大白栓菌或其提取物、3氢化松苓酸B的制药用途.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102028716 B (45)授权公告日 2012.05.23 CN 102028716 B *CN102028716B* (21)申请号 201010297195.2 (22)申请日 2010.09.20 200910167795.4 2009.09.28 CN A61K 31/575(2006.01) A61K 36/06(2006.01) A61P 3/10(2006.01) (73)专利权人 郭志勇 地址 443002 湖北省宜昌市大学路 8 号 (72)发明人 郭志勇 邓改改 汪鋆植 邹坤 王星琴 程凡 陈剑峰 (54) 发明名称 大白栓菌或其提取物、 3。

2、- 氢化松苓酸 B 的制 药用途 (57) 摘要 本发明提供了大白栓菌及其提取物、 3- 氢化 松苓酸 B 的新用途， 具体地， 是在用于治疗或 / 和 预防糖尿病中的用途。 本发明药物的药效明确， 安 全， 为临床提供了一种新的用药选择。 (66)本国优先权数据 (51)Int.Cl. 审查员 马旭 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 大白栓菌 95乙醇提取物在制备 - 葡萄糖苷酶抑制剂类药物中的用途。 2. 根据权利要求 1 所述的用途， 其特征在于。

3、 ： 所述的药物是治疗 II 型糖尿病的药物。 3.3- 氢化松苓酸 B 在制备 - 葡萄糖苷酶抑制剂类药物中的用途。 4. 根据权利要求 3 所述的用途， 其特征在于 ： 所述的药物是治疗 II 型糖尿病的药物。 5. 一种 - 葡萄糖苷酶抑制剂， 其特征在于 ： 它是由有效量的大白栓菌 95乙醇提取 物或 3- 氢化松苓酸 B 为活性成分， 加入药学上可接受的辅料制备而成的药剂。 6. 根据权利要求 5 所述的 - 葡萄糖苷酶抑制剂， 其特征在于 ： 所述的药剂是口服制 剂。 权 利 要 求 书 CN 102028716 B 2 1/6 页 3 大白栓菌或其提取物、 3- 氢化松苓酸 B 。

4、的制药用途 技术领域 0001 本发明涉及大白栓菌或其提取物、 3- 氢化松苓酸 B 的新用途。属药物领域。 背景技术 0002 大白栓菌Trametes lactinea(Berk.)Pat.为多孔菌科真菌， 担子果一年生， 无柄， 木栓质。它生于活叶树木材上， 分布于中国、 马来西亚、 印度尼西亚、 菲律宾、 巴基斯坦、 印 度、 斯里兰卡、 澳大利亚等国家。大白栓菌作为天麻等兰科植物种子萌发菌， 具有一定的经 济价值， 但大白栓菌野生资源较少， 不能满足其开发利用的需要。 目前已有文献报道大白栓 菌的人工培养方法， 如 ： 谭梦华， 等， 大白栓菌的人工培养条件优化， 时珍国医国药 20。

5、08 年 第 19 卷第 2 期 ； 专利申请号 ： 200810046969.7， 发明名称 ： 大白栓菌的人工培养方法及用 途， 公开了一种大白栓菌的人工培养方法及用途， 该发明通过菌种的纯化， 分别以固体培养 基和液体培养基对大白栓菌进行培养， 得到人工培养大白栓菌， 可实现大白栓菌大规模人 工培养 ； 以大白栓菌或其提取物为主的药物具有较好的提高免疫力、 并具有抗肿瘤的作用， 通过本发明得到的大白栓菌也可作为一种添加剂加入饲料中畜禽生长， 增强其免疫力， 减 少疾病。该专利还报道了大白栓菌主要含有糖类和三萜类化合物， 3- 氢化松苓酸 B 是大白 栓菌的主要成分， 其结构式如下 ： 0。

6、003 0004 目前尚无大白栓菌及其提取物、 3- 氢化松苓酸 B 用于治疗糖尿病的相关文献报 道。 发明内容 0005 本发明的技术方案是提供了大白栓菌及其提取物、 3- 氢化松苓酸 B 的新用途。 0006 本发明提供了大白栓菌或其提取物在制备 - 葡萄糖苷酶抑制剂类药物中的用 途。 0007 其中， 所述的药物是治疗 II 型糖尿病的药物。 0008 其中， 所述的大白栓菌提取物是大白栓菌的水或有机溶剂提取物。 0009 其中， 所述的有机溶剂提取物是 60 -95乙醇提取物。 说 明 书 CN 102028716 B 3 2/6 页 4 0010 进一步优选地， 所述的有机溶剂提取物。

