 九香虫生物碱在制备具有抗菌、 消炎、 解热和免疫促进功能的药物或保健品中的应 用。 2. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述菌为肺炎双球菌、 金黄色葡萄球菌、 甲型溶血型链球菌、 乙型溶血型链球菌和变。

4、形杆菌中的任一种或多种。 3. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述九香虫总生物碱采用以下方法制得 ： 将九香虫用水加热提取， 提取液上弱极性大孔吸附树脂柱， 先用无机碱溶液洗至流出液无 色， 再用水洗至流出液呈中性， 再用体积分数为30%70%的乙醇溶液洗脱， 收集洗脱液， 浓 缩， 干燥， 即得九香虫总生物碱。 4. 根据权利要求 3 所述的应用， 其特征在于， 所述弱极性大孔吸附树脂为大孔吸附树 脂 D101。 5. 根据权利要求 4 所述的应用， 其特征在于， 提取液上弱极性大孔吸附树脂柱， 先用质 量分数为 0.2% 的氢氧化钠溶液洗至流出液无色， 再用水洗至流出液呈中。

5、性， 再用体积分数 为 50% 的乙醇溶液洗脱。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 将九香虫加水煎煮2次， 每次加入10倍重 量的水煎煮 1 小时， 合并煎煮液， 离心， 取上清液作为提取液。 权 利 要 求 书 CN 103301160 A 2 1/6 页 3 九香虫总生物碱在制备具有抗菌、 消炎、 解热和免疫促进功 能的药物或保健品中的应用 技术领域 0001 本发明属于医药技术领域， 涉及九香虫总生物碱在药物和保健品制备领域中的新 用途。 背景技术 0002 抗生素的使用使人类许多严重的细菌感染性疾病得到有效控制， 但抗生素的不合 理使用也导致了耐药菌株的增加， 降低了现有抗。

6、生素的抗菌效率。 因此， 减少耐药菌株的生 成和研制新的抗菌药物成为 21 世纪医学界的重要课题。中药几千年来为中国人的健康作 出了重大贡献， 在现代预防和控制细菌性感染疾病方面也发挥了积极作用。由于中药的特 殊性， 细菌较少对中药产生耐药， 因此， 研究和开发抗菌中药对解决耐药菌株的产生和抗生 素短缺的问题具有重要意义。 0003 中药九香虫为蝽科昆虫九香虫 Aspongopus chinensis Dallas 的干燥全体， 始载 于 本草纲目 ， 其味咸、 性温， 归肝、 脾、 肾经， 具有理气止痛、 温中助阳的功效， 用于胃寒胀 痛， 肝胃气痛， 肾虚阳痿， 腰膝酸痛等疾病。 现代医学。

7、研究表明， 九香虫含有脂肪油、 蛋白质、 甲壳质、 维生素、 黄酮、 蒽醌、 生物碱等化学成分， 具有抗菌、 抗癌、 止癌痛、 促血管生成等药 理作用。但有关九香虫总生物碱的生物活性尚未见报道。 发明内容 0004 有鉴于此， 本发明的目的在于提供九香虫总生物碱的生物活性， 以及其在药物和 保健品制备领域中的新用途。 0005 为解决上述问题， 本发明从抗菌、 消炎、 解热和免疫调节几个方面考察了九香虫总 生物碱的生物活性， 结果显示， 九香虫总生物碱对肺炎双球菌、 金黄色葡萄球菌、 甲型溶血 型链球菌、 乙型溶血型链球菌和变形杆菌都有不同程度的抑制作用， 对肺炎双球菌和金黄 色葡萄球菌有显著。

8、的抑制作用， 对二甲苯所致小鼠耳肿胀有明显的消炎作用， 对干酵母所 致大鼠的发热反应有明显的解热作用， 并能显著增强小鼠网状内皮系统的吞噬功能， 具有 免疫促进作用， 且毒性低， 使用安全， 因此， 其可用于制备具有抗菌、 消炎、 解热和免疫促进 功能的药物或保健品。 0006 进一步， 所述九香虫总生物碱采用以下方法制得 ： 将九香虫用水加热提取， 提取液 上弱极性大孔吸附树脂柱， 先用无机碱溶液洗至流出液无色， 再用水洗至流出液呈中性， 再 用体 积分数为30%70%的乙醇溶液洗脱， 收集洗脱液， 浓缩， 干燥， 即得九香虫总生物碱。 0007 优选的， 所述弱极性大孔吸附树脂为大孔吸附树。

