黄酮类化合物在制备抗代谢性疾病药物中的用途.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102579422 B (45)授权公告日 2013.08.21 CN 102579422 B *CN102579422B* (21)申请号 201110001869.4 (22)申请日 2011.01.06 A61K 31/352(2006.01) A61P 5/50(2006.01) A61P 3/10(2006.01) A61P 3/06(2006.01) (73)专利权人 复旦大学 地址 200433 上海市杨浦区邯郸路 220 号 专利权人 中国科学院上海药物研究所 (72)发明人 侯爱君 王贺瑶 姬俊 吴金炜 胡晓 王洋 (74)专利代理机构 上海元一成知。

2、识产权代理事 务所 ( 普通合伙 ) 31268 代理人 吴桂琴 傅大煦等 . 黑桑的化学成分研究 .中草 药 .2005, 第 36 卷 ( 第 9 期 ),1296-1299. (54) 发明名称 黄酮类化合物在制备抗代谢性疾病药物中的 用途 (57) 摘要 本 发 明 属 医 药 技 术 领 域， 涉 及 式 （I）结 构 化 合 物 的 用 途，具 体 涉 及 所 述 化 合 物 (5aR,10aS)-5a,10a- 二 氢 -1,3,8,10a- 四 羟 基 -2,5a- 二 (3- 甲基 -2- 丁烯基 )-11H- 苯并 呋喃 3,2-b1 苯并吡喃 -11- 酮在治疗代谢 性疾。

3、病中的用途。该化合物从黑桑中分离得 到。实验证实， 该化合物具有很强的促进脂肪 细胞分化、 增加糖尿病小鼠的胰岛素敏感性、 降 低血糖和血脂的作用， 可进一步制成胰岛素增 敏剂、 降糖药物以及降脂药物应用于医药领域。 （I） (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 林冠 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 附图5页 (10)授权公告号 CN 102579422 B CN 102579422 B *CN102579422B* 1/1 页 2 1. 式 （I）的化合物 (5aR,10aS)-。

4、5a,10a- 二氢 -1,3,8,10a- 四羟基 -2,5a- 二 (3- 甲 基 -2- 丁烯基 )-11H- 苯并呋喃 3,2-b1 苯并吡喃 -11- 酮在制备治疗糖尿病药物中的 用途， 2. 按权利要求 1 的用途， 其特征在于所述的药物为胰岛素增敏剂。 3. 按权利要求 1 的用途， 其特征在于所述的药物为降血糖药物。 权 利 要 求 书 CN 102579422 B 2 1/5 页 3 黄酮类化合物在制备抗代谢性疾病药物中的用途 技术领域 0001 本发明属医药技术领域， 涉及黄酮类化合物新的药物用途， 具体涉及从黑桑中分 离得到的黄酮类化合物的用途。 尤其涉及化合物(5aR,。

5、10aS)-5a,10a-二氢-1,3,8,10a-四 羟基 -2,5a- 二 (3- 甲基 -2- 丁烯基 )-11H- 苯并呋喃 3, 2-b1 苯并吡喃 -11- 酮在提 高胰岛素敏感性、 治疗糖尿病和高脂血症方面的用途。 背景技术 0002 近年来， 由于生活水平的提高、 饮食结构的改变、 日趋紧张的生活节奏以及少动多 坐的生活方式等诸多因素， 全球糖尿病发病率增长迅速， 糖尿病已经成为继肿瘤、 心脑血管 疾病之后第三大严重威胁人类健康的疾病。据世界卫生组织预计， 到 2025 年， 全球成人糖 尿病患者人数将增至 3 亿。 0003 2型糖尿病占总糖尿病的90%， 其主要发病机制是胰。

