来曲唑在用于制备成年牛超数排卵药物中的应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 103169699 B (45)授权公告日 2014.11.12 CN 103169699 B (21)申请号 201110436200.8 (22)申请日 2011.12.22 A61K 31/4196(2006.01) A61P 15/08(2006.01) A61K 38/24(2006.01) (73)专利权人 中国农业大学 地址 100193 北京市海淀区圆明园西路 2 号 (72)发明人 田见晖 贾振伟 吴中红 张家新 安磊 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王朋飞 张庆敏 EP 1463493 B1,2007.10。

2、.03, 杨锦修等 . 来曲唑促排卵研究进展 .动物 医学进展 .2008, 第 29 卷 ( 第 8 期 ),97-101. 徐明彩等 . 来曲唑促排卵治疗的临床观 察 .中国生育健康杂志 .2008, 第 19 卷 ( 第 6 期 ),354-357. (54) 发明名称 来曲唑在用于制备成年牛超数排卵药物中的 应用 (57) 摘要 本发明提供了一种来曲唑在用于制备成年牛 超数排卵药物中的应用。本发明在传统成年母牛 超排方案中增加使用 LE， 利用来曲唑对内分泌及 旁分泌的影响及卵巢卵泡募集的作用， 促进卵泡 的发育， 增加可利用的卵母细胞数量 ； 另外其半 衰期较短， 代谢速度快， 无副。

3、作用， 能够成为家畜 超排辅助药物在畜牧业生产上推广应用。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 高超 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 (10)授权公告号 CN 103169699 B CN 103169699 B 1/1 页 2 1. 一种诱导成年牛超数排卵的非治疗目的的方法， 其特征在于， 包括如下步骤 ： 1) 卵泡同期化发育处理 ： 将成年母牛经孕酮持续处理 6 天， 在第 0 天同时使用苯甲酸 雌激素， 在第 6 天使用前列腺素 ； 2) 卵泡刺激素、 来曲唑联合处理 ： 第 4 天开。

4、始每间隔 12 小时使用一次卵泡刺激素， 所 述卵泡刺激素使用8次， 用量为0.06-0.02mg/kg体重/次 ； 在第5天联合使用来曲唑 ； 所述 来曲唑的用量为 0.1-0.8mg/kg 体重。 2. 根据权利要求 1 所述的诱导成年牛超数排卵的非治疗目的的方法， 其特征在于， 所 述来曲唑的用量为 0.2mg/kg 体重。 3.根据权利要求1或2所述的诱导成年牛超数排卵的非治疗目的的方法， 其特征在于， 步骤1)中， 所述孕酮的用量2.5-3.0mg/kg体重， 所述苯甲酸雌激素的用量0.003-0.006mg/ kg 体重， 所述前列腺素的用量 0.04-0.1mg/kg 体重。 4。

5、. 根据权利要求 3 所述的诱导成年牛超数排卵的非治疗目的的方法， 其特征在于， 步 骤 1) 中在使用苯甲酸雌激素的同时， 还再使用 0.15-0.2mg/kg 体重量的孕酮。 权 利 要 求 书 CN 103169699 B 2 1/4 页 3 来曲唑在用于制备成年牛超数排卵药物中的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种新型的超数排卵方法， 具体地说， 涉及来曲唑在用于制备成年牛 超数排卵药物中的应用， 可用于利用超排的卵母细胞生产转基因克隆家畜、 家畜育种及濒 危物种的保护。属于应用型胚胎生物技术领域。 背景技术 0002 超数排卵技术最初是以啮齿类实验动物为研究对象发现的， 通过埋植。