9、脂 D101。 0008 优选的， 提取液上弱极性大孔吸附树脂柱， 先用质量分数为 0.2% 的氢氧化钠溶液 洗至流出液无色， 再用水洗至流出液呈中性， 再用体积分数为 50% 的乙醇溶液洗脱。 0009 优选的， 将九香虫加水煎煮 2 次， 每次加入 10 倍重量的水煎煮 1 小时， 合并煎煮 液， 离心， 取上清液作为提取液。 说 明 书 CN 103301160 A 3 2/6 页 4 0010 本发明的有益效果在于 ： 本发明公开了九香虫总生物碱在制备具有抗菌、 消炎、 解 热和免疫促进功能的药物或保健品中的应用， 不仅拓宽了九香虫总生物碱的应用范围， 提 高了其市场价值， 而且进一步。

10、明确了中药九香虫的药效物质基础， 利于控制中药九香虫及 其制剂的质量。 0011 具体的实施方式 0012 为了使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚， 下面对九香虫总生物碱的药理 作用及其效果进行详细的阐述。 0013 一、 九香虫总生物碱的制备 0014 称取九香虫药材2kg， 加入10倍量水煎煮2次， 每次煎煮1小时， 煎煮液滤过， 合并 滤液， 离心， 取上清液上大孔吸附树脂 D101 柱 （弱极性， 天津市海光化工有限公司） ， 先用质 量分数为 0.2% 的氢氧化钠溶液洗至流出液无色， 再用蒸馏水洗至流出液呈中性， 再用体积 分数为 50% 的乙醇溶液洗脱， 收集乙醇洗脱液， 减。

11、压浓缩， 干燥， 得九香虫总生物碱 40g。 0015 含量测定方法 ： 取九香虫总生物碱细粉约 0.5g， 精密称定， 置索氏提取器中， 加浓 氨试液 3ml、 乙醚 20ml， 放置 24 小时， 置水浴上加热回流提取 4 小时至生物碱提尽， 将提取 液移至分液漏斗中， 容器用少量乙醚洗涤， 洗液并入分液漏斗中， 加盐酸滴定液 （0.5mol/ L） 振摇提取 5 次 （20、 10、 10、 10、 10ml） ， 合并酸液， 滤过， 滤液加氢氧化钠试液使呈碱性， 加 氯化钠饱和， 用乙醚振摇提取 5 次 （20、 10、 10、 10、 10ml） ， 合并乙醚液， 用氯化钠饱和溶液 。

12、洗涤 3 次， 每次 5ml， 合并洗液， 再用乙醚 10ml 振摇提取， 合并乙醚液， 精密加入硫酸滴定 液 （0.01mol/L） 30ml， 振摇提取， 静置使分层， 分取酸液， 剩余乙醚液再用水提取 3 次， 每次 5ml， 合并酸液与水液， 置水浴上加热， 除去微量乙醚， 放冷， 加甲基红指示液 2 滴， 用氢氧化 钠滴定液 （0.02mol/L） 滴定， 即得。每 1ml 的硫酸滴定液 （0.01mol/L） 相当于 3.143mg 的九 香虫素 （aspongopusin， C10H9NO3） 。 0016 含量测定结果显示， 所得九香虫总生物碱以九香虫素计纯度为 75.84%。。

13、 0017 二、 九香虫总生物碱的药理作用 0018 1. 体外抗菌作用 0019 以肺炎双球菌、 金黄色葡萄球菌、 甲型溶血型链球菌、 乙型溶血型链球菌、 变形杆 菌为试验菌种。取各试验菌种， 分别接种于 2mL 牛肉膏汤液体培养基中， 37培养 16 小时， 所得菌悬液用无菌生理盐水稀释至浓度分别为 10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、 10-6、 10-7/mL， 再取 各稀释菌液 0.1mL， 加至牛肉膏汤固体培养基中， 37培养 18 小时， 以刚形成融合生长菌落 者作为平皿法试验用菌液， 最终确定金黄色葡萄球菌的平皿法试验用菌液采用 10-3/mL 浓 度， 。