6、岛素抵抗、 胰岛细胞功能衰 竭和胰岛素分泌障碍。2 型糖尿病病人多伴随有肥胖、 高甘油三脂或高胆固醇血症， 高血脂 是胰岛素抵抗和胰岛 细胞功能紊乱的主要原因之一。糖尿病可导致多种急性和慢性并 发症， 如酮症酸中毒、 心脑血管疾病、 肾病等， 对人类健康构成严重威胁。 目前常用的降糖药 有 ： 胰岛素、 磺脲类药物、 非磺脲类胰岛素促分泌剂、 双胍类降糖药、 胰岛素增敏剂等， 这几 类降糖药作用快、 疗效好、 但毒副作用强， 对肝、 肾等器官损害， 部分糖尿病人对胰岛素表现 明显的抗药性。糖尿病为终身性疾病， 需长期服药， 因此， 发现新的安全有效的抗糖尿病药 物是目前社会的迫切需要。 000。

7、4 脂肪组织是餐后葡萄糖吸收的主要部位， 分化的脂肪细胞能高水平表达葡萄糖载 体 4（Glut4） 。Glut4 是一种糖蛋白， 具有在胰岛素的作用下将葡萄糖转运至脂肪细胞内 的功能。增加 Glut4 蛋白的表达量能增加脂肪组织对葡萄糖的转运， 改善对胰岛素刺激的 葡萄糖摄取的抵抗。糖尿病患者机体中 Glut4 表达减少、 移位障碍， 是胰岛素抵抗的主要原 因， 因此， 寻找促进脂肪细胞分化、 提高 Glut4 表达、 增加胰岛素敏感性而促进葡萄糖转运 的药物对治疗 2 型糖尿病具有重要的临床意义。我国有丰富的天然药物资源和悠久的应用 中草药的历史， 并且各少数民族在与疾病的斗争中积累了宝贵的。

8、民族药， 这些都成为药物 发现的重要源泉。 0005 黑桑(Morus nigra Linn.)为桑科(Moraceae)桑属植物， 原产伊朗， 后传入我国， 现在新疆喀什、 阿克苏地区广泛栽培。黑桑在维吾尔医药中早已应用， 俗称 “药桑” ， 根皮和 茎枝具有降血压、 抗衰老、 消炎止痛等功效。 结构如式 （I） 所示的化合物桑根醇F(sanggenol F) 是从黑桑中分离得到的 （参考文献 ： 傅大煦等，黑桑的化学成分研究 ， 中草药， 2005, 36 (9), 1296-1299） 。另有文献报道， Fukai T. 等从桑属植物华桑 （Morus cathayana Hemsl.）。

9、 中首次分离得到如式 （I） 所示的化合物 sanggenol F（Phytochemistry, 1997, 47(2), 273-280） 。未见该化合物的生物活性研究报道。 发明内容 说 明 书 CN 102579422 B 3 2/5 页 4 0006 本 发 明 的 目 的 是 提 供 黄 酮 类 化 合 物 新 的 药 物 用 途， 尤 其 涉 及 化 合 物 (5aR,10aS)-5a,10a- 二氢 -1,3,8,10a- 四羟基 -2,5a- 二 (3- 甲基 -2- 丁烯基 )-11H- 苯并 呋喃3, 2-b1苯并吡喃-11-酮在提高胰岛素敏感性、 治疗糖尿病和高脂血症方。

10、面的用 途。 0007 本发明所述黄酮类化合物是从黑桑中分离得到的天然化合物。 该黄酮类化合物具 有如下式 （I） 的结构， 0008 0009 （I） 0010 本发明所述的式 （I）结构的化合物， 尤其是化合物 (5aR,10aS)-5a,10a- 二 氢 -1,3,8,10a- 四羟基 -2,5a- 二 (3- 甲基 -2- 丁烯基 )-11H- 苯并呋喃 3, 2-b1 苯并 吡喃-11-酮， 经实验证实， 其具有很强的促进脂肪细胞分化、 增加Glut4蛋白的表达量而增 加胰岛素敏感性和促进葡萄糖转运的作用， 并具有降低血脂的功效， 可进一步作为胰岛素 增敏剂、 降糖药物、 降脂药物应。