7、是 95乙醇提取物。 0011 其 中， 所 述 的 大 白 栓 菌 中 含 有 3- 氢 化 松 苓 酸 B 的 重 量 百 分 含 量 为 ： 5.17 -6.12。 0012 本发明还提供了3-氢化松苓酸B在制备-葡萄糖苷酶抑制剂类药物中的用途。 0013 其中， 所述的药物是治疗 II 型糖尿病的药物。 0014 本发明还提供了一种 - 葡萄糖苷酶抑制剂， 它是由有效量的大白栓菌或其提取 物或 3- 氢化松苓酸 B 为活性成分， 加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药 剂。 0015 其中， 所述的药剂是口服制剂。 0016 本发明药物大白栓菌及其提取物、 3-氢化松苓酸B用于。

8、治疗或/和预防糖尿病， 药 效明确， 安全， 为临床提供了一种新的用药选择。 附图说明 0017 图 1 对照品 HPLC 图谱 0018 图 2 样品 HPLC 图谱 具体实施方式 0019 实施例 1 本发明保健食品制备 0020 固体培养 0021 用玉米粉或大米粉或黄豆粉或小麦粉， 粒度 ： 过 10-100 目筛， 加水 20 -70， 高 压灭菌后接种野生大白栓菌菌丝， 20-32培养 10-20 天。干燥供食用或粉碎， 装胶囊。 0022 质量控制方法 ： 3- 氢化松苓酸 B 含量大于 0.05 0023 食用方法 ： 煮粥、 煮饭。 0024 用量 ： 每次用量 10-100。

9、g， 一日 2-3 次， 胶囊每次用量 2-10 粒， 一日 2-3 次。 0025 液体培养 0026 用下列培养基之一， 高压灭菌后接种， 摇床摇速30-250转/分。 20-32培养5-15 天， 培养结束后离心， 菌丝干燥称量， 粉碎， 装胶囊。 0027 配方 1 ： 葡萄糖 1-10， 蛋白胨 1-5 石膏 0.2g-1 0028 配方 2 ： 玉米浆 10-50， 石膏 0.2g-1 0029 配方 3 ： 豆浆 10-50， 石膏 0.2g-1 0030 质量控制 ： 3- 氢化松苓酸 B 含量大于 0.05 0031 食用方法 ： 煮粥、 煮饭。 0032 用量 ： 每次用量。

10、 10-100g， 一日 2-3 次， 胶囊每次用量 2-10 粒， 一日 2-3 次。 0033 本发明大白栓菌的制备方法可按专利申请号 ： 200810046969.7公开的方法制备。 0034 实施例 2 本发明大白栓菌质量控制方法 0035 取样品粉碎后过 80 目筛， 精密称取 0.1g 加 50ml 丙酮超声 30min。静置 1h 后继 续超声 30min。丙酮补齐损失重量。吸取样品溶液用 0.45m 膜过滤。乙腈 / 水 (95 5) 为流动相， 流速 1ml/min， 进样量 10l， 检测波长 214nm， 进行高效液相色谱分析。 0036 1、 色谱条件 说 明 书 CN。

11、 102028716 B 4 3/6 页 5 0037 色谱柱YMC-Pack AQ C18， 2504.6mm， 5m， 流动相为95的乙腈-水体系， 进样 量10l， 柱温25， 流速1.0ml/min， 检测波长214nm， 在该基础条件下， 待测组分可达基线 分离。( 色谱图见图 1、 图 2) 0038 2、 对照品溶液制备 0039 精密称取3-氢化松苓酸B 2.0mg， 置于10ml量瓶中， 加入丙酮溶解并稀释至刻度， 摇匀备用。 0040 3、 取大白栓菌培养物及大白栓菌粉碎， 过 60 目筛， 称取大白栓菌培养物粉末 1g， 大白栓菌粉末0.5g， 加甲醇10ml， 称重后浸。

12、泡4h， 40Hz， 40超声20min， 0.45m滤膜过滤， 供测定用。 0041 标准曲线及线性关系考察精密吸取对照品溶液 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10， 12， 14l 注入液相色谱仪， 按色谱条件测得峰面积， 以进样量 (g) 为横坐标， 峰面积为纵坐标， 绘 制标准曲线。 回归方程为 ： y1192330x-112754， R0.9999， 表明， 对照品在20-240mg L-1 浓度范围内呈良好的线性关系 0042 4、 稳定性试验 0043 取样品溶液， 间隔3h测1次， 共测24h。 结果3-氢化松苓酸B峰面积RSD为1.02 (n 8)， 表。