14、其余各菌采用 10-2/mL 浓度。 0020 称取九香虫总生物碱， 用生理盐水溶解并稀释制成浓度为 10mg/mL 的溶液 ； 另 取阳性对照盐酸环丙沙星标准品， 用生理盐水溶解并稀释， 分别制成浓度为 10g/mL 和 20g/mL 的溶液。取 6 个三角烧瓶， 顺序编号， 2 6 号烧瓶中各加入无菌生理盐水 40mL， 先取九香虫总生物碱溶液 80mL 至 1 号烧瓶中， 再从 1 号烧瓶中吸取溶液 40mL 至 2 号烧瓶 中， 混匀， 再从 2 号烧瓶中吸取溶液 40mL 至 3 号烧瓶中， 依次操作至 6 号烧瓶， 则 1 6 号 烧瓶中九香虫总生物碱的浓度分别为 10、 5、 2。

15、.5、 1.25、 0.63 和 0.32mg/mL。取 9 个无菌平 皿， 顺序编号， 1 6 号平皿中分别对应加入上述 1 6 号烧瓶中的溶液 1mL， 7 8 号平皿 中分别加入浓度为 10g/mL 和 20g/mL 的盐酸环丙沙星溶液， 9 号平皿中不加药液作为 说 明 书 CN 103301160 A 4 3/6 页 5 空白对照， 然后在各平皿中加入已融化并冷却至 40的牛肉膏汤琼脂培养基 9mL， 立即摇 动充分混匀， 则 1 6 号平皿中九香虫总生物碱的浓度依次为 1、 0.5、 0.25、 0.125、 0.063 和 0.032mg/mL， 7-8 号平皿中盐酸环丙沙星的浓。

16、度依次为 1 和 2g/mL。在 1 9 号平皿上按 前述平皿法试验用菌液浓度接种试验菌株， 37培养 18 小时， 记录各药物浓度平皿上的细 菌生长情况， 测定药物的最低抗菌浓度 （MIC） 。 0021 结果显示， 九香虫总生物碱对肺炎双球菌、 金黄色葡萄球菌、 甲型溶血型链球菌、 乙型溶血型链球菌、 变形杆菌的 MIC 分别为 0.25、 0.5、 0.5、 1、 1mg/mL， 说明九香虫总生物碱 对以上各菌均有不同程度的抗菌作用。 0022 2. 体内抗菌作用 0023 以肺炎双球菌、 金黄色葡萄球菌为试验菌种。 将浓度为6108/mL的肺炎双球菌菌 液用无菌生理盐水稀释至浓度分别为。

17、6107、 6106、 6105、 6104/mL。 取小鼠20只， 随机 分为5组， 每组4只， 15组分别腹腔注射浓度为6108、 6107、 6106、 6105、 6104/mL 的肺炎双球菌菌液， 0.5mL/ 只， 观察 4 天内各组动物死亡情况， 最终确定引起小鼠 90% 致死 率的肺炎双球菌菌液浓度为 3.16108/mL。将浓度为 1.2109/mL 的金黄色葡萄球菌菌液 用无菌生理盐水稀释至浓度分别为 1.2108、 1.2107、 1.2106、 1.2105/mL。取小鼠 20 只， 随机分为 5 组， 每组 4 只， 1 5 组分别腹腔注射浓度为 1.2109、 1.。

18、2108、 1.2107、 1.2106、 1.2105/mL 的金黄色葡萄球菌菌液， 0.5mL/ 只， 观察 4 天内各组动物死亡情况， 最终确定引起小鼠 90% 致死率的金黄色葡萄球菌菌液浓度为 6.4108/mL。 0024 取体重 202g 的雄性昆明小鼠 60 只， 随机分为 4 组 ： 空白对照组， 九香虫总生 物碱低、 高剂量组和盐酸环丙沙星片组， 每组 15 只。各组小鼠每天经口灌胃 1 次， 空白对 照组按照 0.01mL/g( 体重 ) 的剂量给予小鼠生理盐水， 九香虫总生物碱低、 高剂量组分别 按照 10mg/kg、 20mg/kg( 体重 ) 的剂量给予小鼠九香虫总生。