11、用于医药领域。 0011 本发明的黄酮类化合物是从黑桑中分离得到的天然化合物， 通过如下方法制备 ： 0012 将黑桑Morus nigra Linn. 的茎枝粉碎后， 用有机溶剂或 / 和水提取制备总提取 物， 所用的有机溶剂可采用醇类， 如乙醇， 甲醇等， 其中优选 95%（体积比） 乙醇， 将总提取物 溶于水后， 用石油醚萃取， 取石油醚相， 回收溶剂后干燥即得石油醚提取物 ； 0013 将石油醚提取物进行硅胶柱色谱分离 , 分别用石油醚、 石油醚 - 丙酮梯度洗脱， 其中石油醚 - 丙酮 4 1 洗脱部分进行硅胶柱色谱分离 , 以氯仿 - 乙醚 (5 1) 洗脱 , 然后再进行 ODS。

12、 柱色谱分离， 以甲醇 - 水梯度洗脱， 得到化合物 (5aR,10aS)-5a,10a- 二 氢 -1,3,8,10a- 四羟基 -2,5a- 二 (3- 甲基 -2- 丁烯基 )-11H- 苯并呋喃 3, 2-b1 苯并 吡喃 -11- 酮， 用波谱方法鉴定其结构， 如式 （ ） 的结构。 0014 本发明式 （ ） 的化合物进行了体外脂肪细胞分化、 葡萄糖转运和体内db/db小鼠糖 代谢、 脂代谢相关实验， 结果表明， 所述化合物 （I） 具有很强的促进脂肪细胞分化、 增强胰岛 素刺激的脂肪细胞葡萄糖转运而增加胰岛素敏感性的作用， 并具有降血脂的作用， 可作为 胰岛素增敏剂、 降血糖、 。

13、降血脂药物及应用于医药领域。 0015 进一步， 本发明式 （I）的化合物 (5aR,10aS)-5a,10a- 二氢 -1,3,8,10a- 四羟 基 -2,5a- 二 (3- 甲基 -2- 丁烯基 )-11H- 苯并呋喃 3, 2-b1 苯并吡喃 -11- 酮可作为 药物的有效成分， 制备抗代谢性疾病的药物。 所述的药物是胰岛素增敏剂， 降血糖药物或降 血脂药物。 附图说明 0016 图 1 为实施例 2 中本发明化合物 （I） 对 3T3-L1 前脂肪细胞分化作用的影响。 说 明 书 CN 102579422 B 4 3/5 页 5 0017 图 2 为实施例 3 中本发明化合物 （I）。

14、 对胰岛素刺激的葡萄糖转运的影响。 0018 图 3 为实施例 4 中本发明化合物 （I） 对 db/db 小鼠口服糖耐量 （OGTT） 的影响。 0019 图 4 为实施例 4 中本发明化合物 （I） 对 db/db 小鼠 OGTT 曲线下面积的影响。 0020 图 5 为实施例 5 中本发明化合物 （I） 对 db/db 小鼠胰岛素耐量 （ITT） 的影响。 0021 图 6 为实施例 5 中本发明化合物 （I） 对 db/db 小鼠 ITT 曲线下面积的影响。 0022 图 7 为实施例 6 中本发明化合物 （I） 对 db/db 小鼠脂肪组织基因 aP2、 C/EBP、 PPARg 和。

15、 Glut4 表达水平的影响。 0023 图8为实施例7中本发明化合物 （I） 对db/db小鼠血清甘油三酯 （TG） 、 胆固醇 （TC） 水平的影响。 0024 图 1 至图 8 中， * p 0.05 and * p 0.01（与对照组相比） 。 具体实施方式 0025 下面结合具体实施实例对本发明作进一步阐述， 但不限制本发明。 0026 实施例 1 从黑桑中提取本发明化合物 （I） 0027 （1） 提取 ： 黑桑干燥茎枝粉碎后得粗粉 2 公斤 , 95% 含水乙醇室温浸提三次， 分别 得到提取液 8 升、 6 升、 4 升， 合并提取液， 减压浓缩至干， 得到浸膏 204 克。将此。