6、垂体前叶物 质或注射孕马血清技术获取了大量的卵母细胞， 以此奠定了超排技术基础， 是胚胎移植技 术中最重要的环节。 采用超数排卵技术可以最大限度利用卵巢资源， 获得大量整齐、 优质的 卵子， 充分发挥优良母畜的繁殖潜力， 为胚胎移植提供充足的胚源。 该项技术的应用使得优 良后代数量成倍增长， 加快了优良品种扩繁和动物育种的步伐。 基于该项技术的优势， 目前 已广泛应用于畜牧业生产， 其中在牛单胎动物生产方面尤为突出。牛超数排卵同时结合胚 胎移植集成的 MOET 技术， 加速了优良牛品种扩繁， 缩短了世代间隔， 提高了畜牧业生产效 率， 获得了巨大的经济及社会效益。 0003 目前畜牧业生产中广。

7、泛使用的超排方案形成于 20 世纪 80 年代初， 常用的激素主 要有孕马血清促性腺激素(PMSG)和卵泡刺激素(FSH)。 由于PMSG对卵巢影响较大， 逐渐被 FSH 替代或与 FSH 结合使用， 超排方法主要有 FSH 递减法、 FSH 恒量法、 PMSG 与 FSH 组合方 法。另外由于 FSH 半衰期较短， 连续注射增加了劳动强度， 而且会对家畜产生应激， 成本也 较高， 也有研究将FSH溶解在PVP等高分子聚合物中缓释的超排方法， 同样获得了较好的超 排效果。 尽管超数排卵技术已广泛应用于生产， 但是由于超排选用的激素种类、 供体牛的生 理状态、 环境及营养等因素的影响， 现有的超。

8、排方案在获卵率和可用胚数方面不稳定， 严重 地影响了胚胎移植技术的推广。 0004 同时， 为提高超排效率， 一些科研工作者将生长激素 (GH)、 胰岛素样生长因子 I(IGF-I)、 血管表皮生长因子 (VEGF) 等激素或因子也纳入家畜超排方案。虽有研究表明， 添加一些生长相关的因子可以有效提高家畜的胚胎质量及增加可用囊胚的比例， 但目前尚 无有效提高家畜超排效果， 明显提高单次排卵数的超排方案的报道。另据国际胚胎移植协 会 (IETS) 的数据表明， 近 10 年来， 供体母牛单次超排获得的可用胚胎数平均保持在 6 枚左 右， 由此可见， 目前现有的超排方法在获取的卵母细胞数量上没有获得。

9、较大的突破。 0005 哺乳动物出生后卵巢存在大量的卵母细胞， 随着年龄的增长， 这些卵细胞不断退 化， 到性成熟时大部分已消失， 但卵巢上仍有相当数量的卵原细胞和初级卵母细胞存在。 例 如 ： 青年母牛有5-7.5万个。 但是家畜在一个性周期同时有一组卵泡启动发育， 但最后只有 一部分卵泡发育成熟。牛一般只有 1 个卵泡成熟排卵， 而当前在生产中应用的超排方案结 合人工受精平均仅能获取 6 枚胚胎， 其它卵泡则闭锁， 因此， 卵巢中有大量的卵细胞并末得 到利用， 导致卵巢卵泡资源的巨大浪费。鉴于上述原因， 畜牧业生产亟需新型的高效、 稳定 的超排技术来替代传统的超排方案。 0006 来曲唑 。

10、(LE) 为非甾体类第三代芳香化酶抑制剂， 最早应用于人绝经期乳腺癌的 说 明 书 CN 103169699 B 3 2/4 页 4 临床治疗。 近年来动物实验和临床研究表明， 来曲唑具有促排卵作用。 促排机理可能通过抑 制芳香酶的活性， 阻碍雄激素和雌二醇的转化， 降低机体内雌激素水平， 从而解除雌激素对 下丘脑和 ( 或 ) 垂体的负反馈作用， 使垂体促性腺激素分泌增加， 促进卵泡的发育和排卵 ； 另外卵巢内雄激素暂时性的增多， 从而增加卵巢内卵泡对 FSH 的敏感性， 同时卵巢内雄激 素的增加能够刺激胰岛素样生长因子 1(IGF1) 以及内分泌、 旁分泌因子与 FSH 协同作用促 进卵泡。