13、明供试品溶液室温下放置 24h 基本稳定。 0044 5、 精密度试验 0045 精密吸取 3- 氢化松苓酸 B 对照品溶液 10l 重复进样 5 次， 测定峰面积的 RSD 为 0.91。 0046 6、 重复性试验 0047 重复取同一样品 5 份， 照 “供试品溶液制备” 项操作， 测得 3- 氢化松苓酸 B 平均含 量为 5.63， RSD 为 1.3。 0048 7、 加样回收试验 0049 精密称取已知含量样品 5 份， 加入与样品含量相当的对照品， 测定 3- 氢化松苓酸 B 含量， 计算回收率， 结果见表 1。 0050 表 13- 氢化松苓酸 B 加样回收率 (n 5) 00。

14、51 0052 8、 样品含量测定 0053 收集培养的 3 批样品， 分别测定大白栓菌菌丝体， 大白栓菌培养物中 3- 氢化松苓 酸 B 含量。按供试样品溶液制备方法制备供试品溶液， 准确吸取供试品溶液各 10l， 按上 述色谱条件测定， 结果见表 2。 0054 表 23- 氢化松苓酸 B 含量 说 明 书 CN 102028716 B 5 4/6 页 6 0055 0056 大白栓菌中含有 3- 氢化松苓酸 B 的重量百分含量为 ： 5.17 -6.12。 0057 实施例 3 本发明不同乙醇浓度提取物大白栓菌中 3- 氢化松苓酸 B 的含量测定 0058 将制备的大白栓菌采用不同浓度的。

15、乙醇回流提取， 并测定其中3-氢化松苓酸B的 重量百分含量， 结果见表 3 ： 0059 表 3 0060 不同浓度乙醇 3- 氢化松苓酸 B 60 0.1 70 0.6 80 2 95 5.71 0061 上述试验证明， 采用 95的乙醇提取大白栓菌， 3- 氢化松苓酸 B 的含量最高。 0062 以下通过药效学试验证明本发明的有益效果。 0063 实验例 1 本发明药物降糖作用 0064 一、 - 葡萄糖苷酶抑制实验 0065 主要药品与试剂 0066 大白栓菌 95乙醇提取物 ( 大白栓菌醇提物 )( 按实施例 3 的方法提取 )， 3- 氢 化松苓酸 B(Trametenolic ac。

16、id B)， - 葡萄糖苷酶， 对硝基苯酚 -D 吡喃葡萄糖苷 (pNPG)， 阿卡波糖。 0067 主要仪器 0068 电子天平等 ； CO2培养箱 ； 酶标仪。 0069 方法与结果 0070 实验用溶液的配制 ： 0071 0.5mol/L磷酸盐缓冲液(PBS) ： KH2PO4 13.610g， KOH 3.210g， MgCl2 6H2O 0.650g， 用蒸馏水定容至 200ml， 调节 pH6.8， 使用时用蒸馏水稀释至 0.1mol/L ； 酶溶液 ： 以 0.1mol/ L PBS 配制 0.1U/ml -D 葡萄糖苷酶溶液 ； 底物溶液 ： 以 0.1mol/L PBS 配。

17、制 2mmol/L 对硝 基苯酚 -D 吡喃葡萄糖苷溶液。样品溶液 ： 取样品用 DMSO 溶解， 稀释至所需浓度。 0072 - 葡萄糖苷酶抑制活性测定 ： 0073 取 96 孔细胞培养板， 用微量移液器向每孔中准确加入底物溶液 40l， 样品溶液 5l， 对照孔中加等量 DMSO。于 405nm 测定吸光度 A1( 反应前溶液的背景吸收 )。于冰浴上 各加入酶溶液5l， 混匀后置37， 反应30min， 立即取出， 冰浴， 于405nm测定吸光度A2。 阿 卡波糖为阳性对照。 每一样品的吸光度AsampleA2-A1。 计算抑制率， 抑制率(ADMSO-Asample)/ ADMSO*1。