16、浸膏溶于水 悬浮， 用石油醚萃取， 回收溶剂浓缩至干， 得石油醚提取物 47 克。 0028 （2）分离 ： 将石油醚提取物 47 克进行硅胶柱色谱分离 , 分别用石油醚、 石油 醚 - 丙酮 （30 1 20 1 10 1 9 1 6 1 4 1）梯度洗脱， 每个梯 度用量 3000 毫升， 收集流份， 得到组分 1 17 份。石油醚 - 丙酮 4 1 洗脱得到组分 15 17， 其中组分 15（800 毫克） 经硅胶柱色谱分离 , 氯仿 - 乙醚 （5 1） 洗脱 700 毫 升 , 得到组分 15.1 15.3 ； 将组分 15.2（450 毫克） 进行 ODS 柱色谱分离 , 甲醇 -。

17、 水 (738291) 梯度洗脱, 每个梯度用量500毫升， 收集流份， 甲醇-水 （82） 流份得到化合物 （I） (5aR,10aS)-5a,10a- 二氢 -1,3,8,10a- 四羟基 -2,5a- 二 (3- 甲 基 -2- 丁烯基 )-11H- 苯并呋喃 3, 2-b1 苯并吡喃 -11- 酮 201 毫克。 0029 （3） 化合物 （I） 的理化性质及光谱数据如下述 ： 分子式为 C25H26O7； 其性状为黄色无 定形粉末 ； 比旋光 ： a20D +165.6（c 1.03, Me2CO） ； 电子轰击质谱 （质荷比） ： 438 M+； 核磁共振氢谱 （500 MHz） 。

18、数据 （化学位移 ： ppm， 偶合常数 ： Hz, 溶剂 ： 氘代丙酮） ： 11.91 （1H， s， OH-5） ， 9.12（2H， br s， OH-7, 4） ， 7.35（1H， d，J = 8.2 Hz， H-6） ， 7.03（1H， br s， OH-3） ， 6.52（1H， dd，J = 1.6， 8.2 Hz， H-5） ， 6.40（1H， d，J = 1.6 Hz， H-3） ， 5.92 （1H， s， H-8） ， 5.25（1H， br t，J = 7.0 Hz， H-2） ， 5.19（1H， br t，J = 7.0 Hz， H-10） ， 3.23 （。

19、2H， br d，J = 7.0 Hz， H2-1） ， 3.12（1H， br dd，J = 8.8， 14.7 Hz， H-9a） ， 2.78 （1H， br dd，J = 6.1， 14.7 Hz， H-9b） ， 1.73, 1.623（各 3H， br s， H3-4 , 5） ， 1.615, 1.52 （各 3H， br s， H3-12, 13） ； 核磁共振碳谱 （100 MHz） 数据 （化学位移 ： ppm， 溶剂 ： 氘代丙 酮） ： d 188.2 s（C-4） ， 166.6 s（C-7） ， 162.7 s（C-5） ， 161.6 s（C-8a） ， 161.。

20、3 s（C-2） ， 161.2 s（C-4） ， 136.5 s（C-11） ， 131.4 s（C-3） ， 125.6 d（C-6） ， 123.3 d（C-2） ， 121.4 s （C-1） ， 118.7 d （C-10） ， 109.7 d （C-5） ， 109.1 s （C-6） ， 102.6 s （C-3） ， 100.2 s （C-4a） ， 99.5 d（C-3） ， 95.3 s（C-8） ， 91.8 s（C-2） ， 31.9 t（C-9） ， 25.8 q（C-13， 5） ， 21.5 t（C-1） ， 18.1 q（C-12） ， 17.8 q（C-4） 。

21、。 说 明 书 CN 102579422 B 5 4/5 页 6 0030 实施例 2 本发明化合物 （I） 对 3T3-L1 前脂肪细胞分化的影响 （油红染色法） 0031 将 3T3-L1 细胞接种于 48 孔板， 用含 10% NCS（小牛血清） 的高糖 H-DMEM 培养基 培养。2 天后改用含 125 M IBMX（3- 异丁基 -1- 甲基黄嘌呤） 、 1M Dex（地塞米松） 、 20 g/ml Insulin（胰岛素） 的 10% FBS（胎牛血清） 培养基诱导分化， 并加入不同浓度的化合 物 （I） 。分化 2 天后， 分化细胞的培养基改用含 20 g/ml Insulin、。