11、发育和排卵。来曲唑为口服剂型， 生物利用度高达 99.9， 具有高度选择性， 可阻断 98以上的芳香化酶活性， 且半衰期较短， 代谢速度快， 无副作用。大量的研究表明， LE 与 FSH 联合使用提高了超排效率， 是一种新型的促排卵药物， 目前已广泛应用于人的促排卵治 疗及实验动物研究。 牛是单排卵动物， 在卵巢生理、 胚胎发育特点及辅助生殖技术方面与人 具有相似的特点， 而且在研究人卵母细胞发育领域是一个重要的模型动物。 因此， 鉴于牛与 人繁殖生理特点的相似性， 推测 LE 与 FSH 联合应用于超数排卵将有一定作用效果， 但是在 牛超排方案的改进方面尚无研究报道。 发明内容 0007 本。

12、发明的目的是提供一种来曲唑在用于制备成年牛超数排卵药物及辅助药物中 的应用。 0008 本发明的另一目的是提供一种诱导牛超数排卵的方法。 0009 为了实现本发明目的， 本发明提供来曲唑 (LE) 在用于制备成年牛超数排卵药物 及辅助药物中的应用。 0010 本发明来曲唑与卵泡刺激素 (FSH) 联合用于制备成年牛超数排卵药物。 0011 本发明提供一种诱导成年牛超数排卵的方法， 包括如下步骤 ： 0012 1) 卵泡同期化发育处理 ： 将成年母牛经孕酮持续处理 6 天， 在第 0 天同时使用苯 甲酸雌激素， 在第 6 天使用前列腺素 ； 0013 2) 卵泡刺激素、 来曲唑联合处理 ： 第 。

13、4 天开始每间隔 12 小时使用一次卵泡刺激 素， 在第 5 天联合使用来曲唑。 0014 其中， 所述来曲唑的用量为 0.1-0.8mg/kg 体重， 优选为 0.2mg/kg 体重。 0015 所述卵泡刺激素使用 8 次， 用量为 0.06-0.02mg/kg 体重。 0016 步骤 1) 中所述孕酮的用量 2.5-3.0mg/kg 体重， 所述苯甲酸雌激素的用量 0.003-0.006mg/kg 体重， 所述前列腺素的用量 0.04-0.1mg/kg 体重。 0017 步骤 1) 中在使用苯甲酸雌激素的同时， 还再使用 0.15-0.2mg/kg 体重量的孕酮。 0018 本发明研究人员。

14、经过研究发现， 在传统成年母牛超排方案中增加使用 LE， 利用来 曲唑对内分泌及旁分泌的影响及卵巢卵泡募集的作用， 促进卵泡的发育， 增加可利用的卵 母细胞数量 ； 另外其半衰期较短， 代谢速度快， 无副作用， 能够成为家畜超排辅助药物在畜 牧业生产上推广应用。 0019 而且利用来曲唑对内分泌及旁分泌的影响及卵巢卵泡募集的作用， 在利用常规超 排方法使用卵泡刺激素 (FSH) 的同时结合来曲唑， 促进牛卵泡发育， 提高超排效率， 充分挖 掘良种牛在卵泡闭锁前丰富的种质资源， 加速良种选育及扩繁技术体系， 大幅度提高育种 效率和技术水平。 0020 本发明通过针对外源 FSH 注射牛后活化芳香。

15、化酶活性， 增加雌激素的产量， 导致 说 明 书 CN 103169699 B 4 3/4 页 5 负反馈作用于下丘脑和 ( 或 ) 垂体， 使内源 FSH 分泌下降， 影响了超排效果的问题， 在注射 后 FSH 使用来曲唑抑制芳香化酶活性。LE 是一种强效的芳香化酶抑制剂， 其选择性抑制雌 激素的合成， 显著降低血清中雌激素水平， 解除雌激素对下丘脑和 ( 或 ) 垂体的负反馈作 用， 使内源垂体促性腺激素分泌增加， 促进卵泡的发育， 增加可利用的卵母细胞数量 ； 另外 其半衰期较短， 代谢速度快， 无副作用， 能够成为家畜超排辅助药物在畜牧业生产上推广应 用。 具体实施方式 0021 以下。