19、物碱， 盐酸环丙沙星片组按照 24mg( 主药 )/kg( 体重 ) 的剂量给予盐酸环丙沙星片。连续给药 4 天后， 各组小鼠腹腔注 射浓度为 3.16108/mL 的肺炎双球菌菌液或浓度为 6.4108/mL 的金黄色葡萄球菌菌液， 0.5mL/ 只， 之后按前述方法继续给药一周， 记录一周内各组小鼠死亡数。 0025 结果显示， 空白对照组、 九香虫总生物碱高剂量组 （20mg/kg） 、 九香虫总生物碱 低剂量组 （10mg/kg） 、 盐酸环丙沙星片组 （24mg/kg） 小鼠在腹腔感染肺炎双球菌后， 一周 内死亡数分别为 14、 6、 8、 4 只， 九香虫总生物碱高剂量组与空白对照。

20、组比较有显著性差异 （P0.05） ； 同样， 空白对照组、 九香虫总生物碱高剂量组 （20mg/kg） 、 九香虫总生物碱低剂 量组 （10mg/kg） 、 盐酸环丙沙星片组 （24mg/kg） 小鼠在腹腔感染金黄色葡萄球菌后， 一周 内死亡数分别为 13、 4、 7、 1 只， 九香虫总生物碱高剂量组与空白对照组比较有极显著差异 （P0.01） ， 说明九香虫总生物碱对肺炎双球菌和金黄色葡萄球菌有显著的抑制作用。 0026 3. 体内抗炎作用 0027 取体重 202g 的雄性昆明小鼠 40 只， 随机分为 4 组 ： 空白对照组， 九香虫总生物 碱低、 高剂量组和强力银翘片组， 每组 1。

21、0 只。各组小鼠每天经口灌胃 1 次， 空白对照组按照 0.01ml/g( 体重 ) 的剂量给予小鼠生理盐水， 九香虫总生物碱低、 高剂量组分别按照 10mg/ kg、 20mg/kg( 体重 ) 的剂量给予小鼠九香虫总生物碱， 强力银翘片组按照 900mg( 主药 )/ kg( 体重 ) 的剂量给予强力银翘片， 连续给药 4 天。末次给药后 1 小时， 在乙醚麻醉下， 将二 甲苯 0.02mL 涂在小鼠左耳前后两面致炎， 致炎后 30 分钟处死小鼠， 用 7mm 直径打孔器在小 说 明 书 CN 103301160 A 5 4/6 页 6 鼠左右耳相同部位打下耳片， 称重并记录左右耳片重量，。

22、 计算肿胀率， 按 t 检验法进行统计 学处理。 0028 结果见表 1， 二甲苯所致小鼠耳肿胀是经典的急性炎症模型， 九香虫总生物碱可以 降低二甲苯所致小鼠耳肿胀的肿胀率， 其中九香虫总生物碱高剂量组 （20mg/kg） 与空白对 照组比较有显著性差异 （P0.05） ， 说明九香虫总生物碱具有抗炎作用。 0029 表 1 九香虫总生物碱对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响 0030 0031 0032 与空白对照组比较 ： ap0.05,bp0.01. 0033 4. 体内解热作用 0034 称取干酵母 10g， 于研钵中逐渐加水研磨成均匀的悬浆， 再加水定容至 50mL， 制成 20% 干酵母悬。

23、液， 备用。取体重 20020g 的雄性 SD 大鼠 60 只， 随机分为 4 组 ： 空白对照组， 九香虫总生物碱低、 高剂量组和强力银翘片组， 每组 15 只。各组大鼠每天经口灌胃 1 次， 空白对照组按照 1mL/100g( 体重 ) 的剂量给予大鼠生理盐水， 九香虫总生物碱低、 高剂量 组分别按照 5mg/kg、 10mg/kg( 体重 ) 的剂量给予大鼠九香虫总生物碱， 强力银翘片组按照 450mg( 主药 )/kg( 体重 ) 的剂量给予强力银翘片， 连续给药 4 天， 给药期间， 每天将体温计 插入大鼠肛门1次， 使动物适应。 末次给药前， 各组大鼠禁食不禁水8小时， 并于给药前。