18、00。结果见表 4 ： 0074 表 4 大白栓菌提取物对 - 葡萄糖苷酶活性的影响 说 明 书 CN 102028716 B 6 5/6 页 7 0075 0076 与 DMSO 组相比， *P 0.05，*P 0.01 0077 结果显示大白栓菌醇提物及主要成分 3- 氢化松苓酸 B 对 - 葡萄糖苷酶活性有 抑制作用。 0078 二、 对小鼠血糖的影响 0079 主要药品与试剂 0080 大白栓菌 95乙醇提取物， 3- 氢化松苓酸 B(Trametenolic acid B)， 葡萄糖测定 试剂盒。 0081 实验动物 0082 昆明小鼠， 雌雄各半， 体重 18-22g， 由湖北省实。

19、验动物研究中心提供， 实验动物生 产许可证号 ： SCXK( 鄂 )2008-0005。 0083 主要仪器 0084 电子天平等 ； 酶标仪。 0085 方法与结果 0086 随机将小鼠分成 6 组， 分别为空白组， 模型组， 阳性对照组降糖片， 大白栓菌醇提 物组， 3- 氢化松苓酸 B 低剂量组， 3- 氢化松苓酸 B 高剂量组。灌胃给药 3d 后， 第三天给药 后禁食24h， 皮下注射肾上腺素0.2ml(0.02mg/ml)。 90min后取血， 3000转速离心10min， 取 上清液。采用葡萄糖测定试剂盒的测定方法进行测定。于 505nm 下测定吸光度值。结果见 表 5 ： 008。

20、7 表 5 大白栓菌提取物对小鼠血糖的影响 0088 0089 与模型组相比， *P 0.05，*P 0.01 0090 结果显示大白栓菌醇提物及主要成分 3- 氢化松苓酸 B 对注射肾上腺素所引起的 血糖升高有抑制作用。 说 明 书 CN 102028716 B 7 6/6 页 8 0091 三、 对小鼠血糖的影响 0092 主要药品与试剂 0093 大白栓菌 95乙醇提取物， 3- 氢化松苓酸 B(Trametenolic acid B)， 链脲佐菌素 (Streptozotocin， STZ) 购自 Sigma 公司， 临用时以 0.1mmolL-1 pH4.4 的柠檬酸 - 柠檬酸 钠。

21、缓冲液配成 2的溶液。 0094 主要仪器 0095 One Touch II血糖仪(LifeScan公司) ； UV-2201型分光光度计(日本岛津) ； DK-8 型电热恒温水浴槽 ( 上海精宏实验设备有限公司 ) ； BS224S 电子天平 ( 北京赛多利斯仪器 系统有限公司 )。胰岛素放射免疫分析药盒 ( 北京北方生物技术研究所 )。 0096 方法与结果 0097 将 70 只 C57BL/6 小鼠， 适应性喂养 1 周后， 随机取出 10 只作为正常组 (Normal)， 其余小鼠禁食12h， 于左下腹腔注射STZ60mg/kg复制2型糖尿病小鼠模型， STZ由0.1mmol/ L。

22、 柠檬酸缓冲盐临用前配制， 同时改喂高脂饲料。5d 后， 小鼠禁食 12h， 尾尖采血， 并测定空 腹血糖 (FBG) 11.1mmol/L 者为造模成功， 将小鼠随机分为 6 组， 每组 10 只， 分别为模型 组， 大白栓菌醇提物组， Trametenolic acid B 高低剂量组和二甲双胍组。各组动物灌胃给 药， 1 次 /d， 连续 14d， 正常对照组与模型组灌服同体积蒸馏水。末次给药后禁食 12h， 摘眼 球采血检测血清空腹血糖、 血清胰岛素 ( 放免分析 )。结果见表 6 ： 0098 表 6 大白栓菌提取物对 2 型糖尿病小鼠血糖、 胰岛素的影响 0099 0100 与模型组相比， *P 0.05，*P 0.01 0101 结果显示， 大白栓菌醇提物组， Trametenolic acid B 高低剂量组及二甲双胍组胰 岛素不同程度地高于模型组 (P 0.05 或 P 0.01)， 血糖与模型组比显著下降， 与模型组 比有显著性 (P 0.05 或 P 0.01)。 0102 结论 ： 大白栓菌醇提物及主要成分 3- 氢化松苓酸 B 有降血糖作用， 抑制 - 葡萄 糖苷酶活性是其机制之一， 可用于 II 型糖尿病防治。 说 明 书 CN 102028716 B 8 1/1 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102028716 B 9 。