16、实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 0022 实施例 1 0023 本发明通过传统成年母牛超排方案使用FSH同时口服LE， 通过口服不同剂量的LE 确定牛最佳的 LE 使用剂量。FSH 每天 2 次注射 4 天， 时间为早晨 8:00， 晚上 8:00， 在第 1 次 FSH 注射 24h 后， 即第 3 针 FSH 注射时使用不同剂量的 LE 处理 (0.1mg、 0.2mg、 0.4mg 及 0.8mg/kg体重)， 同时以未LE处理为对照 ； 超排、 人工授精后采集的胚胎通过胚胎移植技术 植入经过同期发情处理后具有明显发情表现的受体牛， 胚胎附植后经过全期发育产犊。 00。

17、24 具体地说， 使用本发明来曲唑的牛超数排卵方案 ： 0025 (1) 卵泡同期化发育处理 ： 选择体况良好、 体重均一的成年荷斯坦母牛 (10 头， 体 重约为 650kg)， 在第 0 天早晨 8:00 插入 1.9g 阴道孕酮栓制剂 (CIDR， 新西兰 )， CIDR 处理 6.5d， 第 6 天取出。在第 0 天插入 CIDR 同时注射苯甲酸雌激素 (EV)2mg 和孕酮 100mg， 在第 6d 早上 8:00 注射 25mg 前列腺素 (PGF2)。 0026 (2)FSH、 LE 处理 ： 第 4d 开始间隔 12h 连续注射 FSH( 加拿大， Folltropin)4d，。

18、 早 8:00， 晚 8:00， 剂量为 40， 40， 30， 30， 20， 20， 10， 10mg。在第 5d 早 8:00 第 3 次注射 FSH 后口 服 LE， 采用 4 个 LE 处理分别为 0.1mg、 0.2mg、 0.4mg 及 0.8mg/Kg 体重， 同时以未 LE 处理为 对照。 0027 (3) 人工授精及胚胎移植 0028 供体牛 CIDR 处理后第 8d 下午和第 9d 上午进行两次人工授精， 第 15d 采集胚胎分 级计数后， 按照牛胚胎移植操作规程进行胚胎移植。 超排、 人工授精后采集的胚胎通过胚胎 移植技术植入经过同期发情处理后具有明显发情表现的受体牛，。

19、 胚胎附植后经过全期发育 产犊。 0029 (4) 获取卵母细胞及胚胎数量 0030 实验结果表明 LE 联合 FSH 处理成年母牛提高了超排效果。其中 LE0.2mg/kg 处理 效果最好， 卵母细胞总数(11.4vs 8.0)和可移植胚胎数量(8.1vs 6.1)均显著(P0.05) 高于未经 LE 处理的对照。 0031 表 1LE 联合 FSH 处理对牛超排的影响 ( 平均数 标准误， n 10) 0032 说 明 书 CN 103169699 B 5 4/4 页 6 0033 注 ： LE 使用剂量为牛每公斤体重， 同列不同字母表示差异显著 (P 0.05) 0034 本发明通过针对。

20、外源 FSH 注射牛后活化芳香化酶活性， 增加雌激素的产量， 导致 负反馈作用于下丘脑和 ( 或 ) 垂体， 使内源 FSH 分泌下降， 影响了超排效果的问题， 在注射 FSH 后使用来曲唑抑制芳香化酶活性。LE 是一种强效的芳香化酶抑制剂， 其选择性抑制雌 激素的合成， 显著降低血清中雌激素水平， 解除雌激素对下丘脑和 ( 或 ) 垂体的负反馈作 用， 使内源垂体促性腺激素分泌增加， 促进卵泡的发育， 增加可利用的卵母细胞数量 ； 另外 其半衰期较短， 代谢速度快， 无副作用， 能够成为家畜超排辅助药物在畜牧业生产上推广应 用。 0035 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说 明 书 CN 103169699 B 6 。