24、测量 肛温 2 次 （间隔 1 小时） ， 取平均值作为正常体温， 选取 2 次温差不超过 0.3的大鼠进行末 次给药， 之后按照 10mL/kg( 体重 ) 的剂量立即于大鼠背部皮下注射 20% 干酵母悬液致热， 分别于致热后0.5、 1、 2、 4、 6、 8、 10、 12小时测肛温1次， 以正常体温为基数， 计算各时间点体 温变化值， 按 t 检验法进行统计学处理。 0035 结果见表 2， 干酵母致大鼠发热模型是一种常用的研究解热药物的药理实验模型， 致热后 4、 6、 8、 10 小时， 九香虫总生物碱高剂量组 （10mg/kg） 的大鼠体温升高值与空白对照 组比较有显著性差异 （。

25、P0.05） ， 而致热后 4、 6 小时， 九香虫总生物碱低剂量组 （5mg/kg） 的 大鼠体温升高值与空白对照组比较有显著性差异 （P0.05） ， 说明九香虫总生物碱能够明显 抑制干酵母所致的大鼠发热反应， 具有较强的解热作用。 0036 表 2 九香虫总生物碱对干酵母所致大鼠发热的影响 0037 说 明 书 CN 103301160 A 6 5/6 页 7 0038 0039 与空白对照组比较 ： ap0.05,bp0.01. 0040 5. 体内免疫促进作用 0041 取体重 202g 的雄性昆明小鼠 40 只， 随机分为 4 组 ： 空白对照组， 九香虫总生物 碱低、 高剂量组和。

26、强力银翘片组， 每组 10 只。各组小鼠每天经口灌胃 1 次， 空白对照组按照 0.01ml/g( 体重 ) 的剂量给予小鼠生理盐水， 九香虫总生物碱低、 高剂量组分别按照 10mg/ kg、 20mg/kg( 体重 ) 的剂量给予小鼠九香虫总生物碱， 强力银翘片组按照 900mg( 主药 )/ kg(体重)的剂量给予强力银翘片， 连续给药4天。 末次给药后30分钟， 按照0.1mL/10g(体 重)的剂量于小鼠尾静脉注射用1%(w/w)明胶溶液稀释4倍的印度墨汁， 分别于注射后1、 5 分钟小鼠眼眶取血 20L， 立即吹入 0.1%(w/w)Na2CO3溶液 2mL 中， 充分洗出采血管壁血。

27、液， 摇匀， 用分光光度计在波长 675nm 处测定吸光度 （OD） 值， 并于第二次采血后， 用脱颈椎方法 处死小鼠， 称量体重， 解剖取肝、 脾称重， 计算单位时间内炭粒廓清率即吞噬指数 K 及校正 吞噬指数 A， 按 t 检验法进行统计学处理。 0042 结果见表 3， 九香虫总生物碱高、 低两个剂量组的吞噬指数和校正吞噬指数与空白 对照组比较均有显著性差异 （P0.05） ， 说明九香虫总生物碱能够促进小鼠网状内皮系统中 单核巨噬细胞的吞噬功能， 具有免疫促进作用。 0043 表 3 九香虫总生物碱对小鼠碳粒廓清功能的影响 （n=10） 0044 0045 与空白对照组比较 ： ap0。

28、.05,bp0.01. 0046 三、 九香虫总生物碱的急性毒性 0047 取体重 202g 的小鼠 40 只， 雌雄各半， 每只小鼠按照 1.2g/kg( 体重 ) 的剂量给 说 明 书 CN 103301160 A 7 6/6 页 8 予九香虫总生物碱 （相当于生药 60g/kg） ， 每天经口灌胃给药 3 次， 连续给药 7 天， 观察小鼠 有无急性毒性反应。 0048 结果显示， 在口服给予小鼠相当于人体用药剂量 （九香虫生药日用量 3g） 130 倍的 九香虫总生物碱时， 未见小鼠死亡， 未测得 LD50。 0049 最后说明的是， 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制， 尽管通过参 照上述实施例已经对本发明进行了描述， 但本领域的普通技术人员应当理解， 可以在形式 上和细节上对其作出各种各样的改变， 而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和 范围。 说 明 书 CN 103301160 A 8 。