22、 10% 的 FBS 和不同浓度 化合物 （I） 的高糖 H-DMEM 培养基， 每 2 天换液一次， 连续换三次。细胞分化 8 天后弃培养 基， 用 PBS（磷酸盐缓冲盐水） 洗一次， 每孔小心加入 300 l 的 10% 福尔马林 （终浓度为 4% 甲醛） ， 37孵育 15 分钟。弃 10% 福尔马林， 用 PBS 洗两次， 吸干 PBS， 油红 O 染色 30 分钟， 弃上清， 加入 300 l 的 PBS， 拍照。结果证实本发明化合物 （I） 可剂量依赖性的增加 3T3-L1 细胞内脂滴的含量 , 能明显促进 3T3-L1 细胞向脂肪细胞分化 （如图 1 所示） 。 0032 实施例。

23、 3 本发明化合物 （I） 对已分化 3T3-L1 脂肪细胞葡萄糖转运的影响 0033 将 3T3-L1 细胞接种于 48 孔板， 分化培养方法与油红染色法相同， 细胞分化 8 天 后， 弃去培养基， 用无血清 DMEM 洗一遍， 1ml/ 孔， 加入含有 0.1% BSA （牛血清清蛋白） 的 DMEM， 300 l/ 孔。37温育 3-5h。弃去培养基， 用 HRP buffer 洗一遍， 加入 HRP buffer （提前37温育， 含有10 ng/ml 胰岛素） ， 200 l/孔， 37温育15min。 补加HRP buffer （含 有2-deoxy-d-1,2-3H-glucos。

24、e， 终浓度稀释2000倍） ， 100l/孔， 37温育10min。 弃去板 中所有液体， 用冰冷的 HRP buffer （300 l / 孔） 洗一遍， 吸掉， 加入 HRP buffer （400-500 l/ 孔） 再洗一遍， 弃去。加入 HRP buffer（含有 0.1-0.5% TritonX-100） ， 200l/ 孔， 过 夜裂解。加入闪烁液 800l/ 孔， 检测。结果证实本发明化合物 （I） 能够剂量依赖性促进胰 岛素刺激的葡萄糖转运而增强胰岛素的敏感性， 其浓度为 10 M 时， 作用略强于降糖药物 罗格列酮 （Rosiglitazone） （如图 2 所示） 。 。

25、0034 实施例 4 本发明化合物 （I） 对 db/db 糖尿病小鼠口服糖耐量 (OGTT) 的影响 0035 将 8 周龄的 db/db 小鼠按体重血糖分为两组 ： 对照组 （每天腹腔注射橄榄油， 0.1ml/ 只） 和给药组 （每天腹腔注射橄榄油溶解的化合物 （I） ， 5 mg/kg, 0.1ml/ 只） ， 每组 6 只， 给药 21 天， 第 22 天测口服糖耐量 （OGTT） ： 禁食 12h， 测对照组和给药组血糖、 体重， 根据 体重灌胃葡萄糖 （1g/kg） 记为 0 时， 灌胃后分别测 60、 90、 120、 150 min 血糖。结果显示， 给 与本发明化合物 （I）。

26、 的 db/db 小鼠经口灌服葡萄糖后血糖低于对照组， 曲线下面积明显小 于对照组， 说明本发明化合物 （I） 能提高 db/db 小鼠葡萄糖耐量 （如图 3 和图 4 所示） 。 0036 实施例 5 本发明化合物 （I） 对 db/db 糖尿病小鼠胰岛素耐量 (ITT) 的影响 0037 db/db 小鼠给药 18 天 （方法同上） ， 第 19 天测胰岛素耐量 （ITT） ： 禁食 6h， 测对照组 和给药组血糖、 体重， 根据体重腹腔注射胰岛素 （1U/kg） 记为 0 时， 灌胃后分别测 30、 60、 90、 120 min 血糖。结果显示， 给与本发明化合物 （I） 的 db/d。

27、b 小鼠在同样剂量胰岛素作用下， 血糖明显低于对照组， 说明本发明化合物 （I） 能提高 db/db 小鼠胰岛素敏感性 （如图 5 和图 6 所示） 。 0038 实施例 6 本发明化合物 （I） 对 db/db 糖尿病小鼠脂肪组织基因表达水平的影响 0039 db/db 小鼠给与本发明化合物 （I）三周后 （方法同上） ， 解剖， 取脂肪组织， 用 TRIzol法抽提mRNA。 100 mg组织加入1ml TRIzol， 在旋涡震荡器上混匀后加入约1/5体积 的氯仿， 充分混匀后室温静置5 min ； 然后于4 C， 12000 rpm 离心15 min ； 将上清液转入 1.5 ml 离心。

28、管中， 加入等体积的异丙醇， 混匀后室温静置 5 min ； 于 4 C， 12000 rpm 离心 说 明 书 CN 102579422 B 6 5/5 页 7 10 min ； 吸去上清液， 向沉淀中加入 2/5 体积的 70% 乙醇， 4 C， 12000 rpm 离心 15 min 洗涤沉淀 ； 吸去上清液， 沉淀于室温自然晾干后加入适量 RNase-free 的水， 充分溶解沉 淀 ； 取1-2 ml稀释， 测定OD 260， RNA浓度按以下公式计算 ： A26040稀释倍数 （g/l） 。 用 M-MLV 逆转录酶把 mRNA 逆转录成 cDNA， -80 C 冰箱保存待用。采用。

29、 SYBRPremix Ex Taq II（Takara） 对样品反转录产物进行实时荧光定量 PCR 分析。利用 ABI 7500 Fast 实 时荧光定量 PCR 仪进行测定， 同时做融解曲线判定引物质量， 以 -actin 为对照， 计算 aP2 （脂肪组织脂肪酸结合蛋白） 、 C/EBP（CAAT/ 增强子结合蛋白 ） 、 PPARg（过氧化物体增 殖剂活化受体 g） 和 Glut4（葡萄糖载体 4） 的表达水平。结果显示， 给与本发明化合物 （I） 的 db/db 小鼠脂肪细胞基因 aP2、 C/EBP、 PPARg 和 Glut4 的表达明显高于对照组， 说明本 发明化合物 （I） 。

30、能提高 db/db 小鼠脂肪细胞基因 aP2、 C/EBP、 PPAR 和 Glut4 的表达 , 在分子水平进一步证实本发明化合物 （I） 能促进脂肪细胞分化和葡萄糖的转运 （如图 7 所 示） 。 0040 实施例 7 本发明化合物 （I） 对 db/db 小鼠血清甘油三酯 （TG） 、 胆固醇 （TC） 水平的 影响 0041 db/db小鼠给与本发明化合物 （I） 三周后 （方法同上） ， 尾静脉取血， 离心， 吸取上层 血清， 用甘油磷酸氧化酶 - 过氧化物酶法测血清 TG 含量， 用胆固醇氧化酶 - 过氧化物酶法 测血清 TC 含量。结果证实， 本发明化合物 （I） 能降低 db/。

31、db 小鼠血清 TG、 TC 的含量 （如图 8 所示） 。 0042 上述实验结果表明， 本发明化合物 （I） 具有明显促进脂肪细胞分化、 提高 Glut4 的 表达、 增加胰岛素刺激的葡萄糖转运、 提高糖尿病小鼠胰岛素敏感性、 降低血糖、 降低血脂 的作用。因此， 本发明化合物 （I） 可作为胰岛素增敏剂、 降血糖药物和降血脂药物用于医药 领域。 说 明 书 CN 102579422 B 7 1/5 页 8 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102579422 B 8 2/5 页 9 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102579422 B 9 3/5 页 10 图 6 说 明 书 附 图 CN 102579422 B 10 4/5 页 11 图 7 说 明 书 附 图 CN 102579422 B 11 5/5 页 12 图 8 说 明 书 附 图 CN 102579422 B 12 。